胰蛋白酶对酸奶水解度及酪蛋白磷酸肽生成量的影响—毕业论文.doc
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1、摘 要本实验以脱脂乳粉为原料,首先采用德氏乳杆菌保加利亚亚种(L18)和嗜热链球菌(St)制备酸奶,以水解度为指标探讨胰蛋白酶水解酸奶的最佳酶解条件及在该条件下CPPs的生成量,其中CPPs的制备和含量的测定分别采用胰蛋白酶水解法和分光光度法。胰蛋白酶水解纯奶和酸奶的最佳酶解条件为:蛋白溶液浓度3%、pH8.0、在37,酶:底物=1.00:100,时间为3h,在该条件下纯奶的水解度为20.40%,制备CPPs的量为每克蛋白质146mg,酸奶的水解度为27.55%,制备CPPs的量为每克蛋白质207mg。此时N/有机P比值为8.20。关键字:酪蛋白磷酸肽;水解度;德氏乳杆菌保加利亚亚种;嗜热链球
2、菌Abstract In this study,firstly, skim milk powder was used to prepare yogurt by mixing fermentation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus.The degree hydrolysis experiments were found to discuss the optimum conditions of hydrolysis for pure milk and yogurt by t
3、rypsin as well as it had effect on the production of CPPs under optimum conditions. CPPs were prepared by the methods of calcium-ethanol precipitation and the contents were determined by spectrophotometry. The hydrolysis experiments demonstrated the best conditions for hydrolysis of pure milk and yo
4、gurt by trypsin. The conditions inculded the ratio of enzyme to substrate which was 1:100, the reaction time which was 3 hours, and the hydrolysis reaction which occurred at 37 and pH 8.0. Under this conditions the degree of hydrolysis respectively in pure milk and yogurt were 20.40%, 27.55%, and th
5、e yield of CPPs were 146mg/g, 207mg/g. Key Words: Casein phosphopeptides;Lactobacillus delbrueckii subsp Bulgaricus;Streptococcus thermophilus;The degree of hydrolysis目 录 1 引言11.1 酸奶11.1.1 酸奶的定义11.1.2 酸奶的营养价值11.1.3 酸奶的保健功能21.2 乳源生物活性肽21.3 酸奶中的CPPs31.4 研究意义和主要内容32 材料与方法42.1试验材料、主要试剂和仪器42.1.1 试验原料42.1
6、.2 试验菌种42.1.3 培养基42.1.4 主要化学试剂42.1.5 试验仪器42.2 试验方法42.2.1 菌种活化42.2.2 发酵剂的制备42.2.3 酸奶的发酵工艺52.2.4 胰蛋白酶水解样品制备CPPs52.3 磷(P)含量的测定52.3.1 无机磷含量的测定52.3.2 总磷含量的测定52.3.3 P的标准曲线的绘制52.3.4 有机磷的计算62.3.5 r(NP)的计算63 结果与分析63.1 时间对酸奶和纯牛奶水解度的影响63.2 酶:底物对水解度的影响73.2.1 酶:底物对纯奶水解度的影响73.2.2 酶:底物对酸奶水解度的影响83.3 P含量的标准曲线93.4 酸奶
7、和纯牛奶来源的CPP的氮磷比104 结论10致谢11参考文献.12作者简介131 引言1.1 酸奶1.1.1 酸奶的定义酸奶是指原料乳在特定的微生物的作用下,通过乳酸菌发酵或由乳酸菌、酵母菌的共同发酵制成的酸性乳制品。在保质期内,该类产品中的特征菌必须大量存活,并能继续存活,并且必须保持微生物的活性,不得含有任何致病菌。从某种意义上讲,乳的发酵是乳成分的预消化,如乳糖、蛋白质和脂肪的降解,同时可溶性钙和磷的含量提高,并合成一些B族维生素,因此,与普通乳相比,其营养价值提高1。国际乳业联盟(IDF)专家组在1967年年会上对发酵乳作出如下定义:所谓发酵乳是指以(全脂乳、部分脱脂乳、完全脱脂乳、浓
8、缩乳、部分脱脂乳粉或全脂脱脂乳粉还原乳)经均质(或不均质),杀菌(或灭菌)后,加特定的微生物发酵剂制成的一类产品2。1.1.2 酸奶的营养价值1.1.2.1 酸奶中的碳水化合物容易消化牛乳中的碳水化合物主要是乳糖, 约占4.5% , 制成酸奶后大约有30%的乳糖变为乳酸和其它有机酸如苯甲酸、柠檬酸、醋酸等。生成的酸味物质有以下功能:提高了乳的保存性;增加乳的滋味;能抑制碱性细菌的生长和繁殖;促进胃肠蠕动,刺激胃和胰腺分泌胃液和胰液;提高人体的消化功能;大大提高机体对Ca 、P 、Fe 的吸收利用率。此外,乳糖中的部分分解成葡萄糖和半乳糖, 除了供给能源外, 半乳糖也可参与脑苷脂和神经物质的合成
9、, 有助于婴幼儿脑和神经系统的发育。1.1.2.2 酸奶中的蛋白质易于吸收在发酵的过程中,乳酸菌发酵产生蛋白质水解酶,使原料乳中部分蛋白质水解,从而使酸奶中含有比原料乳更多的肽和比例更合理的人体所需的必需氨基酸,从而使酸奶中的蛋白质更易被机体所利用,其中酸奶中游离氨基酸的浓度约比牛奶增加4倍。另外,发酵产生的乳酸使乳蛋白质形成微细的凝块,使酸奶中的蛋白质比牛乳中的蛋白质在肠道中释放速度更慢、更稳定,这样就使蛋白质分解酶在肠道中充分发挥作用,使蛋白质更易被人体消化吸收。1.1.2.3 胆固醇与脂肪的代谢优于牛乳酸奶中的脂肪含量约含3%, 其脂肪球小,易于消化;低级脂肪酸含量较高,容易代谢;必须脂
10、肪酸含量较多;其中乳脂中的磷脂能促进脂肪乳化,调节胆固醇浓度。另外,酸奶中乳酸菌脂酶能作用于脂类物质,不仅产生了少量的游离脂肪酸,而且其脂肪的构造也发生了变化, 易于消化吸收。1.1.2.4 维生素和矿物质含量丰富发酵后,酸奶中含有丰富的可溶性维生素(B族维生素,其中包括维生素B1、B2、B6)和少量的脂溶性维生素。乳酸还可以与乳中的Ca、P和Fe等矿物质形成易溶于水的乳酸盐,大大提高了Ca、P和Fe等矿物元素的吸收利用率。酸奶可补充人体缺少的多种维生素和矿物元素。1.1.3 酸奶的保健功能作为世界公认的保健食品,酸奶对人体有多方面的保健功能。酸奶的保健功效源于大量乳酸菌和它的代谢产物,以及发
11、酵过程中产生的活性物质。其营养保健功效主要表现在以下几个方面:(1)缓解“乳糖不耐受症”。 (2) 调节人体肠道中的微生物菌群平衡,抑制肠道有害菌的生长。 (3) 降低胆固醇水平。 (4) 合成某些抗菌素,提高人体的抗病能力。 (5) 预防白内障。研究表明,酸奶可以预防白内障。(6) 能起到美容、明目、固齿和健发的作用。 因此可以说酸奶是仅次于母乳的营养食品。1.2 乳源生物活性肽乳源生物活性肽是指与乳中某些蛋白质肽链的某些片段相同或相似,在乳中固有或在乳蛋白降解过程中产生的具有生物活性的肽类。牛乳中含有大量的蛋白质,具有丰富全价的营养成分,被称为“白色血液”,其中蛋白质含量约为3.3%3.5
12、%,其中大约80%为酪蛋白 (26g/L),其余的20%为乳清蛋白(6g/L),是生物活性肽的重要来源3。Mellander(1947)4等人从酪蛋白中首次获得了酪蛋白磷酸肽,1979年,Brantl等从喂食牛乳酪蛋白的豚鼠回肠中发现具有阿片样活性的短肽-酪啡肽-7(-casomorphin-7)5,这些发现使得外源活性肽的研究备受关注,并且渐渐成为乳品行业的关注热点。已有越来越多的研究表明乳蛋白质经酶水解会产生多种对人体有生理调节功能的活性成分。迄今为止,通过不同蛋白酶水解牛乳蛋白质得到的生物活性肽及其生理功能见表1。表1 来自牛乳蛋白质的生物活性肽及其生理功能6,7生物活性肽蛋白前体生理功
13、能抗微生物肽乳铁蛋白、酪蛋白抗微生物生长抗血管紧张肽酪蛋白具有ACE抑制活性、防治高血压抗血栓形成肽 酪蛋白抑制血小板聚集酪蛋白磷酸肽酪蛋白促进钙的吸收和利用免疫活性肽酪蛋白激活免疫系统鸦片肽酪蛋白类吗啡性质在这其中研究最多的是酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides),简称CPPs,CPPs主要通过蛋白酶水解牛乳酪蛋白而得到的,CPPs的核心部位是成串的磷酸丝氨酸和谷氨酸簇,其基本结构为:-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-8,近年来发展起微生物发酵法制备CPPs,即直接利用微生物发酵过程产生的蛋白酶(复合)降解蛋白质,可使蛋白质的水解度提高,从而相对地降低酶法
14、生产活性肽的成本。国外用微生物蛋白酶对植物蛋白和动物蛋白进行试验研究,发现微生物蛋白酶大多具有溶解性好、活力高、专一性强,来源充足和使用方便等显著优点,因此利用微生物蛋白酶是该研究领域及今后研发的主要方向。1.3 酸奶中的CPPs 近几年来国外学者发现天然发酵乳制品中有CPPs的存在,主要由发酵乳制品(发酵乳和干酪)加工过程中,由于外源发酵微生物的加入使乳蛋白降解解产生一些生物活性肽,包括CPPs,这些肽的存在会促进发酵乳制品的加工和消费。国外有报道发酵乳品中存在由乳酸菌的发酵作用而产生的多肽类物质9Kawahara等(2005)对酸奶和纯牛奶用胰蛋白酶处理后得出CPP的量分别为171mg/g
15、,146mg/g,可以看出酸奶中CPP的量明显高于纯奶中10。1.4 研究意义和主要内容 随着人们生活水平的提高,人们不光关注酸奶的营养价值,更加关注酸奶中的活性成分及其保健功能。为进一步明确酸奶和纯牛奶对胰蛋白酶的敏感性及在肠道中可能产生的CPPs水平,本文主要探讨胰蛋白酶对酸奶和纯牛奶CPPs产量的影响,其次用胰蛋白酶水解酸奶和纯牛奶,以水解度为指标,比较两者CPPs的生成量。2 材料与方法2.1.1 试验原料脱脂乳粉:新西兰进口。市售CPPs:明治制果2.1.2 试验菌种德氏乳杆菌保加利亚亚种(L18):内蒙古农业大学微生物实验室提供嗜热链球菌(St):内蒙古农业大学微生物实验室提供2.
16、1.3 培养基2.1.3.1 乳酸菌保存培养基脱脂乳培养基:将脱脂乳粉按照12%比例复原为脱脂乳,再经过115,10min灭菌制得2.1.4 主要化学试剂 无水乙醇,氢氧化钠,盐酸,三氯乙酸,氯化钙,酶制剂:胰蛋白酶(1:250)美国Sigma公司2.1.5 试验仪器名称 型号 产地冷冻离心机 GL-10M 湖南凯达科学仪器有限公司恒温水浴锅 JC-HH-S26 济南精诚实验仪器有限公司紫外可见分光光度计 TU-1810 北京普析通用仪器有限公司超净工作台 SW-CJ-2ED 苏州安泰空气技术有限司显微镜 CX31 日本奥林巴斯恒温培养箱 DHP-9082 上海一恒科技有限公司2.2 试验方法
17、2.2.1 菌种活化将80保藏的纯菌种解冻后,用接种环蘸取少许接种到5mL脱脂乳培养基中,43培养至凝乳,活化34代。L18革兰氏染色镜检,阳性,呈单个体长杆状。St革兰氏染色镜检,阳性,呈链球状。2.2.2 发酵剂的制备将活化好的菌种分别接种到100mL的脱脂乳中,接种量为3%,43培养至凝乳,取出后置于4冰箱中保存备用。2.2.3 酸奶的发酵工艺12%脱脂乳巴氏杀菌降温接种保温发酵冷却成熟成品检验2.2.4 胰蛋白酶水解样品制备CPPs10样品中蛋白质的浓度为3%,加入适量胰蛋白酶(酶:底物=1.00:100),用3N NaOH调pH为8.0,在温度为37进行水解,水解的过程要保持pH为8
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