苹果醋优势醋酸菌的分离筛选毕业论文.doc

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1、苹果醋优势醋酸菌的分离筛选 （甘肃农业大学食品科学与工程学院食品质量与安全专业，甘肃兰州，730070）摘要：将醋曲、腐烂苹果取少量用无菌生理盐水浸泡1小时后，进行扩大培养。从自然发酵的苹果醋液、醋曲液、腐败苹果液中称取10g醋样于盛有100mL基础培养基的500m L 三角瓶中，在30 、120r/m in条件下振荡培养48h。从中筛选出4株醋酸菌菌株对其产酸速度、耐酒度、酒精转化率等性能及果汁发酵产生果醋进行了研究。结果表明：1、4号菌株的产酸性能好，连续培养四代的稳定性好，适合苹果果醋的发酵关键词：醋酸菌；苹果醋；分离筛选。Apple cider vinegar advantage se

2、paration of acetic acid bacteria screeningLI Xiaohan（Major in Food Quality and Safety in the College of Food Science andEngineering of Gansu Agricultural University，Lanzhou Gansu，730070）Abstract：Liquid vinegar has been used to separate 2 strains screened out the optimum acetic acid bacteria, at the

3、same time of the two strains of acetic acid bacteria produce acid speed, wine degrees, temperature resistance, resistance to salt resistance ability, alcohol conversion rate and other performance and juice fermentation to produce fruit vinegar were studied. The results show that the two strains of a

4、cetic acid bacteria produce acid has a rapid speed, the optimal fermentation temperature is about 30 ; Alcohol conversion rate of acetic acid bacteria, 28 to 89. 0%, acetic acid bacteria 36 to 92.8%, acetic acid bacteria, 28 # 36 than acetic acid bacteria, more resistant to high concentrations of al

5、cohol; Juice by thirty-six, acetic acid bacteria purebred fermentation to produce apple vinegar, its total acid for 42.7 g/L. Keywords：Acetic acid bacteria Apple cider vinegar Separation of screening前言醋酸菌即醋酸细菌, 包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属。醋酸菌细胞多为小杆状, 直或稍弯, 少数近椭圆形, 单个, 成对或成链状排列。在有的种类中退化型是常见的, 如球状的、膨大的、细长的、成堆状的、弯曲

6、的、分枝或丝状的。革兰氏染色阴性, 不产生芽胞, 其中有的种类细胞具周生鞭毛, 如纹膜醋酸菌和胶膜醋酸菌, 它们都可形成长链, 并在液面上生长形成较厚的菌膜。另一些种类的醋酸菌, 仅具端生的鞭毛, 如黑色醋酸杆菌等。醋酸杆菌属在比较高的温度下（39-40度）可以发育，增殖的适温在30度以下。培养醋酸菌时，需要用含糖或酵母膏（维生素B）的培养基，在肉汤蛋白胨培养基上生长不良。大多数菌株可用六碳糖和甘油作为碳源，对甘露醇和葡萄糖酸盐很少能利用或不能利用，不分解乳糖、糊精和淀粉。 醋酸细菌是好氧菌。在中性和酸性( pH值为4. 5)条件下可将乙醇(酒精)氧化成醋酸。醋酸菌在发酵过程中, 代谢产物有C

7、O2和H2、醋酸、乳酸、丙酸、丁酸和戊酸、丙酮, 而且还有乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇。 醋酸细菌分布广泛, 在果园的土壤中、葡萄或其它浆果或酸败食物表面, 以及未灭菌的醋、果酒、啤酒、黄酒中都有生长。食醋作为我国传统的调味品，已有2000年的悠久历史。食醋具有一定的保健功能，对高血压、动脉硬化等疾病有着良好的疗效，还有增进食欲、开胃消化、降低糖尿病患者的血糖值、调节体液的酸碱平衡。同时能促进皮下腺激素的生成，促进血液的正常循环，滋润皮肤，降脂美容，抗衰老等功效。据统计，目前我国传统醋、保健醋、果醋的消费量人均为 0.91kg/年，而 日本人均为 7.88kg/年：美国人均为 6.51kg/年。我

8、国人均年消费量仅为日本的 19，美国17。由此可见，我国食醋的消费跟国外的差距较大，但目前果醋饮料在我国已开始流行，各酒店已开始流行以果醋代酒，倍受青睐2。果醋作为一种酸性发酵健身饮料, 含有丰富的维生素、无机盐、氨基酸和有机酸类， 且风味独特，因而深受广大消费者欢迎。在果醋生产中, 菌种的好坏是关键,醋酸菌的性能对产品质量、发酵效率有很大影响。所以，选育产酸快、耐酒度、耐高温、耐食盐、酒精转化率高、适合果醋生产的醋酸菌是一项十分重要的工作。只有优良的菌种才能在先进的生产工艺中生产出高质量的果醋。 我国应用于液体醋生产的醋酸菌主要是 A S1.41和沪酿1.01两种菌株2。本文主要研究从醋酸菌

9、中选出优势高产的菌种来为果醋的酿造打好基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 原料醋曲：购于陕西周至，食醋专用醋曲；苹果：富士，甘肃静宁；对照菌株为醋酸菌A S1.41(购于中国科学院微生物研究所)。1.1.2 试剂无水乙醇95%、葡萄糖、酵母膏、碳酸钙、琼脂、 磷酸二氢钾、硫酸镁、氢氧化钠、邻笨二钾酸氢钾、三氯化铁、酚酞、草酸铵、结晶紫、碘、碘化钾、番红等均为分析纯。1.1.3 仪器设备电热恒温水浴锅（HHS型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；电子分析天平（BS224S型，德国赛多利斯公司）；榨汁机（HA-3158型，上海华征仪器厂）；电热恒温培养箱（DH360AS型，北京科伟永兴仪器

10、有限公司）；手提式不锈钢蒸汽消毒器（YB280B型，上海三申医疗器械有限公司）；超净工作台（YJ-875型，苏州净化设备厂）；水浴恒温振荡器（SHZ-B型，上海一恒科学仪器有限公司）；酸度计（PHS-3CPH型，上海雷磁仪器厂）； TDL一40B离心机(上海安亭科学仪器厂)、KDM-2000型可调式电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）、电热鼓风干燥箱（上海恒科学仪器有限公司）显微镜、温度计、酒精计及微生物发酵实验所需的GG-17圆底烧瓶（蜀牛，2000mL）、三角瓶、培养皿、试管等常规器皿。1.2 方法 1.2.1 培养基基础培养基：葡萄糖1，酵母膏1，无水乙醇3vol，pH 4 .5；分离培养

11、基：基础培养基加入琼脂2，碳酸钙2，无水乙醇3v01；斜面保藏培养基：基础培养基加入琼脂2，碳酸钙1，无水乙醇3vol；产酸培养基：基础培养基经灭菌冷却后加入7vol无水乙醇，分装250mL三角瓶，每瓶50mL 。以上培养基均经过121灭菌20min；碳酸钙经过干热灭菌(165、30min)。培养基灭菌结束后，待温度降至70时加入碳酸钙和无水乙醇。1.2.2 分离筛选流程及操作步骤 1.2.2.1 分离筛选流程菌源制备扩大培养稀释分离菌株纯化斜面保藏产醋酸定性试验菌株初筛菌株复筛稳定性试验。1.2.2.2 操作步骤(1) 菌源制备 将醋曲、腐烂苹果取少量用无菌生理盐水浸泡1小时后，进行扩大培养

12、。(2) 扩大培养 从自然发酵的苹果醋液、醋曲液、腐败苹果液中称取10g醋样于盛有100mL基础培养基的500mL 三角瓶中，在30、120r/min条件下振荡培养48h。(3) 稀释分离 取1mL培养液于盛有9mL无菌水的试管中，依次用无菌水稀释，获得最终浓度为10-4、10-5、10-6 、l0-7 的培养液。分别取各浓度的稀释培养液0.2mL，涂布法接种于分离培养基上，在30培养72h。从培养基上挑取菌落形态一致，透明圈大，菌落丰厚且生长优势的单菌落。(4) 菌株纯化 将以上得到的单菌落在平板培养基上多次划线分离、培养、确认为形态一致的单菌落后，接种于斜面保藏培养基上，在30培养72h后

13、保藏于4冰箱内。(5) 革兰氏染色 将上述试管斜面上的菌株活化2次后革兰氏染色。(6) 产酸定性实验 将上述斜面保藏菌种分别接种于含3%vol乙醇的基础培养基中，在30浅层培养72h后，取5ml除去菌体的培养液，以2.5mol/l的NaOH溶液中和pH值至7.0，加入5%FeCl3溶液5到6滴，形成红褐色沉淀者为产醋酸细菌。(7) 菌株初筛 根据革兰氏染色和产酸定性试验得到的单菌落菌株，在平板培养基上进一步分离。根据其HC值（变色圈直径与菌落直径的比值）。(8) 菌种复筛 将初筛菌种分别接种于产酸培养基上，每株3次重复，在30静置培养120h后，测定酸度并比较。(9) 醋酸产量与酒精转化率的测

14、定醋酸产量测定：取2ml发酵液，加入50ml蒸馏水，3至5滴0.5%酚酞酒精溶液，用标定的0.1ml/lNaOH溶液滴定至浅粉色，由消耗的NaOH溶液的体积来计算样品中的含酸量。醋酸产量（g/L）=(CNaOHVx)/260x 酒精转化率=产酸量（g/l）/发酵液酒精含量（g/l）1.304 x100% x（10） 酒精耐受性试验 将酒度调至7度、含酸量为0.33的柑桔酒样为发酵样。在100mL柑桔酒样中分别接入各醋酸菌的液体试管菌种5，置于30摇床中振荡培养，每天抽样检测1次醋酸含量。QY7009菌株发酵至第8天的桔醋产品的醋酸含量达5.83，AS1.4l菌株发酵至第9天的桔醋产品的醋酸含量

15、达5.56、沪酿1.0l菌株发酵至第9天的桔醋产品的醋酸含量达5.32。产品风味均较纯正、浓郁。测得的各醋酸菌产酸曲线如图2。（11）菌种稳定性试验 1.2.3 苹果醋中醋酸发酵试验 把筛选出的菌种接入酒精含量相同的苹果酒7%中进行醋酸发酵试验，记录发酵结果。.1.2.4 测试方法 总酸测定：酸碱滴定法。 酒精度测定：蒸馏瓶法。 以蒸馏法去除样品中的不挥发物质,利用酒精计和温度计直接读取酒精度和温度的示值，按GB/T 15038-94中的附录B(补充件)加以温度校正，求得20时乙醇的体积百分数,即酒精度。2. 结果与分析2.1 菌株分离筛选结果2.1.1 革兰氏染色食醋醋曲经稀释分离与反复划线

16、后确定出4株形态一致的单菌落，斜面保存活化后进行革兰氏染色，染色结果： 革兰氏染色表现为阴性。醋酸菌多成小杆状，直或稍弯，少数近椭圆形，单个，成对或成链状排列。1，4号染色 2，3号染色 2.1.2 产酸定性实验结果按照产酸定性试验操作规程操作加入5%FeCl3溶液后，四个菌种溶液中不同程度都有红褐色沉淀产生。1，4号菌株产酸最快，初步确定这4个菌株均为产醋酸菌株。2.1.3 菌株初筛结果从食醋醋曲中分离筛选纯化后获得了4株单菌落菌株，HC值（透明圈直径与变色圈直径的比值）如下表所示：表1 菌株分离筛选结果菌株编号透明圈直径(mm）变色圈直径(mm)HC值A13.51.52.34A21.50.

17、91.67A37.01.83.89A46.53.22.04从表1中选取4株HC值较大，透明圈较明显，生长较好的菌种：A2、A4、A6、A8来进行复筛。上表中数值为每菌株稀释平板同等条件培养下取三组数值的平均值，从HC值来看A3生长旺盛，其次是A1、A4、A2。2.1.4 菌种复筛 对以上筛选出的4个菌株分别接种于7%酒精含量的产酸培养基上，每株3次重复，在32静置培养120h后，测定酸度并与已知菌种进行比较。 表2 不同醋酸菌的产酸量 菌株号 产酸量(g/L) 5%显著水平1%极显著水平 A140.79 A224.48 A3待添加的隐藏文字内容226.90 A441.19 A S1.4159.

18、63图1： 不同醋酸菌的酒精转化率图 由上表可见，A S1.41产酸率最高；2号与3号菌株产酸率较低，是A S1.41产酸率的一半；1号与4号菌株产酸率相比2、3号菌株高，但比A S1.41号菌株低20个百分点。2.3 酒精耐受性试验结果：把4个筛选菌株按相同量及浓度分别接种于酒精度为：6%、7%、8%的产酸培养基中32静置培养120h后，测定酸度，结果如下：表3:不同酒精度下菌株的产酸量 编号浓度1234 6%38.2221.3625.7040.21 7%40.7924.4826.9041.19 8%45.5323.4526.3444.03 由图表可以看出，2、3号菌株在酒精度7%的条件下生

19、长得最好；1、4号菌株的产酸量随酒精度的升高而升高，最适合产酸的酒精度是8%。2.4 稳定性培养 表3：连续培养四代后的稳定性 菌 株 产酸量(g/l) 酒精转化率%第一代 136.2339.69 222.1424.25 332.7835.91 436.9840.51第二代 1 36.0039.44 244.4248.66 341.4045.35 434.0237.27第三代 132.4035.49 242.1246.14 337.6241.21 433.93372第四代 140.92448 239.35431 337.78414 441.00449由表3可以看出2，3号菌株在第二代的产酸和酒

20、精转化率达到最高值，在第三代和第四代略有下降；在第三代和第四代有下降趋势；1，4号菌株从第二代有下降趋势，在第四代回升。表5 第四代菌种斜面生长情况 菌种编号 生长状况 菌体形态1针状大点、菌苔丰厚、规则、成链多、成链状、2针状大点、菌苔丰厚规则、成链多、成链状3针状小点、菌苔较薄不规则、成链少、成链状4针状大点、菌苔丰厚规则、成链多、成链状 2.2表6 苹果醋酒精发酵过程中酒精度、酸度变化 菌 株 时间（h）24487296120 1 产酸量3.246.48912.9613.2 酒精度6.95.95.5 2 产酸量2.88911.1615.8416.17 酒精度7.84.65.5 3 产酸量

21、3.6911.5216.216.50 酒精度6.04.64.44.2 4 产酸量2.888.6412.615.8416.83 酒精度6.15.63.43.2对照 2.6 所得苹果醋产品与已知菌种比较 。将酒度调至7度、含酸量为0.33的柑桔酒样为发酵样。在100mL柑桔酒样中分别接入各醋酸菌的液体试管菌种5，置于3O摇床中振荡培养，每天抽样检测1次醋酸含量。QY7009菌株发酵至第8天的桔醋产品的醋酸含量达5.83，AS1.4l菌株发酵至第9天的桔醋产品的醋酸含量达5.56、沪酿1.0l菌株发酵至第9天的桔醋产品的醋酸含量达5.32。产品风味均较纯正、浓郁。测得的各醋酸菌产酸曲线如图2。实验规

22、模：500mL三角瓶10个，每瓶装液量200mL，共计2000mL。醋酸种子培养: 醋酸菌36号纯种，接入10mL液体试管30e培养24h，再接入液体三角瓶，30e静止培养酸度达1%1.5%即可待用。酵母种子培养：将葡萄酒酵母接入10mL(10bBx)麦芽汁液体试管，30e培养24h，再接入液体三角瓶，30e静止培养1 2d即可待用。工艺路线：浓缩苹果汁y稀释果汁(10.Bx)y灭菌(0.1MPa，30min)酵母种子酒精发酵y灭菌(73e10mim)醋酸种子醋酸发酵y苹果生醋y加温80ey后熟y过滤杀菌y成品醋。试验操作 4：灭菌后的稀果汁(10bBx)接入酵母种子10%，32e静止酒精发酵

23、45d，升温73e杀菌10min，再冷却至30e，接入醋酸种子5%，30e静止醋酸发酵12d，加温，后熟1个月，过滤杀菌得成品醋。苹果汁发酵生产苹果醋主要理化指标：总酸(以醋酸计)42.7g /L，还原糖(以葡萄糖计)10.8g/L，氨基酸氮(以氮计)0.9g/L。结论1 由革兰氏染色，产酸定性实验和初筛结果初步确定这4个菌株均为产醋酸菌株。2 由复筛，究竟耐受性试验及连续培养四代后的稳定性的实验可以确定1、4号醋酸菌稳定性良好，可作为苹果醋酿造的菌株。参考文献1 周帼萍，汪芳安，高冰.醋酸菌筛选培养基的优化和优良醋酸菌分离的研究J.中国酿造，2004（6）：18.2 鲁海波，姚跃飞等. 柑桔

24、醋醋酸菌的筛选研究J.中国酿造，2004（6）：10-12.3 王亚利，洪厚胜等.耐高温高酸醋酸菌优化研究进展J.中国调味品，2008（3）：23-27.4 堐榜琴，张建国等.苹果醋的保健功能及科学依据J.中国调味品，2012，37（10）：12-14.5 张赞，梁美霞等.优势醋酸菌株QA-9号选育及其初步鉴定J.中国酿造，2010（3）：46-48.6 何志刚，李维新等.枇杷酒醋化过程醋酸菌的生长、产酸及耗氧的关系J.食品与发酵工业，2008,34(12):22-25.7 堐榜琴，肖国辉等.我国苹果醋生产过程中亟待解决的问题J.中国调味品.2012,37(1):5-10.8 张忠明.高产醋酸

25、菌的筛选及其形态生化特征研究J.甘肃农业大学学报.2006(6):83-86.9 王芳，曾利平.苹果醋高产醋酸菌的筛选J.实验报告与理论研究.2010,13(1):10-11.10 魏长庆，王海庆等.葡萄果醋发酵用醋酸菌的分离及鉴定J.中国酿造.2010(4):42-44.11 陈伟，陈义伦，马明等.选育优质醋酸菌酿造苹果醋J.中国调味品.2003(3)致谢四年的读书生活在这个季节即将划上一个句号，而于我的人生却只是一个逗号，我将面对又一次征程的开始。四年的求学生涯在师长、亲友的大力支持下，走得辛苦却也收获满囊，在论文即将付梓之际，思绪万千，心情久久不能平静。伟人、名人为我所崇拜，可是我更急切地要把我的敬意和赞美献给一位平凡的人，我的导师。本次毕业论文是在师希雄老师和张霁红老师的共同指导下设计并完成的。从论文的选题、实验到论文批改的整个过称都倾注了指导老师大量的心血，老师的施教方法、为师风范以及治学的态度，都使我终生受益。在此，谨向师希雄老师和张霁红老师表示由衷的感谢和敬意。另外，值此毕业之际，向所有关心、支持和帮助过我的老师和同学致以最诚挚的谢意！