第八章抗生素分析课件.ppt
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1、第八章,抗生素类药物的分析,第一节 概述第二节 抗生素效价微生物检定法第三节 抗生素药物的分析,世界各国实际应用的抗生素有300多种,我国药典中收载的品种有200多种。生物发酵,化学纯化,精致,化学修饰等过程,最后制成制剂,结构,组成更复杂。化学纯度低,有三多:同系物多,异构体多,降解物多。发酵过程不易控制。生产工艺复杂易受污染。分子结构大多不稳定,降解后疗效下降、失效或增加毒副作用。活性产物易发生变异。,一、抗生素药物的特点,第一节 概述,二、抗生素类药物的检查项目,抗生素的检查项目是由抗生素的生产、用途、毒副作用等决定的。一般来说,各种抗生素及其制剂的性质及工艺不同,检查项目也不同。注射剂
2、型检查项目多、要求严;口服剂型、外用药检查项目少、要求松。,第一节 概述,鉴别试验:用物理化学方法判定抗生素真伪相关物质的检查:抗生素产生过程中产生的中间体、副产物、贮存过程中的降解产物(TC ETCEATC)酸碱度检查:保证产品的稳定性和适用于临床应用水分的检查:限制水分,以免水解反应溶液澄清度检查:限制不溶性杂质,检查项目:,第一节 概述,无菌检查:检查有无杂菌异常毒性试验:限制产品中的致毒物质热源试验:限制产品中的致热物质降压物质检查:限制产品中降低血压的物质效价检查:检查抗生素含量与活性其它检查:检查抗生素各组分之间的比例(GMC),比旋度检查(TC ETC)、熔点检查(羟氨苄青霉素)
3、、晶型检查(金霉素、利福平)、溶剂残留量(甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、二氯甲烷等等),第一节 概述,其中无菌试验的目的是检查药物是否染菌。有抑菌作用的药物的微生物限度检查,应该先将抗生素活性灭活,或者除去抗生素,这样才能使制品中所污染的杂菌在培养基中生长出来,才能判定是否染菌。,去除抗生素影响的办法很多,但是又要保证杂菌不被杀死,一般有以下方法:,第一节 概述,青霉素酶法:青霉素酶先与青霉素类药物作用一段时间,使其水解b-内酰胺环部分而灭活,对细菌无抑杀作用。这种方法只对青霉素有效,特异性高。盐酸羟胺法:链霉素与盐酸羟胺反应生成链霉污,可使链霉素失活。只对链霉素有效,特异性高。树脂法:以无菌的
4、钠型树脂与碱性抗生素的水溶液混合,放置,抗生素被交换吸附到树脂上,而被去除,杂菌则留在中性或者偏碱性的水溶液中,这样取流出液作无菌检查。无菌滤膜过滤法:将抗生素水溶液通过无菌滤膜,抗生素被除去而杂菌被截留在滤膜上。取此滤膜作无菌检查。这种方法应用最广,但是操作过程中不得引入其他杂菌,以免错误判断。,第一节 概述,三、抗生素效价的标示量,1.效价定义:早期抗生素产品往往不是纯品,因此无法用重量单位表示其活性。因此,为了与临床上应用原理保持一致,以抗生素的抑制或者杀死细菌的能力作为衡量抗生素活性的指标,这个指标就叫做效价,即以效价的高低作为抗生素质量的标示。,通常,新发现的抗生素在初期尚未得到纯品
5、时候,常常用上述方法来确定效价,或者用性质相近的已知抗生素作为标准来衡量其效价。,第一节 概述,最早确定效价的抗生素是青霉素,其效价单位定义是:在实验条件下,能完全抑制50ml肉汤培养基中金黄色葡萄球菌标准菌株生长的青霉素的最低含量为一个效价单位,即一个牛津单位,也叫做一个生物活性单位。链霉素的效价单位:能完全抑制1ml肉汤培养基中大肠杆菌标准菌株生长的链霉素的最低含量为一个效价单位。,第一节 概述,随着抗生素分离纯化技术的不断提高,现在已经能制备纯净的抗生素,可以用重量来表示其效价。,首先制备出纯净的抗生素为苄青霉素钠(PcGNa),1949年国际联盟卫生组织通过试验证明,1mg PcGNa
6、能够抑制83300ml肉汤培养基中的标准金黄色葡萄球菌标准菌的株生长,即相当于1mg PcGNa=1667u(83300/50),1u PcGNa=0.6ug。,第一节 概述,2.抗生素的效价标示方法:,重量单位:以抗生素中所含特定的抗菌活性部分(纯游离碱或游离酸)的重量1微克作为1单位,即1毫克=1000单位。如链霉素硫酸盐、土霉素盐酸盐等均以重量单位表示。用这种方法表示,对不同有机酸根的同一抗生素,只要单位一样或有效部分重量一样,则这一抗生素的各种盐类虽然称重不同,但实际有效含量是相同的。这样标示的抗生素有:红霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、氯霉素、新生霉素、利福霉素SV。,第一节 概述
7、,类似重量单位:以特定的纯抗生素制品盐的重量,规定1毫克1000单位,其中包括了无抗菌活性的酸根在内,如四环素盐酸盐(包括无生物活性的盐酸根在内)。这种类似重量单位,虽然并不合理,但在国际上已经习惯沿用。,第一节 概述,重量折算单位:以特定的纯抗生素制品的某一重量为效价单位而加以折算。如第二次青霉素国际标准品(1952年)青霉素G钠称重0.5998微克为1单位,即1毫克=1670单位,那么80万单位的青霉素G钠称重应为0.48克。虽然青霉素G制品现已完全可用化学或物理方法检验其含量,但仍广泛使用效价单位的表示方法。,第一节 概述,特定单位:以一特定量的抗生素标准品(或对照品)作为1单位。如第一
8、批杆菌肽国际标准品(1953年)杆菌肽A为1毫克=55单位。制霉菌素(1963年)为1毫克=3000单位等。这类抗生素的效价单位的精确定义很难确定,折算效价也难以计算,只能以国际标准品的效价单位,作为比较的基准。,第一节 概述,半合成新霉素、头孢菌素类药物纯度较高,化学结构确定,规定原料药按照整个分子计算其百分含量。(同其他化学合成药物)稀释单位:抗生素不纯时,不能用重量表示其效价,只能用稀释单位来标示抗生素的生物活性。用于新抗生素的初期研究,第一节 概述,四、抗生素标准品,绝大多数抗生素效价采用微生物检定法。要使用到标准品。标准品是具有一定物理、化学性质及生物活性的物质。分为国际标准品和国家
9、标准品。,国际标准品是由英国伦敦生物标准检定所负责标准品原料的挑选、理化分析、分装和分发等。国际标准品效价的标定由世界卫生组织邀请有条件的国家检定所或者药厂实验室分别进行效价测定,然后通过统计分析,考察标定结果的误差与真实性,最后由生物检定专家委员会确定效价。我国自1976年参加了部分品种的国际协作标定。,第一节 概述,国内标准品是由国际标准品来标定的。我国的抗生素标准品是由中国药品生物制品检定所负责标准品原料的挑选、理化分析、分装和分发等。各种标准品都有一定的有效期,新制备的标准品开始发放,上一批的标准品停止使用。,第一节 概述,第二节 抗生素效价微生物检定法,一、抗生素效价测定方法,又叫微
10、生物检定法,是各国药典收载的法定方法。它是以抗生素的抑制、杀死细菌的能力作为衡量效价的标准,物理测定法,化学测定法,生物测定法,生物测定法优点:1)检测原理与临床应用原理一致,检测的结果能代表其杀菌、抑菌活性2)灵敏度高,用量极少,ug级,是其他方法所不及的3)使用范围广,即可用于较纯的精品,也可用于粗品,对已知抗生素和位置抗生素都适用。只要按照操作规定,既可以一次测定其总效价,而不需要分离纯化。生物测定法缺点:1)操作步骤多2)测定时间长3)误差大。,第二节 抗生素效价微生物检定法,物理、化学法测定效价是根据抗生素分子结构特点,利用其特有的物理或者化学性质及反应而进行的测定。优点:操作简单、
11、方便、省时、具有一定的专属性。缺点:1)只能对结构清楚、纯度高的已知抗生素有效2)对未知的新抗生素,或者在发酵生产中未提纯的样品无法测定。只有当用物理化学方法所测定的结果与生测结果相同时,才能用该法测定抗生素药物的效价,这是临床上的要求。,第二节 抗生素效价微生物检定法,第二节 抗生素效价微生物检定法,发展趋势:随着对抗生素分子结构的逐步认识,用物理化学方法测定效价的应用日渐增多。如我国现有几种抗生素(庆大霉素、青霉素、氯霉素、灰黄霉素)使用HPLC测定其含量,而且还分别要求了其中各个组分的含量范围,为更好的控制其毒性提供了监督手段。各国药典收载的抗生素,除了上述提及以外,其他均用微生物效价检
12、定法。,第二节 抗生素效价微生物检定法,二、抗生素效价微生物检定法(生测法),原理:以抑制或者杀死细菌的能力作为检验标准。是将供试液和标准液两者抗菌能力进行比较。,分类:稀释法比浊法扩散法,第二节 抗生素效价微生物检定法,1.稀释法 抗生素微生物效价测定最简单的办法,操作方法:在一系列试管中用液体培养基逐管将抗生素做2倍稀释,并于各个试管中加入同量的对该抗生素高度敏感的试验菌液,将各个试管放置于3724小时,观察能抑制细菌生长的最低抗生素浓度作为测定终点。同法测定抗生素标准品终点,作比较,即可求出被测定抗生素的效价。计算公式 A=(T/S)C A:供试品效价 T:供试品最大稀释倍数 C:标准品
13、效价 S:标准品最大稀释倍数注意:这种方法终点判定比较困难,误差较大,因此不是药典收载的方法,只适用于最小抑菌浓度的测定。,第二节 抗生素效价微生物检定法,二、比浊法,原理:细菌生长产生的浊度与细菌数量、群体质量(生长期、衰老期)及细菌细胞容积之间存在相关性,在一定范围内符合Beer定律。操作方法:同稀释法相似。放置于37 2-4小时,加入甲醛溶液(12%),摇匀(抑制细菌生长),用分光光度法测定530nm透光率或者吸收度,用标准曲线法(先用标准品作一条标准曲线),测定供试品效价。标准曲线测定:每个浓度测定3次,第二节 抗生素效价微生物检定法,空白:未接种试验菌的液体培养基9ml+蒸馏水1ml
14、+12%甲醛溶液0.5ml先测定各浓度3只试管吸光度,求平均值,绘制标准曲线再测定供试品3只试管吸光度,求平均值,查标准曲线,计算效价。该法比较简单,准确,日英美等国家药典收载,我国药典不收载。,第二节 抗生素效价微生物检定法,三、扩散法,原理:该法是采用固体琼脂培养基,在融化后凝固前接入试验菌(多为细菌),倒平板。等凝固后,根据量反应平行线原理,用不同的试验设计方法,将供试品和标准品接触于含菌的培养基表面,经培养后,由于抗生素向培养基内部扩散,凡抑菌浓度所达到的地方都没有细菌生长“抑菌圈”。通过比较标准品和供试品抑菌圈的大小测定抗生素的效价。,第二节 抗生素效价微生物检定法,分类:垂直扩散法
15、平面扩散法 依靠总量扩散 纸片法 依靠浓度扩散 管蝶法,管蝶法是国际通用的抗生素效价测定法,为各国药典所收载,中国药典只收载管碟法。它灵敏度高,所需要样品少,但是操作复杂,时间长,影响结果因素多,因此要从多个环节加以严格控制,才能保证试验结果与真实值接近.,第二节 抗生素效价微生物检定法,1.管蝶法测定效价的原理、操作及公式推导,原理:利用抗生素在摊布特定试验菌的琼脂培养基内扩散,形成一定浓度的含抗生素的球形区,抑制了试验菌的生长繁殖而呈现出透明的抑菌圈,并且在一定的范围内,抗生素浓度对数剂量与抑菌圈面积或者直径成正比。在同样条件下,将同质的已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液同时测定,
16、标准品溶液与供试品溶液对一定试验菌所得到的剂量反应曲线,在一定剂量范围内应互相平行。通过比较两者抑菌圈的面积或者直径,利用公式,求得供试品效价。,第二节 抗生素效价微生物检定法,根据原理设计出一剂量法(标准曲线法):适用于实验室研究的初级阶段,因为本身误差大,不要求很准。二计量法:各国药典收载,常用于抗生素产品的效价测定,法定方法。三计量法:用于抗生素标准品效价的测定,准确度最高,操作最复杂。美国药典收载三种方法,中国药典 1985 年后仅收载后两种方法,并且均规定要对测定的数据进行统计处理。,一剂量法 二计量法 三计量法,第二节 抗生素效价微生物检定法,公式推导:将不锈钢小管放置在摊布特定实
17、验菌(检定菌)的琼脂培养基平板上,当向小钢杯内滴加抗生素溶液后,抗生素分子就随着溶剂向培养基内呈球形扩散。同时将培养基平板置于培养箱内37培养,试验菌开始繁殖。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度随着离开小管的距离增大而降低,当抗生素分子扩散到T时间,这时琼脂培养基内抗生素的浓度恰好等于该抗生素对试验菌的最小抑菌浓度,试验菌的生长繁殖受到抑制而出现透明的抑菌圈。在抑菌圈边缘处,琼脂培养基中所含有抗生素的浓度即为该抗生素对该试验菌的最小抑菌浓度。,第二节 抗生素效价微生物检定法,2.二计量操作方法,1)标准品溶液的制备、保存 见药典附录2)培养基及其制备方法 见药典附录3)采用的检定菌4)供试品溶液的
18、制备按照各药品项下规定的溶剂溶解后,再按估计效价或标示量稀释至与标准品相当的浓度,第二节 抗生素效价微生物检定法,第二节 抗生素效价微生物检定法,第二节 抗生素效价微生物检定法,5)操作步骤:管:不锈钢小管(内径6.0mm0.1mm,高10.0mm0.1mm,外径7.8mm0.1mm),重量要求一致,内外壁洁净,不得粘有其他抗生素。摊布底层培养基:融化后,倒入平皿中(直径约90mm、高1617mm)。底层20ml,冷却凝固。摊布上层培养基:融化后,冷却至45-55(芽孢可至60),加入试验菌,倒入平皿中。菌层5ml,冷却凝固。放置不钢杯,滴加抗生素溶液与供试品溶液稀释液。,第二节 抗生素效价微
19、生物检定法,SH/SL=2:1 或者4:1;S3/S2/S1=1:0.8:0.80.8盖陶瓦盖:防止培养过程中水滴回落到培养基或者小管中,3716-18小时。测量抑菌圈:手工或者抑菌圈测量仪测量抑菌圈的直径(或面积)。计算效价:带入公式计算,抑菌圈测量仪自动计算。照生物检定统计法(附录)中的(2.2)法进行可靠性测验及效价计算。本法计算所得效价,如低于估计效价的90或高于估计效价的110时,则应调整其估计效价,予以重试。除另有规定外,本法的可信限率不得大于5。,第二节 抗生素效价微生物检定法,要求:二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在1822mm,三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌
20、圈直径在1518mm。注意:不同的国家,同一种抗生素,使用的检定菌不完全相同。,三、影响管蝶法效价测定结果的因素及其控制,影响抑菌圈形状的因素及控制,出现抑菌圈破裂、不圆(椭圆或不正常形态),其原因:,稀释抗生素的缓冲液PH值及盐浓度制备琼脂菌层时,加菌时培养基的温度测试用实验器材洁净程度培养温度其他,第二节 抗生素效价微生物检定法,1)稀释抗生素的缓冲液PH值及盐浓度有些抗生素溶液,若PH值低或者盐浓度高,就会出现不显抑菌圈或者呈椭圆或不正常形态,这可能是因为抗生素分子的解离状态发生了改变,从而抑菌作用受影响。四环素、链霉素都会出现这种现象。2)制备琼脂菌层时,加菌时培养基的温度温度高,试验
21、菌被烫死而造成无圈。解决办法:依据实验菌的生理特性,将融化的培养基放在不同温度的恒温水浴中,待温度平衡后,加入试验菌。3)测试用实验器材洁净程度如果测试用的玻璃平皿、小钢杯、镊子等先被抗生素污染,可能出现抑菌圈不完整的现象。,第二节 抗生素效价微生物检定法,4)培养温度培养温度不均匀,造成试验菌生长快慢不均匀,抑菌圈不圆。培养温度不均匀,抗生素的扩散系数不同,抑菌圈不圆。解决办法:培养箱内要温度均一,平皿放在同一层内,不要过多开启培养箱 5)其他抗生素滴加到小钢杯外,或者溅到小钢杯外,抑菌圈不圆。小钢杯底部与培养基表面接触不严,漏液,抑菌圈不圆。小钢杯放置太近,抑菌圈扩散到一起,抑菌圈不圆。平
22、皿内培养基厚度不同,抑菌圈不圆。,第二节 抗生素效价微生物检定法,第二节 抗生素效价微生物检定法,2.影响抑菌圈边缘清晰度的因素及控制,抑菌圈不清楚,模糊、不光滑、锯齿、双圈,其原因是:,试验菌放置时间过长菌层中含菌量过低 培养基原材料的影响 培养基pH值及盐浓度的影响 培养时间的影响,第二节 抗生素效价微生物检定法,1)试验菌放置时间过长试验菌放置时间过长,菌群内一些菌株生理特性有改变,如生长速度不同(有先长,后长),或者对抗生素敏感度不同,从而出现双圈,抑菌圈边缘不圆。这是由于C变化 r2改变(lgM=1/9.21DT*r2+lgC*4DTH)。解决办法:定期对实验菌纯化,试验菌必须是纯种
23、的,使其处于同一生理状态。在挑取单菌落的时候,球菌要取光滑型,芽孢杆菌挑取粗慥型,传斜面。斜面培养好后,用无菌水洗下菌苔,过滤。芽孢要60-65处理30分钟。镜检观察,单个菌分散度在90%以上。,第二节 抗生素效价微生物检定法,2)菌层中含菌量过低抑菌圈边缘不清,含菌量高,抑菌圈太小,影响灵敏度。解决办法:在正式实验前,找出最适菌浓。解决办法:预实验 3)培养基原材料的影响蛋白胨、酵母膏、琼脂等都能影响抑菌圈的大小与清晰度。实验发现,蛋白胨选取鱼胨、骨胨、鸡肉胨要好于肉胨、蛋胨。酵母膏中含有维生素B,不仅影响试验菌的生长,还影响某些抗生素的抗菌活性。如氯霉素效价测定,培养基中含有维生素B,抑菌
24、圈较为清晰。琼脂的质量与加量能影响抑菌圈的质量。不同琼脂的机械强度、凝固点、杂质种类和数量等等都不同,都会对试验菌的生长以及抗生素在琼脂培养基内的扩散系数,导致抑菌圈的模糊不清,不圆等现象。,第二节 抗生素效价微生物检定法,4)培养基pH值及盐浓度的影响调节培养基的PH或者适量增加盐浓度可以使抑菌圈清晰。如碱性抗生素在偏碱性的培养基和缓冲液中,抗菌活性强,抑菌圈清晰。如酸性抗生素在偏酸性的培养基和缓冲液中,抗菌活性强,抑菌圈清晰。庆大霉素、新霉素缓冲液中增加3%的NaCl,使分子扩散加快,抑菌圈大而清晰。,第二节 抗生素效价微生物检定法,5)培养时间的影响 不适当的延长双蝶的培养时间,使抑菌圈
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