第2章酶促反应动力学课件.ppt
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1、生物反应工程原理第二章 酶促反应动力学,主要内容,1.酶与固定化酶的性质2.利用稳态法和快速平衡法建立酶促反应动力学方程3.操作参数(温度与pH)对酶促反应的影响4.酶的抑制动力学5.固定化酶促反应动力学6.酶的失活动力学,了解酶的失活动力学与反应过程中酶失活动力学行为。,掌握零级、一级和米氏酶促反应动力学方程及其应用原理,熟悉酶促反应与化学反应的区别与特点,具备分析固定化酶反应过程中的传质与反应和固定化酶动力学反应不同阶段特性的能力,学习的目的,了解抑制酶促反应动力学的特征,2-1 酶与固定化酶的性质,酶固定化酶,熟悉酶促反应与一般化学反应的区别与特点掌握酶促反应过程中的一些基本概念,2-1
2、-1 酶,生物反应工程是建立在生物科学与工程学基础之上。生物反应离不开生物催化剂,因此首先应深入了解生物催化剂的基本概念。酶是生物体为其自身代谢活动而产生的生物催化剂,除具有催化活性的RNA外基本都是蛋白质。基本概念:1)为什么称酶促反应?不说酶反应?2)生物催化剂与化学催化剂具有相同的性质吗?3)购买酶时,是购买的活力还是什么?,酶的分类,国际生物化学联合会(International Union of Biochemistry IUB)国际酶学委员会(Enzyme Commission,EC)于1961年提出的酶的分类与命名方案的规定,按照酶进行催化反应的类型,可将酶分为六类:1)氧化还原
3、酶类(oxidoreductases)2)转移酶类(transferases)3)水解酶类(hydrolases)4)裂合酶(lyases)5)异构酶(isomerases)6)连接(或合成)酶(ligase,synthetases),酶的分类,例如:,第一亚类(氧化基团是CHOH),在此亚亚类中的顺序号,第一大类(氧化还原酶),第一亚亚类(NAD为H的受体),编号EC1.1.1.1(已醇脱氢酶),酶的催化共性,1)降低反应的活化能 如过氧化氢的分解,无催化剂时反应活化能为75.31kJ/mol,加入过氧化氢酶后,过氧化氢分解反应的活化能为8.37kJ/mol;2)加快反应速率 一般非酶催化反
4、应速率太低,不易观察,酶催化反应速率和在相同pH值与温度下非酶催化反应速率可直接比较的例子很少。已知己糖激酶可加快反应速率,大于1010倍;乙醇脱氢酶大于2108倍。,酶的催化共性,3)不能改变反应的平衡常数,只能加快反应达到平衡的速度另外,反应中酶的立体结构和离子价态可能发生变化,但在反应结束时,酶本身一般不消耗,并恢复到原来状态。,酶的生物催化特性,1)很强的专一性 底物专一性(substrate specificity)反应专一性(reaction specificity)立体专一性(stereo specificity)2)较高的催化效率,酶的催化反应是在常温、常压等温和条件下进行的,
5、相对于此条件下的化学反应,催化效率高。另外,酶易失活;酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关;酶活性受到浓度参数、激素的量、反馈抑制等因素的调节和控制。,酶催化活力的定义,酶的催化效率是用酶活力表示在一定条件(如25,在具有最适底物浓度、最适缓冲液离子强度和pH值)下,min能催化mol底物转化为产物时所需要的酶量为一个国际单位(IU)。1972年国际酶学委员会推荐一个新的酶活力国际单位katal,符号为kat。kat的定义:在最适条件下1 s催化mol底物转化的酶量。1 kat=1mol/s=60106mol/min=6107 IU 1 IU=1mol/min=1/60mol/s=1/60k
6、at=16.6710-9 kat酶的比活力为每千克酶所具有的katal数,即kat/kg。,酶的调节功能,酶是生物催化剂,而且具有调节功能。生物反应中的有序性受多方面因素调节与控制,而酶活力的控制是代谢调节作用的主要方式。酶活力的调节方式:1)酶浓度的调节;2)激素调节;3)共价修饰调节;4)限制性蛋白水解作用与酶活性调控;5)抑制剂调节;6)反馈调节;7)金属离子和其它小分子化合物的调节等。酶还是一类多用途的催化剂,通过特殊操作,可产生具有两种或更多种不同功能(或活性中心)的酶。此外,酶的区域化(compartmentation)和多酶复合体等都和酶活力的调节控制有密切关系。,引起酶失活的原
7、因,1)酶活性中心特定氨基酸(或其它)残基被化学修饰;2)外部环境的影响,酶活性中心出现空间障碍,使其不能与底物相结合;3)酶的高级结构发生变化,相对而言是一种宏观变化;4)多肽链的断裂,可以说是一种“激烈的分解作用”;5),确保酶活力稳定的方法,酶应用的特点,1)酶的稳定性及应用特点2)酶是以活力、而不是以质量购销的3)酶有不同的质量等级:工业用酶 食品用酶 医药用酶 实际应用酶时应注意,没有必要使用比工艺条件所需纯度更高的酶。,酶应用的特点,酶应用的特点,酶应用的特点,酶应用的特点,经典酶学研究中,酶活力的测定是在反应的初始短时间内进行的,并且酶浓度、底物浓度较低,且为水溶液,酶学研究的目
8、的是探讨酶促反应的机制。工业上,为保证酶促反应高效率完成,常需要使用高浓度的酶制剂和底物,且反应要持续较长时间,反应体系多为非均相体系,有时也在有机溶剂中进行。,酶应用的特点,酶在有机溶剂中的优点:,溶解度较大,且其热稳定性和储存稳定性比在水中有明显提高;某些反应过程的热力学平衡可以向期望的方向移动,可以发生水溶液中不可能进行的反应,如脂肪酶催化酯交换和酯合成反应等;酶分子构象表现出比在水溶液中更有刚性的特点,因而可以通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些选择性;产物的分离与纯化比在水中容易;另外酶不溶于有机溶剂因此有利于酶的回收与再利用等。,酶应用的特点,有机溶剂中,猪胰脂肪酶催化正己酸和无水
9、乙醇合成己酸乙酯的反应:以环己烷为反应介质,正己酸浓度0.6 m o l/L,n(正己酸):n(无水乙醇)=1:1.25,加酶量15 g/L,反应温度37,反应24 h 后,产率达到90.5%。,2-1-2 固定化酶,1.固定化酶的基本概念2.酶固定化的方法3.固定化酶的性质,1.固定化酶的基本概念,固定化酶 通过物理或化学的方法使溶液酶结合在不溶于水的载体上,或被限制在有限空间内,能与反应液分离,保留在反应器内或能够被回收并反复利用,不溶于水但仍具有酶活力的酶。,固定化酶的发展史,固定化酶的历史沿革,固定化酶的商业化应用:,1)氨基酰化酶1969年日本田边制药公司在世界上首次商业化应用的固定
10、化酶用于DL-氨基酸拆分,实现了L-氨基酸连续生产。,2)-半乳糖苷酶又称乳糖酶,可用于水解乳中存在的乳糖,生成半乳糖和葡萄糖。采用固定化乳糖酶可连续生产低乳糖乳。,3)天冬氨酸-脱羧酶固定化天冬氨酸-脱羧酶工业化生产L-丙氨酸。,固定化酶的历史沿革,4)天冬氨酸酶利用天冬氨酸酶将延胡索酸转化生产L-天冬氨酸。,5)青霉素酰化酶医药工业上广泛应用的一种固定化酶,可用多种方法固定化。1973年已工业化生产,用于制造各种半合成青霉素和头孢霉素。,6)延胡索酸酶固定化延胡索酸酶生产L-苹果酸。,固定化酶的历史沿革,7)葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大的固定化酶。固定化葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成
11、果糖,连续生产果葡糖浆。(活性二羰基物质),固定化酶的优缺点,优点容易从反应体系中分离可以重复使用机械强度和稳定性增加便于连续化、自动化生产,缺点酶活力损失初始投资加大只适用于可溶性底物不适用于多酶反应反应受传质速率影响,2.酶固定化的方法,物理吸附法:吸附于不溶性载体 载体结合法 离子结合法:通过离子键结合 共价结合法:通过共价键结合 交联法通过双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联 格子型:包埋在高分子凝胶细微网格中 包埋法 微胶囊:包埋在高分子半透膜中,酶固定化的方法,酶固定化方法示意图,(1)离子结合(2)共价结合(3)交联(4)聚合物包埋(5)疏水作用(6)脂质体包埋(7)微胶囊,载体结
12、合法,交联法,酶与具有两个或两个以上官能团的试剂反应戊二醛特点,(1)不需要载体;(2)反应剧烈,酶活收率低;(3)结合牢固。,包埋法,将酶包埋在凝胶的微小格子或微胶囊等有限空间内聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸钙、琼脂特点,(1)只适合于底物和产物均为小分子物质的酶的固定化(2)酶活收率高(3)制备成本高,酶固定化方法的比较,3.固定化酶的性质,由于固定化常常是一种化学修饰,酶本身的结构必然受到扰动,同时酶固定化后,其催化作用由均相移到异相,由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响。,固定化酶的性质,底物专一性的改变 稳定性增强 最适pH值和最适温度变化动力
13、学参数的变化,讨 论,进行酶促反应机理研究是否有必要进行酶的固定化?,小 结,酶不仅是一生物催化剂,具有一般化学催化剂的所有功能,而且是具有生物代谢调节功能,其在生物反应过程中具有不可替代的作用。只要了解了酶的基本性质,并遵从其性质而应用酶,酶分子是相当稳定的。固定化酶是提高酶应用效率的有效方法之一。,思考题,简述酶的催化特性与调节功能。在一个实际的生物催化过程中如何确保生物催化剂(如酶)的稳定性,并提高催化效率?酶在应用过程中有哪些不同于化学催化剂和微生物作为生物催化剂的地方?为什么要固定化酶?进行生物酶催化机理研究时,采用固定化酶是否更有利于清楚了解催化过程机理?,生物反应工程原理第二章
14、酶促反应动力学,主要内容,1.酶与固定化酶的性质2.利用稳态法和快速平衡法建立酶促反应动力学方程3.操作参数(温度与pH)对酶促反应的影响4.酶的抑制动力学5.固定化酶促反应动力学6.酶的失活动力学,学习酶促反应动力学的目的,酶促反应(Enzymatic reaction)是生物反应的基础。在生物化学课程中我们学习了酶促反应动力学,为什么这里我们还要讲述、学习呢?对于商业化酶促反应过程,主要研究是对酶促反应速率规律进行的定性或定量的描述,建立可靠的反应动力学方程,进而确定适宜的操作条件。,酶促反应的特征,基于酶自身的特性,酶促反应是在常温、常压、中性范围(个别除外)条件下进行的,与一些化学反应
15、相比,省能且效率较高;由于酶促反应的专一性,无或少有副产物生成,有利于提取操作;与微生物反应相比,反应体系较简单,反应过程的最适条件易于控制等。,酶促反应的不足,酶促反应多限于一步或几步较简单的生化反应过程,与微生物反应体系相比,在经济上有时并不理想;虽然酶促反应条件比较温和,但一般周期较长。因此有发生杂菌污染的可能;固定化酶反应体系有许多优于游离酶促反应体系的优点,但固定化酶并非一定就是最优质的生物催化剂。,酶促反应与化学反应的主要区别,酶促反应 化学反应反应条件 温和 激烈反应时间 较长 时间短生物相容性 好 较差反应体积 较大 较小可持续性 较强 较差与环境友好性 较强 较差还有什么?,
16、2-2-1 酶促反应动力学基础,影响酶促反应的主要因素有:浓度因素,包括酶浓度、底物浓度等;外部因素(环境因素),包括温度、压力、溶液的介电常数与离子强度、pH等;内部因素(结构因素),包括底物及效应物浓度、酶的结构等。其中影响酶促反应的最基本的是浓度因素。从浓度因素实验可求得速率常数,而速率常数为内外因素所左右,这是单相酶促反应动力学的核心内容。,2-2-1 酶促反应动力学基础,可采用化学反应动力学方法建立相应的动力学方程。如果酶促反应速率与底物浓度无关,此时为零级反应式中:S 底物浓度;rmax 最大反应速率例如:氨在催化剂表面分解为氮气和氢气的反应,(1),2-2-1 酶促反应动力学基础
17、,当反应速率与底物浓度的一次方成正比,称为一级反应。即酶催化AB的过程式中:k1 一级反应速率常数;a0 底物A的初始浓度;b t 时产物B的浓度。,(2),例如:有机物的分解,放射性元素衰变。,2-2-1 酶促反应动力学基础,相应的二级反应,即A+B C式中:k2 二级反应速率常数;a0,b0 底物A和底物B的初始浓度;c t 时产物C的浓度。(3)式积分可得 通过作图可求出k2。,(4),(3),2-2-1 酶促反应动力学基础,式中:a、b、c A、B、C的浓度;k1、k2 各步的反应速率常数。,对连锁的酶促反应,,2-2-1 酶促反应动力学基础,如果A的初始浓度为a0,B和C的初始浓度为
18、0,并且,则可求得,例 题,例题1:卵状甲单胞菌在分批式反应中先将葡萄糖转变为葡萄糖内脂,再转化为葡萄糖酸。此反应为一级反应,反应式如下:求中间产物(葡萄糖内酯)浓度达最大时所需的时间tmax及其最大浓度值Lmax。已知反应常数k1 和k2分别为0.87h-1和0.7h-1。G0(初始葡萄糖浓度)=38mg/ml。,例 题,【解】,例 题,2-2-1 酶促反应动力学基础,何为限速阶段?,2-2-2 单底物酶促反应动力学,1.米氏方程根据酶底物中间复合物假说,对单底物酶促反应,其反应机制可表示为:,根据质量作用定律,P的生成速度可表示为,efree S x efree P,2-2-2 单底物酶促
19、反应动力学,三点假设(快速平衡法)S efree,S 底物浓度不变;不考虑 P+E ES这个可逆反应的存在。产物P为零,即反应为初始状态;ES E+P是整个反应的限速阶段,也就是说E+S=ES的可逆反应在初速度测定时间内已达到平衡。ES分解生成产物的速度不足以破坏这个平衡。,2-2-2 单底物酶促反应动力学,式中:rs 底物消耗速度(负号表示减少);rp 产物生成速率;Ks 平衡常数,其又称饱和常数。,2-2-2 单底物酶促反应动力学,稳态法推导动力学方程几点假设:同快速平衡法同快速平衡法x的生成速率与x的消失速率相等,达到动态平衡,即所谓“稳态”,2-2-2 单底物酶促反应动力学,几点讨论:
20、,Km与Ks之间关系为,2-2-2 单底物酶促反应动力学,当S k+2 时,相对S讲,呈零级反应特征当S接近Km时,反应体系随底物浓度而变动于零级和一级反应之间。,2-2-2 单底物酶促反应动力学,图1 酶浓度一定时底物浓度对反应速率的影响,2-2-2 单底物酶促反应动力学,图2 双倒数法求解Km和rmax,双倒数法(Linewear Burk):,对米氏方程两侧取倒数,得以 作图,得一直线。根据直线斜率和截距可计算出Km和rmax。,2-2-2 单底物酶促反应动力学,生物化学中的酶促反应与工业酶促反应的异同点,生物化学中酶促反应 工业酶促反应反应速度 初速度 平均速度传质影响 无 有反应时间
21、 短时间 长时间目的 了解反应机理 获得反应速率 提高生产效率还有什么?,2-2-2 单底物酶促反应动力学,工业酶促反应中人们更关心的是什么?,反应时间与底物转化率的关系基于t=0,S=S0初值积分得,例 题,例题2:将底物和酶加入到酶反应器中,经反应,底物的转化率为90%时,空时为多少?已知反应速率方程为,例 题,例 题,例题3:一般,酶促反应中酶的浓度较之底物浓度低很多,但当采用膜型生物反应器(细节见第七章),且采用高分子底物,发现米氏常数随酶浓度而变化。基于此确立相应的反应模型与酶促反应的动学方程。,例 题,【解】由题意,反应模型可写成如下:第一阶段:第二阶段:第一阶段反应的解离平衡常数
22、K为:酶及其它物质的物料平衡算式为:其中,t表示酶的总量。一般ESS,但当酶浓度较高时,ESS。,(1),例 题,解之,得,将(2)式和(3)式代入(1)式,得即,(4),例 题,若第二阶段为限速阶段,则:将(4)式带入(5)式 由式(8)可知,米氏常数随酶浓度的增加而增大。一般反应速度有可能会酶浓度增加而增大。当然也有不增加的例子。由本题可知,酶的浓度相对于底物浓度高时,酶的浓度是不可忽视的因素。,(5),(6),(7),其中,(8),小 结,1.米氏方程是一个理论性方程,是当酶促反应无传质影响下才能够成立,是实际生物反应中的一个特例。2.找出限速阶段是提高反应速率的关键。3.针对工业规模的
23、酶促反应,人们更关心的是反应时间与转化率之间的关系。,思考题,1.简述酶促反应的特征及其与化学反应的主要区别?2.应用直线作图法(LineweaverBurk法;Haneswoolf法;EadieHofstee法和积分法)求取米氏方程中的动力学参数Ks和rmax,并比较由各种方法所得结果的误差大小。3.假设单底物S生成产物P的酶促反应机理式如(1)式,试建立该可逆酶促反应(Reversible enzyme reaction)动力学方程。e、S、x和P分别是与(1)式对应项的浓度。,e S X e P,(1),生物反应工程原理 第二章 酶促反应动力学,1.酶与固定化酶的性质2.利用稳态法和快速
24、平衡法建立酶促反应动力学方程3.操作参数(温度与pH)对酶促反应的影响4.酶的抑制动力学5.固定化酶促反应动力学6.酶的失活动力学,主要内容,2-3 操作参数对酶促反应的影响,影响酶促反应的操作参数有很多,主要有pH和温度。任何酶促反应都是在一定pH值和温度下进行。温度或pH对酶促反应的影响有两方面含意,一是对酶稳定性的影响,二是对酶活性的影响。,2.3.1 pH的影响,图2-3猪胰脏淀粉酶稳定性和活力与pH的关系曲线:酶的稳定性pH曲线;:酶活力pH曲线,图2-3中酶的稳定性pH曲线呈台型;酶的活力(反应速度)pH曲线呈钟形,酶活力pH曲线处于酶稳定性pH曲线内侧。,2.3.1 pH的影响,
25、针对pH值与酶活力的关系,Michaelis提出三状态模型,其要点是:处于解离活性状态的酶记为EH-,由活性状态转入无活性状态时的酸性形式记为EH2,碱性解离形式记为E2-,三种状态的相互关系为,2.3.1 pH的影响,当底物S的解离状态不变;反应速率控制步骤为EHS-生成产物P的过程。相应的反应机理式为,kcat,kcat,kcat,2.3.1 pH的影响,由酶催化反应动力学的原理,有下述基本关系:,2.3.1 pH的影响,若定义,式中:电离平衡常数H氢离子浓度底物浓度,2.3.1 pH的影响,2.3.2 温度的影响,2.3.2 温度的影响,多数酶促反应的反应速度常数 与温度的关系,可用Ar
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