第3章__血液分析仪检验课件.ppt
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1、第三章血液分析仪检验南通大学第二附属医院检验医学中心陆永辉,血液分析仪发展史(一),血液分析仪(hematology analyzer,HA):临床血液一般检查最常用仪器。1947年,美国人库尔特(W.H.Coulter)发明电阻抗法粒子计数专利技术,1953年库尔特家族研制出全世界第一台血细胞计数仪:Model A,至90年代发展为可计数分类的全自动血液分析仪。,血液分析仪发展史(二),从单成分计数到组合计数分类从单通道到多通道从半自动到全自动从白细胞二分类到三分类发展为五分类形成红细胞、白细胞、血小板、网织红细胞四类参数系列融合物理、化学检测方法,血液分析仪的发展,检测自动化技术多样化分析
2、智能化参数系列化使用普及化,第三章 血液分析仪检验,血液分析仪优势:检测项目多速度快精度高易操作准确性好,第三章 血液分析仪检验,第一节 血液分析仪检测原理 一、仪器基本结构(一)机械系统(二)电学系统(三)光学系统 检测方法:电阻抗法、光散射法,第三章 血液分析仪检验,二、电阻抗法血细胞分析技术(一)电阻抗原理(principle of electrical impedance),又称库尔特原理(Coulter principle),第三章 血液分析仪检验,库尔特原理,“当一个不良导体颗 粒,例如血细 胞,通过两个电极之间 时,导 致电 路的电 阻抗发生变化,产生脉冲电信号。”脉冲次数细胞数
3、量,脉冲大小细胞体积。,第三章 血液分析仪检验,电阻抗原理示意图,负压,血细胞悬液,外电极,内电极,小孔,小孔管,小孔电流,样品杯,小孔近观,库尔特原理三要素:小孔、负压、电极检测:阻抗大小-细胞体积,脉冲数量-细胞个数,第三章 血液分析仪检验,检测区域,红细胞,红细胞通过小孔,红细胞计数示意图,Oscilloscope,示波镜,第三章 血液分析仪检验,检测区域,白细胞,白细胞通过小孔,白细胞计数示意图,示波镜,第三章 血液分析仪检验,电阻抗原理,血细胞相对非导电,悬浮在电解质溶液中受负压吸引通过计数小孔时,引起电阻瞬间变化产生脉冲信号,脉冲振幅代表细胞体积,脉冲数量即细胞个数。用于红细胞、白
4、细胞、血小板计数和体积测定,第三章 血液分析仪检验,(二)电阻抗法白细胞检测原理 35-450fl范围内分析白细胞(计数和 体积三分类),%,第三章 血液分析仪检验,(三)电阻抗法红细胞检测原理 红细胞计数和血细胞比容测定 36-360fl范围内计数红细胞,%,第三章 血液分析仪检验,(四)电阻抗法血小板检测原理 血小板计数:2-20fl范围计数为血小板 因体积较小,可与红细胞在一个系统中进行检测。直方图在230fl(不同仪器范围有差异)。血小板平均体积(mean platelet volume,MPV)。,10 20 30(fl),%,第三章 血液分析仪检验,细胞计数的几点说明,适宜的孔径:
5、RBC宝石微孔直径80m,WBC微孔直径100m适度的稀释:抗凝全血经1:500稀释计数WBC,1:50000稀释计数RBC、PLT加入溶血剂(溶解RBC,转换血红蛋白),打气泡混匀后计数WBC,Hb比色RBC(36-360fl)与PLT(2-20fl)体积差异大,容易区别,可在同一计数池内同时计数RBC:WBC100:1,故WBC对RBC计数影响忽略。,第三章 血液分析仪检验,(二)白细胞分类计数原理仪器将体积为35450fL的血细胞,分为256个通道(channel)。每个通道:1.64fl。根据细胞大小,分别置于不同的通道中,显示血细胞体积分布直方图(Histogram)。,第三章 血液
6、分析仪检验,三分类原理:白细胞经溶血素处理,胞质渗出,细胞皱缩,胞膜紧裹核与颗粒,体积发生变化第一群(3590fl)小细胞区:淋巴细胞(体积最小,一般在3590fl)。第二群(90160fl)是单个核细胞区(中间细胞):包括单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、原始、幼稚细胞、异常细胞等第三群(160fl)大细胞区:嗜中性粒细胞(体积最大,一般在135-350fl)。,第三章 血液分析仪检验,白细胞体积,生理状态下:单核细胞嗜酸细胞中性粒细胞嗜碱细胞淋巴细胞溶血素处理后:中性粒细胞嗜酸细胞单核细胞嗜碱细胞淋巴细胞,第三章 血液分析仪检验,三分群血液分析仪正常白细胞分类模式图(直方图),%,第三
7、章 血液分析仪检验,小细胞,单个核细胞,粒细胞,淋巴,嗜碱,单核,嗜酸,中性粒细胞,第三章 血液分析仪检验,从三分群到五分类,三分群:淋巴细胞单个核细胞中性粒细胞,五分类:淋巴细胞单核细胞中性粒细胞嗜酸细胞嗜碱细胞,第三章 血液分析仪检验,检测原理:组合应用 电学 光学 细胞化学等,三、光散射法血细胞分析技术,第三章 血液分析仪检验,三、光散射法血细胞分析方法,1、容量、电导、光散射(VCS)测量法2、电阻抗与射频技术联合检测法3、光散射与细胞化学技术联合检测法4、多角度偏振光散射检测法,第三章 血液分析仪检验,(一)容量、电导、光散射(VCS)测量法,第三章 血液分析仪检验,五分类VCS技术
8、,运用V、C、S三种探针,在流式通道的某一位点,对通过的单列白细胞,进行逐个的、同时的、三重的检测,以及三维分析,以确定其亚群性质。V-低频波,分析细胞体积;C-高频波,分析细胞核型;S-激光,分析细胞的颗粒特性。,第三章 血液分析仪检验,采用三个截然不同的方法,逐个、同时地分析每一个白细胞的特性,即体积、内部结构、颗粒特性和膜表面特征,对每个细胞的三项检测值作综合分析,定义出亚群类型,实现真正意义上的五分类。,VCS技术物理检测,第三章 血液分析仪检验,白细胞接近原态的分析,Scatter Pak双试剂系统的作用溶血剂(E-lyse):溶解红细胞终止剂(S-lyse):令溶解作用停止,并使白
9、细胞恢复到“接近原态”,第三章 血液分析仪检验,接近原态的WBC分析,接近原态的白细胞,进入流式通道,第三章 血液分析仪检验,正常压力差:标本压力大于鞘流压力,第三章 血液分析仪检验,VCS检测,八千多个白细胞逐个、直接、同时地在流式通道内接受VCS三重检测,得到各自的三维座标值,VCS,第三章 血液分析仪检验,体积检测(V),V 是以库尔特原理检测细胞的体积获得的是完全的细胞体积,VCS-DC,第三章 血液分析仪检验,细胞内部结构检测(C),C 运用高频电磁探针检测细胞的内部结构获得细胞核复杂程度、核质比例的信息区分分叶核和非分叶核细胞,VCS-RF,第三章 血液分析仪检验,VCS-Lase
10、r,S 是激光单色光束扫描细胞产生宽角度的散射光(10-70)来测量细胞表面形态及颗粒构型和质量,更好地根据颗粒特性区分淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸细胞,细胞颗粒特性检测(S),第三章 血液分析仪检验,NEDC Mean,细胞的三维定位,NEOP Mean,NE RLS Mean,第三章 血液分析仪检验,三维分析技术,将检测过的8,192个细胞分布到一个以V、C、S为三维坐标的空间内,显示出细胞群特征。高智能的计算机软件分析分析细胞群的位置、相对密度、轮廓、和大小。三维坐标的数据分析位点多过 16 106个。,第三章 血液分析仪检验,第三章 血液分析仪检验,三维细胞定位,第三章 血液分析仪检验,
11、VCS三维分析的技术特点,接近原态的白细胞分析一个分类试剂包增强型流式通道,VCS直接、同时、三重检测分析细胞的视角与手工相似真正的三维检测VCS,汇集最全面的物理检测工具三维分析的高分辨率(256 256 256)白细胞五项分类10多种异常细胞的检测,第三章 血液分析仪检验,血液分析仪的不足,起筛查作用识别异常细胞和幼稚细胞有局限性识别血液寄生虫能力不足血涂片显微镜形态学检查补充不足,第三章 血液分析仪检验,(二)电阻抗与射频法(能透入细胞内,测量核的大小及颗粒的多少):,RF:射频电流 细胞内部结构信息,DC:直流电 细胞大小的信息,第三章 血液分析仪检验,嗜酸性粒细胞检测系统嗜碱性粒细胞
12、检测系统5种白细胞分类检测系统:直流电(direct current,DC)为横坐标,以射频(radio frequency,RF)为纵坐标的二维分析图。幼稚细胞检测系统:,第三章 血液分析仪检验,(三)激光与细胞化学法 1)过氧化物酶检测通道;2)嗜碱性粒细胞/分叶核检测通道。,第三章 血液分析仪检验,过氧化物酶光散射检测,光散射测细胞大小,根据过氧化物酶含量高低区分为嗜酸粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜碱粒细胞物理、化学联合检测,第三章 血液分析仪检验,(四)多角度偏振光散射(multi-angle polarized scatter separation of white ce
13、ll,MAPSS)法0:前角散射光(13),可粗略测定细胞大小。10:狭角散射光(711),可测定细胞内部结构相对特征。90:垂直散射光(70110),测定细胞内部颗粒和胞质情况。90:消偏振光散射(70110),区分嗜酸性粒细胞与其他细胞。,第三章 血液分析仪检验,第三章 血液分析仪检验,光散射法红细胞检测原理 低角度(23)光散射:测量红细胞体积与数量高角度(515)光散射:测定单个红细胞血红蛋白浓度得到MCV、MCH、MCHC测定值。,第三章 血液分析仪检验,光散射法血小板检测原理 Mie理论(Mie theory of light scatter for homogeneous sph
14、eres):当球形化的血小板一个一个通过激光照射区时:,第三章 血液分析仪检验,低角度(23):测量细胞大小,高角度(515):检测细胞折射指数(reactive index,RI)与细胞密度有关;大血小板与各种碎片如果体积相似,但由于内容物不同,RI相差较大,二维散射图能鉴别。折射系数:血小板 1.351.40RBC含高浓度Hb 1.351.44,第三章 血液分析仪检验,四、血红蛋白检测原理 比色法,第三章 血液分析仪检验,血红蛋白检测原理,溶血剂破坏红细胞释放血红蛋白,Hb与溶血剂某些成分结合成血红蛋白衍生物,特定波长下比色,吸光度变化与血红蛋白含量成正比ICSH和WHO推荐氰化高铁血红蛋
15、白法,第三章 血液分析仪检验,五.网织红细胞计数(reticulocyte,RET)原理 20世纪90年代起,有多种检测原理相似的网织红细胞分析仪。血液分析仪检测原理:用新亚甲蓝染色使红细胞RNA着色或用荧光染料对RNA进行染色,VCS检测。,第三章 血液分析仪检验,网 织 红 细 胞 计 数新亚甲蓝-VCS检测法,以经典的超活染料新亚甲蓝(NMB)着色网织红细胞内残存的RNA漂去红细胞内血红蛋白(酸性漂洗液)在流式通道,运用VCS三维技术,将网织红细胞与成熟红细胞、白细胞、血小板、和有核红细胞区分开来,第三章 血液分析仪检验,第三章 血液分析仪检验,网织红细胞VCS三维散点图分析,网织红细胞
16、,第三章 血液分析仪检验,光散射法网织红细胞检测散点图,第三章 血液分析仪检验,第二节 血细胞分析仪检验参数(一)检测参数 中高档仪器检测参数:20项左右至超过40项(二)相关参数的临床应用,第三章 血液分析仪检验,血细胞参数介绍,WBC、NE%、NE#、LY%、LY#、MO%、MO#、EO%、EO#、BA%、BA#;RBC、Hgb、Hct、MCV、MCH、MCHC、RDWPLT、MPV、PCT、PDWRET%、RET#、MRV、RMI,第三章 血液分析仪检验,白细胞系列参数,WBC:白细胞数量,正常人参考为3.5-10 109/LNE%:中性粒细胞百分比,正常参考为50%-75%NE#:中性
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