油菜花粉蛋白提取工艺研究毕业论文.doc

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1、油菜花粉蛋白提取工艺研究 学生：XXX（学号） 导师：XXX（导师级别）摘要：本试验主要进行油菜花粉蛋白提取工艺的研究。以破壁花粉为试材，探讨提取温度、提取时间、pH值和料液比对花粉蛋白提取率的影响，在单因素试验的基础上，通过正交试验确定最佳提取工艺条件。结果表明：提取温度对花粉蛋白提取率的影响最大，其次为提取时间、pH值，料液比的影响最小。油菜花粉蛋白提取的最优条件为1:25的料液比，70的水浴条件下，pH值为11，提取时间75min，此条件下油菜花粉蛋白的提取率为60.11。关键词：油菜花粉蛋白；破壁花粉；提取率The study of the Rape pollen protein ex

2、traction processChun ying Tang (2008113387) , Directed by: Hai yan Yan (Senior Experimental Division)Abstract：This experiment mainly working on rape pollen protein extraction technology research. We take was test materials , study the influence temperature, time, pH value and the ratio of solid-liqu

3、id on pollen protein, extraction rate, on the single factor experiment,we determine the optimal extraction condition.The results show that : the effect of temperature on pollen protein extraction rate is mostly affected, followed by the pH value, solid-liquid ratio , extraction time minimally affect

4、ed. the optimal conditions of the ratio of solid-liquid is 1:20, the water bath temperature is 70 centigrade, the pH value is 11, the extraction time is 75 min, this condition of rape pollen protein, extraction rate is 60.11percent. Keywords: Rape pollen proteins; cracked - cell pollen; extraction r

5、ate 1前言油菜是我国五个种植面积上亿亩的农作物之一，是世界最大的油菜生产国，也是我国的主要油料作物。随着人们生活水平的提高和产品数量的相对增多，人们对商品品质的要求越来越高，尤其是营养品质和卫生品质，成为人们关注的热点。但是由于油菜蜂花粉所具有的特殊的青腥味不大为人们所接受，所以直接作为商品出售，不受消费者的青睐，造成大量陈放。 目前，我国大部分商品蜂花粉主要来自于粉蜜源植物，如油菜、紫云英、玉米、向日葵、荞麦等。油菜蜂花粉中含有大量的蛋白质、游离氨基酸、糖类、维生素、脂类、微量元素、酶和激素等多种营养物质1、2。花粉是植物雄性配子体，存在于雄性花粉囊内，它不仅具有低脂肪、高蛋白的特点。而

6、且含有人体生存所需的多种营养物质，如多种维生素、酶、微量元素、生物活性物质等，人们称花粉为营养素的浓缩体，完全的营养源，植物高度浓缩的“微型营养库”，因此被誉为“完全营养品”3、4。花粉又是植物的精子，它孕育着生命，营养最丰富，在植物里是最好的东西。花粉类的食物适合男女老幼食用。 我国是世界上食用花粉最早的国家，远在两千多年前楚国大诗人屈原在离骚诗篇中就写道：“朝食木兰之坠露，夕安秋菊之落英”。以后历代许多著作中都有大量记载花粉食品的制作方法和食用后的保健效果。花粉作为治疗疾病的药物，在两千年前我国最早的一部药物学专著神农本草经就有记述香蒲植物的花粉，古称蒲黄有“甘平无毒，久服轻身，益气力延年

7、”和“凉血止血，活血消淤”等功用。花粉制品在国外深受消费者喜爱，已风靡于世，许多国家用花粉制剂洽疗阳萎、贫血、动脉硬化、前列腺炎等症卓有疗效。近几年来，我国花粉制品生产也有较大发展，已有多类品种的花粉产品投放市场，满足人们的需要。花粉含有丰富的功能性物质（包括蛋白质、维生素、微量元素、黄酮类化合物），这些物质协同作用于机体，调节机体的多种功能，平衡体内营养，增强新陈代谢，防止毛细血管通透性的障碍。花粉还能促进内分泌腺的发育，有提高和调节内分泌腺分泌功能，因此对由内分泌功能紊乱引起的疾病起到了治疗作用。前列腺的发育和生理状态的维持依赖于体内有足够的雄性激素，尤其是雄性激素和雌性激素的平衡，而前列

8、腺肥大的发病机理与内分泌系统调节和控制失调有关，松花粉中所含谷氨酸、脯氨酸等20多种氨基酸，可以改善前列腺组织的血液循环，减轻水肿，缓解前列腺肥大引起的尿道梗阻。现代药理实验研究表明，花粉具有降血脂5、抗辐射6、增强机体免疫功能7、保护肝脏、治疗前列腺增生以及抗衰老等作用8、9。油菜子颗粒小，含有40%45油脂和2025蛋白质。在植物蛋白质中，油菜子蛋白的营养价值最高，没有限制性氨基酸，特别是含有许多在大豆中含量不足的含硫氨基酸。该种蛋白质制品具有很好的保水性与持油性，因而可应用于红肠等畜肉制品的加工。此外，经分离得到的变性少的蛋白质，其乳化性、发泡性、凝胶形成性均很好。 蛋白质是人类生命活动

9、的重要物质基础。随着世界人口的不断增长，蛋白质供给出现了严重不足。据联合国粮农组织资料，成年人每天摄取蛋白质应在75g以上，而世界人均水平才达到68.8g。以我国为例，我国医学科学院卫生研究所认为我国人民的营养标准每人每天要摄取蛋白质72g，美国在100g以上，日本90g 以上，而我国目前平均仅60g10。为了解决蛋白质供给不足这一问题，世界各国尤其是不发达国家和地区，积极采取措施，试图从可以得到的食物中获得有营养和廉价的蛋白质。在世界范围的蛋白质资源供给中，大部分为植物蛋白，占蛋白质总量的70%，而动物蛋白仅占30%。另外，由于植物蛋白具有经济性、营养性、功能性等优点，其在建立健康的饮食结构

10、方面所起的作用也越来越受人们重视。食品中的蛋白质具有3个方面的特性，既营养性、加工特性及有益于人体健康的功能特性11。植物性蛋白质，特别是油料蛋白质具有良好的加工特性，既可以单独制成食品，也可以与蔬菜或肉类等相组合加工成各种各样的食品。他们在加工过程中，赋予制品保水性和保型性，防止加热调理收缩变形，使制品有较好的物性品质。植物蛋白能够提供营养而廉价的蛋白质，世界各国正积极开发植物蛋白资源以解决蛋白质资源不足的现状。目前对蛋白资源的开发途径不外乎两种：采用高新技术对植物蛋白资源的应用进行研究；采用高新技术对传统产品进行改造。蛋白饮料、蛋白浓缩物之类的蛋白制品在欧美等国并不受欢迎。本研究采用碱溶酸

11、沉的方法提取花粉蛋白。碱溶之后调至等电点，使蛋白质沉淀出来，它是利用蛋白质在其等电点时溶解度最小来分离具有不同等电点蛋白质的方法。蛋白质是两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和数量因PH不同而变化，蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀，因此，在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。2材料与方法2.1试验材料油菜花粉：（2012年3月购于金马市场三方蜂业）2.2主要试验仪器与试剂2.2.1 试验仪器表1 试验仪器Table 1 The test apparatus仪器名称型号生产厂家电子天平EL3002梅特勒托利仪器有限公司分光光度计Uvmini-124

12、0Shimadzu Suzhou Instruments Mfg低速大容量多管离心机LXJ-IIB上海安亭科学仪器厂制造烘箱北京航鹏普瑞技术开发中心恒温水浴器HSQ-3上海智城分析仪器制造有限公司pH计PHS-3C上海精密科学仪器有限公司2.2.2 试验试剂氢氧化钠颗粒、盐酸（分析纯）、硼酸（化学纯）、0.2溴甲酚绿、95乙醇溶液、0.2甲基红乙醇溶液、浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、邻苯二甲酸氢钾（优级纯）、磷酸二氢钾（优级纯）、无水磷酸氢二钠（优级纯）、硼砂2.2.3试剂的配制4的硼酸吸收液：20g硼酸（化学纯）溶解于500mL热水中，摇匀备用。甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：5份0.2溴甲酚绿95乙

13、醇溶液与1份0.2甲基红乙醇溶液混合。40氢氧化钠溶液：称60g氢氧化钠固体颗粒，用蒸馏水溶解并定容至100mL。pH=4.02的标准缓冲溶液（20）：称取优级纯邻苯二甲酸氢钾2.53g溶于不含二氧化碳的蒸馏水中，稀释至250mL。pH=6.88的标准缓冲溶液（20）：称取优级纯磷酸二氢钾0.8475g和优级纯无水磷酸氢二钠0.8825g溶于不含二氧化碳的蒸馏水中，稀释至250mL。pH=9.22的标准缓冲溶液（20）：称取硼砂0.95g溶于不含二氧化碳的蒸馏水中，稀释至250mL。2.3试验方案2.3.1工艺流程 破壁花粉碱溶(料液比为1:20) 调节pH值为1170 水浴加热75 min离

14、心分离（20min，4200r/min）上清液调节pH值至等电点离心分离（20min，4200r/min）沉淀干燥油菜花粉蛋白粗品2.3.2蛋白质提取率的计算 蛋白质提取率=提取物中蛋白质的含量/原料中蛋白质的含量1002.3.3单因素和正交试验设计分别选取料液比（W/V）1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，提取时间（min）30、45、60、75、90，pH值 8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，提取温度（） 30、40、50、60、70，这四个因素不同水平，考察各单因素对油菜花粉蛋白提取率的影响。根据单因素试验结果，选取料液比、提取温度、pH值和提取时间四因素三水平

15、L9(34)正交表做正交试验。各因素水平的取值如表2所示。 表2 因素水平表Table 2 The levels of factors table水平A温度（）BpH值C时间（min）D料液比（W/V）1501045152601160203701275252.4油菜花粉的破壁2.4.1 温差破壁法12、13的原理 由于花粉在低温下容易脆化，在根据细胞内的胞内水在低温下结成冰而在骤然的升温条件下来不及与细胞壁同时融胀的特性，这样便容易引起胞内的冰刺破花粉细胞壁，从而得到破壁的目的，如果再加其他外力的作用更促进了破壁率的增加。2.4.2 破壁方法称取一定量的花粉进行研磨，然后放置于-18冰箱内冷冻

16、24h，取出后立即加入80的热水（比例为5g：1mL，大致可使花粉浸湿）搅拌均匀，迅速冷却至4045，并在恒温42连续搅拌4h（搅拌过程中因摩擦生热料液会变干，应间隔1h加1次42的温水），最后放入干燥箱40干燥得破壁花粉。2.5 总蛋白质含量的测定2.5.1 微量凯氏定氮法原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨，氨与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵用氢氧化钠中和生产氢氧化铵，加热又分解为氨，用硼酸吸收（冷凝管的末端会预先浸在硼酸溶液中）。吸收氨后的硼酸再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。2.5.2

17、 测定方法准确称取0.22g（半固体样品25g，液体样品1020mL），小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20mL，轻轻摇匀后，用电炉以小火加热，待泡沫停止产生后，加大火力，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30分钟。消化液待冷却后用水移入100mL容量瓶中，加水至刻度。按图装好微量凯氏定氮装置，准确移取消化液10mL于反应管内，再加入10ml氢氧化钠溶液使呈强碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，夹好漏斗夹，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10mL4硼酸吸收液（加有混合指示剂）锥形瓶的液面下。蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计

18、时，继续蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1分钟，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。馏出液立即用0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至灰红色为终点，记录盐酸溶液用量。同时做一空白试验（除不加样品外，从消化开始操作完全相同），记录空白试验盐酸溶液用量。2.5.3 结果计算 蛋白质（）=式中： c-盐酸标准溶液的浓度，mol/L； -滴定样液时消耗盐酸标准溶液体积，mL； -滴定空白时消耗盐酸标准溶液体积，mL； m-样品质量，g； -氮的摩尔质量，14.01g/mol； F-氮换算为蛋白质的系数，F=6.25。2.5.4 注意事项 （1）消化过程中应不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附

19、在瓶壁上的固体残渣洗下来并促进消化。 （2）蒸馏前给水蒸气发生器内装水至2/3容积处，加数毫升稀硫酸及数滴甲基橙指示剂以使其始终保持酸性，水应呈橙红色，如变黄色时，要补加酸，这样可以避免在碱性时水中的游离氨被蒸出而影响测定结果。 （3）蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽，否则将发生倒吸。 （4）加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨逸出损失。2.6 等电点的测定将油菜花粉蛋白质提取液用0.1的盐酸调pH分别为4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8，使蛋白质沉淀，离心后取上清液进行比色测定，吸光度值最小的点对应的pH即为等电点。3 结果分析与讨论3.1

20、 原料花粉样品的确定采用微量凯氏定氮的方法对破壁前后油菜花粉中粗蛋白的含量进行测定。试验结果见表3。 表3 样品预处理方法的比较Table 3 The comparison of sample pretreatment 破壁前破壁后粗蛋白含量（）23.9327.08从表3中可以很明显的看出，破壁后的油菜花粉粗蛋白含量比破壁前油菜花粉粗蛋白含量有所提高，目前学术界普遍认为天然花粉如不经破壁处理，其有效成分不能充分释放14、15，该研究结果也能在一定程度上支持这一点。这表明破壁对花粉蛋白提取是有帮助的。所以在后续的研究中都采用破壁后的油菜花粉作为原料。3.2油菜花粉蛋白质等电点的确定按1.6进行试

21、验，考察油菜花粉蛋白质上清液吸光度随pH变化，测定油菜花粉蛋白的等电点，结果如图1所示。 图1 不同pH下蛋白质上清液的吸光度Fig.1 The absorbance of protein clear liquid in different pH 由图1可以看出，pH在从4.2增加到4.4的过程中，随着pH的增加，吸光度在缓慢减小。而当pH值超过4.4到达4.5这段过程中，吸光度伴随pH值增加开始出现快速减小。当pH值从4.5增加到4.8的过程中，蛋白质上清液吸光度开始平稳增加。同时，pH=4.8吸光度达到最大值，而pH=4.5时，油菜花粉蛋白质上清液吸光度值最小，所以，此点即为油菜花粉蛋白质

22、的等电点，即PI=4.5。3.3 单因素试验3.3.1 温度对油菜花粉蛋白提取率的影响称取1g破壁的油菜花粉样品，在固定其它提取条件（料液比为1:20，pH值为11，提取时间为75min）的情况下，考察提取温度对油菜花粉蛋白提取率的影响，试验结果如图2所示。图2 提取温度对花粉蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on the extraction percent of pollen protein从图2可以看出，温度从30到50范围内递增时，花粉蛋白提取率开始缓慢增加，当温度从50上升到60时，随着温度的升高花粉蛋白提取率明显增加，温度从60到达70的过程中

23、花粉蛋白的提取率变化相对较小，当温度进一步上升时，会使蛋白质变性，影响其溶解性。在70时花粉蛋白提取率最高，且可以很明显的看出，提取温度对花粉蛋白提取率的影响很大，提取温度为70时很适合蛋白质的溶出。故初步确定提取温度控制在70左右为宜。3.3.2 pH对油菜花粉蛋白提取率的影响称取1g破壁的油菜花粉样品，在料液比为l:20、提取温度为70、提取时间为75 min的条件下分别取pH值为8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，考察pH值对油菜花粉蛋白提取率的影响，试验结果如图3所示。图3 pH对花粉蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of pH on the extraction p

24、ercent of pollen protein从图3可以看出，在pH8到12的范围内随着pH值逐渐增加，花粉蛋白提取率先升高后降低，在pH11时达到最高。pH值在8到10范围内变化时，随着pH的上升花粉蛋白提取率的变化较稳定，油菜花粉中蛋白等电点PI=4.5，用碱提取时，蛋白质胶体远离等电点，其性质相对比较稳定，很难产生蛋白质沉淀，所以滤液中蛋白质含量不是很高。pH值在10到11的范围内变化时，随着pH值上升花粉蛋白提取率明显提高，蛋白质胶体离等电点越远，此时，蛋白质的稳定性越好，浸提液中蛋白质含量也越高，故提取率升高。但当pH值大于11时，提取率反而呈下降趋势，这是因为随着碱性加强，样品液

25、易糊化造成分离困难，蛋白质发生变性沉淀，故蛋白提取率反而降低。所以初步确定pH值为11较为适宜。3.3.3 料液比对油菜花粉蛋白提取率的影响称取1g破壁的油菜花粉样品，在固定其它提取条件（提取温度为70，pH值为11，提取时间为75min）的情况下，考察料液比对油菜花粉蛋白提取率的影响，试验结果如图4所示。图4 料液比对花粉蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of ratio of solid-liquid on the extraction percent of pollen protein从图4可以看出，当料液比从1:10增加到1:20时，随着料液比的增大，油菜花粉蛋白提取率明显的增

26、加，但是当料液比高于1:20之后，油菜花粉蛋白提取率变化较稳定。因为高的料液比可降低体系的黏度，加快传质过程，因而提取率高；但料液比过高，蛋白质提取率并没有明显增加，反而增加了后期处理的负担，产品成本也增大。因此初步确定料液比以1:20进行提取比较适宜。3.3.4 时间对油菜花粉蛋白提取率的影响 称取1g破壁的油菜花粉样品，在固定其它提取条件（提取温度为70，pH值为11，料液比为1:20）的情况下，考察提取时间对油菜花粉蛋白提取率的影响，试验结果如图5所示。图5 时间对花粉蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of time on the extraction percent of po

27、llen protein 从图5可以看出，当时间从30min增加到60min时，随着时间的增加油菜花粉蛋白提取率明显的增大，但60min之后，随着提取时间的延长，油菜花粉蛋白提取率趋于平缓，在75min时提取率达到最大。这可能是由于开始溶出的蛋白质为颗粒外层表面的谷蛋白和复合蛋白，它们比较容易提取，之后，若要溶出更多的蛋白质，溶剂必须进入颗粒内部，这样增加了提取的难度，所以60min后时间的延长对蛋白提取率的影响不大。从图中明显看出，提取时间对提取率的影响比较大，但我们考虑到长时间的提取总会有条件上的不稳定，从而可能会使部分蛋白变性。而且长时间的提取也会加大成本，所以综合各方面因素一般提取时间

28、选75min左右较为适宜。3.4 正交试验 在单因素试验的基础上，对影响油菜花粉蛋白提取率的提取温度（A）、pH值（B）、提取时间（C）和料液比（D）进行L9（34）正交试验，以蛋白质提取率为指标，优化出最佳提取条件，试验结果见表4。表4 正交试验结果分析表Table 4 the result analysis table of orthogonal experiment实验号ABCD提取率（）1111145.422122251.843133350.944212337.815223146.016231244.767313253.728321354.909332141.46K148.2136.9

29、5145.08132.89K128.58152.75131.11139.31K150.08137.16150.67143.65k49.4045.6548.3644.30k42.8650.9243.7046.44k50.0345.7250.2247.88R7.175.276.523.58 由表4的正交试验及极差分析可知，在考察的4因素中，根据k1、k2、k3确定最佳提取条件为A3B2C3D3，即提取温度为70、pH为11、提取时间为75min、料液比为1:25。通过分析R值可以得出，各因素对油菜花粉蛋白提取率影响的大小顺序为：ACBD，即温度对提取率的影响最大，其后依次是提取时间、pH值，影响最

30、小的因素是料液比，产生这种结果的原因可能是温度增加了底物分子在内的溶液体系的热能，既促使胞内活性物质向溶液扩散，又能提供酶促反应所需的能量，所以对蛋白质提取率影响最大。随着时间的延长，蛋白质已从细胞内扩散到细胞外的溶液中，细胞内外的蛋白质浓度达到一个动态平衡，延长提取时间对提高溶液中蛋白质浓度有限。4结论 （1）本试验通过在不同pH梯度条件下，采用比色分析测定了油菜花粉蛋白水溶液离心后的上清液中蛋白质的吸光度，结果显示，在pH=4.5时，离心上清液中蛋白质吸光度最低，据此确定了油菜花粉蛋白的等电点PI=4.5。 （2）在油菜花粉蛋白等电点测定的基础上，采用碱提酸沉法提油菜花粉蛋白，分别研究pH

31、值、提取温度、料液比、提取时间对油菜花粉蛋白提取率的影响，采用正交试验确定油菜花粉蛋白提取的最佳工艺条件。结果表明，在影响油菜花粉蛋白提取率的4个因素（提取温度、料液比、pH值、提取时间）中，提取温度为主要影响因素，其次是提取时间，再次是pH值，最后是料液比；油菜花粉蛋白的最佳提取条件为：料液比为1:25、温度70、pH11、浸提时间75min。在此条件下，油菜花粉蛋白提取率为60.11。参考文献1 陈术华.花粉的各种保健功能J.中国保健食品，2002，15（6）:33-342 吕耀奎,刘纬等.油菜花粉成分及其营养生理效应J.江西科学，1989，7(1)：28293 张复兴.现代养蜂生产M.北

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35、念影响着我，更以独特的人格魅力教育着我如何去为人处世，如何去面对今后的困难与挫折。在试验过程中遇到问题时，为我提出了许多的宝贵意见帮助我分析问题、解决问题，精心批改我的论文，这其中使我受益非浅。让我感到在大学期间，我不仅积累了丰富的知识，也学到了很多做人的道理，这些都将伴随着我的一生，让我更加从容地踏上新的征程。其次，感谢那些在实验中提供大力支持和帮助的老师和研究生师哥师姐。最后，感谢我的父母亲，你们是我力量的源泉，只要有你们，不管面对什么样的困难，我都不会害怕，谢谢你们对我的支持与鼓励！ 感谢我的室友及其他好友，因为有你们的帮助，我的论文得以顺利完成。感谢你们，大学四年给我了那么多的帮助与鼓励，在我不开心的时候，总能让我开心起来。不会忘记，大学四年里我们一起度过的欢乐时光，那些开心的日子，总是那么令人难以忘怀！