枯草芽孢杆菌SNUB16对棉花种子萌发和幼苗生长的影响毕业论文.doc

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1、枯草芽孢杆菌SNUB16对棉花种子萌发和幼苗生长的影响 摘 要 为了探讨草芽孢杆菌SNUB16对棉花种子萌发和幼苗生长的影响以及抗枯萎病的效果，用不同浓度的枯草芽孢杆菌SNUB16菌液、棉花枯萎病菌菌液及它们的混合液分别处理棉花种子和土壤，做盆栽观察，记录各盆棉花出苗数、患病株数、幼苗鲜重和干重.试验结果表明，无论采用哪种接菌方法，枯草芽孢杆菌SNUB16均能增加棉花种子的出苗率，而且可显著降低棉花的患病率、增加棉花幼苗的鲜重和干重.接种棉花枯萎病菌后，棉花种子的出苗率显著降低，幼苗的患病率升高，幼苗的鲜重和干重显著降低.接种枯草芽孢杆菌SNUB16和棉花枯萎病菌的混合菌液,对棉花各项生理指标

2、的影响与对照组差异不显著.关键词 枯草芽孢杆菌SNUB16，棉花枯萎病菌，棉花，枯萎病，出苗率Effect of Bacillus subtilis SNUB16 on seed germination and seedling growth of Cotton Plants (College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xian 710062,Shaanxi)Abstract In order to explore the effects of Bacillus subtilis SNUB16 on cotton seed ger

3、mination ,seedling growth and resistance to disease,I deal the cotton seed and the soil with different concentrations of Bacillus subtilis SNUB16 ,cotton Fusarium oxysporum bacteria and their mixture respectively.Then I make the pot experiment and record the basin potted, sick for cotton seedling ti

4、ght, fresh and dry weight. The experimental results show that, no matter what the methods adopted, Bacillus subtilis SNUB16 can increase the seed germination rate, significantly reduce the prevalence of cotton and increase the cotton seedling fresh and dry weight .After inoculated against cotton Fus

5、arium oxysporum bacteria, the cotton seed germination rate has reduced significantly , the morbidity of seedling has increased and the fresh and dry weight reduced significantly. Inoculated the cotton against Vaccination bacillus subtilis SNUB16 and cotton mixed bacteria of Fusarium oxysporum cotton

6、, compared with the control, the difference of physiological indexes was not significant.Key words Bacillus subtilis SNUB16, Fusarium oxysporium, cotton, Fusarium wilt, Seedling rate.近年来，由于棉花市场的开放，棉花价格上涨，播种面积不断增加，种植棉花已成为棉区农民增加收入的增长点.棉籽的发芽出苗，包括幼苗的生长繁殖深受棉花枯萎病的影响，连年出现大面积缺苗、死苗、低产现象，给农业生产带来严重的影响12. 棉花枯萎病

7、病原菌是棉花枯萎病菌，属土壤传播的维管束病害，防治上有很大的难度.当前国内外在抗病育种、农业措施和化学防治等方面做了大量工作，但由于这些防病措施的种种弊病和不足，收效不尽人意 34，迄今尚缺乏理想的高产丰产品种和有效药剂，且化学药剂对环境的污染日益突出，生物防治日益受到重视58.因此，了解棉花枯萎病菌的作用及其拮抗菌的作用机制，有着重要的意义，能为开发防治棉花枯萎病的生防治剂提供理论依据. 为了探索棉花枯萎病的生物防治途径，前人们已经分离得到了对棉花枯萎病菌有抑制作用的荧光假单胞菌和产芽孢细菌13，其中芽孢杆菌的表现最好（芽孢杆菌是一类需氧或兼性厌氧菌，其抗菌谱广泛，对多种病原真菌、细菌均有较

8、强的抑制作用.它通过产生多种抗生素，包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类化合物、氨基酸类、核酸类和类噬菌体颗粒等，起到抑制多种植物及人类病原菌的作用3），且芽孢杆菌所产芽孢易于保存，适合加工成各种形态的菌剂，在生物防治应用上有较大的潜力.因此，作者用枯草芽孢杆菌SNUB16进行种子的盆栽防病试验，采用土壤接菌和种子接菌两种方法，就枯草芽孢杆菌SNUB16菌株对棉花枯萎病菌的拮抗作用及其机制进行研究，以期为开发防治棉花枯萎病的生物防治剂提供必要的试验依据912.1 材料和方法1.1 实验菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SNUB16，棉花枯萎病菌（Fusarium oxyspor

9、um f. sp. vasinfectum）PF1，由本院应用微生物学实验室提供.1.2 培养基1.2.1 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏5g，蛋白胨 10g ，NaCl 5g ，去离子水1000ml,固体培养基加琼脂20 g，加热溶解后，定容，用5mol/LNaOH调pH至7.4，分装在0.11Mpa高压蒸汽灭菌25-30min 14.1.2.2 土豆培养基马铃薯去皮切成薄片(切好立即放在水内，否则马铃薯容易氧化变黑)，每200克马铃薯加自来水1000毫升，置电炉上煮沸30分钟，用纱布过滤，定容至1000毫升，加蔗糖20克，K2HPO4 2 g，MgSO40.5g，固体培养基加琼脂20克，分装

10、，加塞，包装，121度、30分钟灭菌14.1.3 实验仪器试管，培养皿，移液管，温度计，移液枪，酒精灯，锥形瓶，茄子瓶，接种环，搪瓷缸，玻璃棒，恒温培养箱.1.4 枯草芽孢杆菌SNUB16的培养和菌液制备1.4.1 菌种活化将保存在斜面上的菌种用接种环以划线形式接入牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上，28 0C培养24 h活化.1.4.2 菌液制备在活化的斜面中加入5mL无菌水洗下菌体，取2mL接入装有50 mL土豆培养基的250 mL锥形瓶中，在28 0C, 180 r/min振荡培养60h.1.4.3 活菌数测定将菌液用10倍系列稀释法稀释至， 10，10，从， 10，103个稀释度各取100u

11、l加在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，用灭菌的L形玻棒涂匀，每浓度重复3次.28 0C倒置培养48 h后，统计平板上的菌落数，然后计算活菌数.1.5 棉花枯萎病菌培养和菌液制备1.5.1 菌种活化将保存在斜面上的菌种用接种环以划线形式接入土豆汁琼脂斜面培养基上，28 0C培养5天活化.1.5.2 菌液制备从活化斜面取菌，在茄瓶土豆培养基斜面划线接种，在28 0C培养7天，用无菌水洗下孢子.1.5.3 活孢子数测定将孢子液用10倍系列稀释法稀释至， 10，10，从， 10，103个稀释度各取100ul加在土豆汁琼脂培养基平板上，用灭菌的L形玻棒涂匀，每浓度重复3次.28 0C倒置培养3-4天后，统

12、计平板上的菌落数，然后计算活菌数.1.6种子接菌对棉花种子萌发和幼苗生长的影响1.6.1 制盆栽土壤先将全部土壤混合均匀，再分装在直径20-22cm的塑料花盆中，每盆装入等量土壤（先预试确定重量），7个处理，重复3次，共21盆，编号1-21.1.6.2 浸种 用枯草芽孢杆菌SNUB16菌液、棉花枯萎病菌菌液的原液、稀释至10-1的菌悬液以及混合菌液、无菌水分别浸泡棉花种子4小时.编号和处理如表1： 表1 种子接菌处理及编号 Tab. 1 Handle and Numbers of seed inoculation编号处理1-3SNUB16菌液4-6SNUB1610-1稀释液7-9棉花枯萎病菌菌

13、液10-12棉花枯萎病菌菌液10-1稀释液13-15SNUB16原菌液和棉花枯萎病菌原菌液的混合液16-18SNUB1610-1稀释液和棉花枯萎病菌菌液10-1稀释液的混合液19-21无菌水对照1.6.3 播种 在每盆播种浸泡过的相应的棉花种子10粒，播种深度3cm. 盆栽在室外自然生长，常规管理，每天中午12点记录温度，并向每个花盆喷等量自来水.每24小时统计一次棉花种子的出苗情况，计算出苗率，待植株生长表现出差异时，统计染病株数和等级15.1.6.4 测定生长 30天后，将幼苗从花盆中完整分离，洗净后用滤纸吸干水分，称量每盆幼苗的鲜重，并记录每个花盆幼苗的株数，后将幼苗于80烘干4个小时，

14、称量每盆幼苗的干重.1.7土壤接菌对棉花种子萌发和幼苗生长的影响1.7.1 制盆栽土壤先将全部土壤混合均匀，再分装在直径20-22cm的塑料花盆中，每盆装入等量土壤（先预试确定重量），7个处理，重复3次，共21盆，编号1-21(表2).1.7.2 土壤接菌表2 土壤接菌处理及编号Tab. 2 Handle and Numbers of soil inoculation编 号土壤处理1-3SNUB16菌液10mL / Kg土壤4-6SNUB1610-1稀释液10mL / Kg土壤7-9棉花枯萎病菌菌液10mL / Kg土壤10-12棉花枯萎病菌菌液10-1稀释液10mL / Kg土壤13-15S

15、NUB16原菌液和棉花枯萎病菌原菌液的混合液10mL / Kg土壤16-18SNUB1610-1稀释液和棉花枯萎病菌菌液10-1稀释液的混合液10mL / Kg土壤19-21加无菌水对照1.7.3 浸种用无菌水浸种4小时.1.7.4 播种 在每盆播种浸泡过的相应的棉花种子10粒，播种深度3cm. 盆栽在室外自然生长，常规管理，每天中午12点记录温度，并向每个花盆喷等量自来水.每24小时统计一次棉花种子的出苗情况，计算出苗率，待植株生长表现出差异时，统计染病株数和等级15.1.7.5 测定生长 30天后，将幼苗从花盆中完整分离，洗净后用滤纸吸干水分，称量每盆幼苗的鲜重，并记录每个花盆幼苗的株数，

16、后将幼苗于80烘干4个小时，称量每盆幼苗的干重.2 实验结果 2.1 枯草芽孢杆菌活菌计数枯草芽孢杆菌活菌计数结果见表3，选出菌落数在30300 cfu/mL范围的各皿，以10稀释度最为适宜，所以，选取10稀释度的计数结果进行计算，枯草芽孢杆菌活菌数为8.4cfu/mL. 1617表3 枯草芽孢杆菌活菌计数表Tab. 3 Bacillus subtilis colony counting稀释度 每皿菌落数 平均值 X1 X2 X3 53950753952810 7085968410 15.1618162.2 棉花枯萎病菌活菌计数棉花枯萎病菌活菌计数结果见表4，选出菌落数在30300 cfu/m

17、L范围的各皿，以10稀释度最为适宜，所以，选取10稀释度的计数结果进行计算，棉花枯萎病菌活菌数为1.21cfu/mL. 1617表4 棉花枯萎病菌活菌计数表Tab. 4 Fusarium oxysporum colony counting稀释度 每皿菌落数 平均值 X1 X2 X3 33531132032910 121113128121 10 413035302.3 供试细菌对棉花出苗率的影响 2.3.1 种子接菌对棉花出苗率的影响本试验测定了两株供试菌不同浓度的悬浮液及其混合液浸种处理对棉花出苗率的影响.结果见表5.表5 种子接菌对棉花出苗率的影响Tab. 5 Influence of se

18、ed inoculation on cutton bergeon编号处理 出苗率（%）-CK值显著性19-21无菌水（CK）70708073.331-3B16原液90909090.0016.670.054-6B16稀释液80809083.3310.000.057-9PF1原液50506053.33-20.000.01 10-12PF1稀释液60706063.33-10.000.05 13-15B16原液+PF1原液70707070.00-3.330.05 16-18B16稀释液+PF1稀释液70808076.673.340.05 注：表示差异显著；表示差异极显著；空格表示差异不显著结果表明枯草

19、芽孢杆菌原液处理棉花种子后，出苗率显著高于对照；枯草芽孢杆菌稀释液处理后，出苗率也显著高于对照；棉花枯萎病菌的作用则相反，可显著降低棉花的出苗率，浓度越高，作用越显著；相同浓度的两种菌液混合，由于两种细菌的拮抗作用，对棉花出苗率的影响不大，与对照组差异不显著. 2.3.2 土壤接菌对棉花出苗率的影响本试验测定了两株供试菌不同浓度的悬浮液及其混合液土壤接菌处理对棉花出苗率的影响.结果见表6.表6 土壤接菌对棉花出苗率的影响Tab. 6 Influence of soil inoculation on cutton bergeon编号处理 出苗率（%）-CK值显著性19-21无菌水（CK）7080

20、8076.671-3B16原液100909093.3316.660.054-6B16稀释液90908086.6710.000.057-9PF1原液50606056.67-20.000.0110-12PF1稀释液70707070.00-6.670.0513-15B16原液+PF1原液70708073.33-3.340.0516-18B16稀释液+PF1稀释液80807076.670.000.05注：表示差异显著；表示差异极显著；空格表示差异不显著结果表明枯草芽孢杆菌原液和10-1稀释液处理棉花种子后，出苗率都显著高于对照，且浓度越高，作用越明显；而棉花枯萎病菌的作用则相反，可显著降低棉花的出苗率

21、，浓度越高，作用越显著；相同浓度的两种菌液混合，由于两种细菌的拮抗作用，对棉花出苗率的影响不大，与对照组差异不显著.2.4 供试菌对棉花枯萎病的盆栽防病效果 2.4.1 种子接菌对棉花枯萎病的盆栽防病效果本试验用两株供试菌不同浓度的悬浮液及其混合液对棉花种子浸种处理，通过盆栽试验测定其对棉花枯萎病发生的影响.结果见表7.表7 种子接菌对棉花患病率的影响Tab. 7 Effect of seed inoculation on prevalence of cotton piants 编号处理 患病率（%）-CK值显著性19-21无菌水（CK）42.8642.8637.5041.071-3B16原液

22、22.2211.1111.1114.81-26.260.014-6B16稀释液25.0037.5022.2228.24-12.830.057-9PF1原液80.0060.0066.6768.8927.820.0510-12PF1稀释液50.0057.1450.0052.3811.310.0513-15B16原液+PF1原液42.8642.8657.1447.626.550.0516-18B16稀释液+PF1稀释液42.8650.0037.5043.452.380.05注：表示差异显著；表示差异极显著；空格表示差异不显著试验结果表明，枯草芽孢杆菌原液能够极显著的降低棉花枯萎病的患病率，与对照组差

23、异相当明显，对棉花枯萎病表现出较好的防治效果；枯草芽孢杆菌10-1稀释液显著降低棉花枯萎病的患病率，对棉花枯萎病有一定的防治作用；而棉花枯萎病菌原液和稀释液都显著提高棉花的患病率；两种菌的原液或是10-1稀释液的混合液，对棉花枯萎病的防治效果不显著，患病率分别为47.62%，43.45%，对照组为41.07%，与对照组差异不大. 2.4.2 土壤接菌对棉花枯萎病的盆栽防病效果本试验用两株供试菌不同浓度的悬浮液及其混合液分别对土壤进行接种处理，通过盆栽试验测定其对棉花枯萎病发生的影响.结果见表8.表8 土壤接菌对棉花患病率的影响Tab. 8 Effect of soil inoculation

24、on prevalence of cotton piants 编号处理 患病率（%）-CK值显著性19-21无菌水（CK）42.8637.5037.5039.291-3B16原液10.0011.1111.1110.74-28.550.014-6B16稀释液22.2222.2225.0023.15-16.140.017-9PF1原液80.0066.6766.6771.1131.820.0110-12PF1稀释液57.1457.1442.8652.3813.090.0513-15B16原液+PF1原液42.8642.8637.5041.071.780.0516-18B16稀释液+PF1稀释液50.

25、0037.5042.8643.454.160.05注：表示差异显著；表示差异极显著；空格表示差异不显著试验结果表明，枯草芽孢杆菌原液和10-1稀释液处理都能够极显著的降低棉花枯萎病的患病率，与对照组差异很大，对棉花枯萎病表现出较好的防治效果，且随着浓度的增加，防治效果越显著；棉花枯萎病菌原液极显著提高棉花的患病率，10-1稀释液作用也很显著，浓度越高，病情越严重；两种菌的原液或是10-1稀释液的混合液，对棉花枯萎病的防治效果不显著，与对照组差异不明显.2.5 供试菌对棉花幼苗鲜重的影响 2.5.1 种子接菌对棉花幼苗鲜重的影响本试验测定了两株供试菌不同浓度的悬浮液及其混合液对棉花种子浸种处理，

26、通过盆栽试验测定其对棉花鲜重的影响.结果见表9.表9 种子接菌对棉花幼苗鲜重的影响Tab. 9 Effect of seed inoculation on fresh weight of cotton piants 编号处理 幼苗鲜重（g）-CK值显著性19-211-3无菌水（CK）0.640.620.620.63B16原液0.860.900.860.870.240.014-6B16稀释液0.730.730.660.710.080.057-9PF1原液0.400.450.420.42-0.210.0110-12PF1稀释液0.560.550.530.55-0.080.0513-15B16原液+

27、PF1原液0.620.650.650.640.010.0516-18B16稀释液+PF1稀释液0.640.650.620.640.010.05注：表示差异显著；表示差异极显著；空格表示差异不显著试验结果表明，接种枯草芽孢杆菌原液能够极显著的增加棉花幼苗的相对含水量，其10-1稀释液也能显著增加棉花幼苗的相对含水量；棉花枯萎病菌原液极显著的降低棉花幼苗的相对含水量，幼苗显得矮小，其10-1稀释液对降低棉花幼苗的相对含水量作用效果也显著；混合菌液对棉花幼苗的相对含水量作用效果不显著，两个浓度的混合液处理与对照组作用效果差不多.2.5.2 土壤接菌对棉花幼苗鲜重的影响本试验测定了两株供试菌不同浓度的

28、悬浮液及其混合液对土壤进行接种处理，通过盆栽试验测定其对棉花鲜重的影响.结果见表10.表10 土壤接菌对棉花幼苗鲜重的影响Tab. 10 Effect of soil inoculation on fresh weight of cotton piants 编号处理 幼苗鲜重（g）-CK值显著性19-211-3无菌水（CK）0.660.650.620.64B16原液0.880.860.880.870.230.014-6B16稀释液0.730.780.690.730.090.057-9PF1原液0.420.450.410.43-0.210.0110-12PF1稀释液0.510.540.520.5

29、2-0.120.0513-15B16原液+PF1原液0.630.620.690.65-0.010.0516-18B16稀释液+PF1稀释液0.610.670.650.640.000.05注：表示差异显著；表示差异极显著；空格表示差异不显著试验结果表明，接种枯草芽孢杆菌原液能够极显著的增加棉花幼苗的相对含水量，其10-1稀释液也能显著增加棉花幼苗的相对含水量；棉花枯萎病菌原液极显著的降低棉花幼苗的相对含水量，幼苗显得矮小，其10-1稀释液对降低棉花幼苗的相对含水量作用效果也显著；混合菌液对棉花幼苗的相对含水量作用效果不显著，两个浓度的混合液处理与对照组作用效果差不多.2.6 供试菌对棉花幼苗干重

30、的影响 2.6.1 种子接菌对棉花幼苗干重的影响本试验测定了两株供试菌不同浓度的悬浮液及其混合液对棉花种子浸种处理，通过盆栽试验测定其对棉花干重的影响.结果见表11.表11 种子接菌对棉花幼苗干重的影响Tab. 11 Effect of seed inoculation on dry weight of cotton paints编号处理 幼苗干重（g）-CK值显著性19-211-3无菌水（CK）0.070.060.060.06B16原液0.090.090.080.090.030.054-6B16稀释液0.070.080.080.080.020.057-9PF1原液0.040.040.030.

31、04-0.020.0110-12PF1稀释液0.030.050.050.04-0.020.0513-15B16原液+PF1原液0.060.070.060.060.000.0516-18B16稀释液+PF1稀释液0.050.060.070.060.000.05注：表示差异显著；表示差异极显著；空格表示差异不显著试验结果表明，接种枯草芽孢杆菌原液和10-1稀释液均能够显著的增加棉花幼苗的相对物质含量；棉花枯萎病菌原液极显著的降低棉花幼苗的相对物质含量，幼苗显得矮小，其10-1稀释液对降低棉花幼苗的相对物质含量作用效果也显著；混合菌液对棉花幼苗的相对物质含量作用效果不显著，两个浓度的混合液处理与对照

32、组作用效果差不多.2.6.2 土壤接菌对棉花幼苗干重的影响本试验测定了两株供试菌不同浓度的悬浮液及其混合液对土壤进行接种处理，通过盆栽试验测定其对棉花干重的影响.结果见表12.表12 土壤接菌对棉花幼苗干重的影响Tab. 12 Effect of soil inoculation on dry weight of cotton paints编号处理 幼苗干重（g）-CK值显著性19-211-3无菌水（CK）0.060.060.060.06B16原液0.090.100.080.090.030.014-6B16稀释液0.070.080.080.080.020.057-9PF1原液0.040.040

33、.030.04-0.020.0110-12PF1稀释液0.050.050.050.05-0.010.0513-15B16原液+PF1原液0.060.070.060.060.000.0516-18B16稀释液+PF1稀释液0.060.060.050.060.000.05注：表示差异显著；表示差异极显著；空格表示差异不显著试验结果表明，接种枯草芽孢杆菌原液极显著的增加棉花幼苗的相对物质含量，接种10-1稀释液也可显著的增加棉花幼苗的相对物质含量；棉花枯萎病菌原液极显著的降低棉花幼苗的相对物质含量，幼苗显得矮小，其10-1稀释液对降低棉花幼苗的相对物质含量作用效果也显著；混合菌液对棉花幼苗的相对物质

34、含量作用效果不显著，两个浓度的混合液处理与对照组作用效果差不多.2.7 讨论本试验已证实枯草芽孢杆菌能改善棉花的生长状况，从而促进棉花的生长发育.具体来说，枯草芽孢杆菌能通过一定的方式提高棉花的出苗率、降低患病率以及增加棉花幼苗的鲜重和干重，而棉花枯萎病菌的作用则与之相反.本试验还看到，枯草芽孢杆菌溶液不但对棉花的出苗率、患病率、鲜重、干重有明显的影响，而且对棉花枯萎病菌有拮抗作用，浓度越高，作用效果越显著.这为今后增加棉花生产、提棉花高产量和品质提供了一条值得研究和开发的新途径.枯草芽孢杆菌的这一效应对于棉花的正常生长发育是十分有意义的.然而，绝大多数研究表明，枯草芽孢杆菌能促进棉花生殖生长

35、，但对其营养生长的效应研究的较少，尤其是国内则更少.本试验也仅从枯草芽孢杆菌对棉花种子的出苗率、幼苗的患病率、鲜重和干重这几方面做了研究，因此，关于枯草芽孢杆菌对棉花生长发育的影响机制应该进一步探索1820.另外，许多有关枯草芽孢杆菌抑制棉花枯萎病菌的问题在本试验中还没有得到解决.比如说，枯草芽孢杆菌的有效性随菌种不同而异.我们认为枯草芽孢杆菌的发育特点即侵染速率、结构组成等可能会影响到它们的有效性.此方面尚待深人研究.更值得注意的是:前人有关同一种枯草芽孢杆菌对不同棉花品种的侵染率的差异的研究表明，品种与枯草芽孢杆菌之间存在一定的相互选择性或亲合力，这在筛选高效菌种方面值得重视。 结 论 枯

36、草芽孢杆菌可高效拮抗棉花枯萎病菌，盆栽试验中，无论是对棉花的出苗率，还是幼苗的患病率、鲜重和干重都表现出极显著的防治效果，是一个较好的防治棉花枯萎病的生防菌.但对拮抗细菌的施用时机、方法、剂型、施用剂量、作用机制等多方面需进一步作系统的研究，以便提高田间防治效果.【参考文献】1 朱元庆，李 春. 棉花发芽率低的原因及防止措施J. 山东省农业管理干部学院学报.2 雷继清. 棉花的种子萌发与幼苗生育. 农业科技专题讲座.3 齐东梅，梁启梅，惠 明，牛天贵. 棉花枯萎、黄萎病拮抗芽孢杆菌的抗菌蛋白特性J. 生物学通报，2005，32（4）：4246.4 石磊岩. 棉花学报，1996，8（6）：292

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