4787.酶促法制备茶黄素工艺初步研究 毕业论文.doc
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1、毕 业 论 文(设计)题 目 酶促法制备茶黄素工艺初步研究 指导老师 专业班级 生物技术及应用0701 姓 名 学 号 2010 年 5 月 30 日摘要研究利用绿茶鲜叶浆及梨汁为酶源,采用体外氧化中酶促法来制备茶黄素。方法:采摘新鲜茶叶,阴凉干燥处摊放12h,-18以下冰柜冷冻6h,组织捣碎机粉碎匀浆,添加新鲜梨汁,并柠檬酸调pH值至4.7;茶多酚40g,加入乙酸乙酯溶解。将上述两部分液体,迅速混匀,加入发酵罐中,温度25,pH值4.7,通入空气流量0.6L/min,高速搅拌,发酵60min。再进一步分离两相,制备得到茶黄素。结论:经过液相检测,本文酶促法制备茶黄素工艺可以制得茶黄素,茶黄素
2、主要在乙酸乙酯相中,含量6.86%。关键词:茶黄素; 茶多酚; 体外氧化; 酶源; 发酵 目 录引言11材料21.1实验材料21.2实验试剂21.3实验仪器22方法22.1实验方法32.1.1酶源制备32.1.2底物处理32.1.3发酵(酶促反应)32.1.4茶黄素萃取32.1.5茶黄素纯化42.2检测方法43结果与分析53.1检测结果53.1.1茶黄素对照品图谱53.1.2酶促发酵茶黄素浓度检测54总结与讨论6参考文献8引言茶是源于我国,遍布世界的无酒精饮料之一,饮茶对人体有保健作用,本草纲目中就有茶叶药用功能的记载。现代科学研究也表明,茶叶是健康饮品,含有茶多酚、咖啡碱、茶多糖、茶氨酸、茶
3、色素等生物活性物质,具有抑菌、抗病毒、防癌抗癌等多种保健功能1。茶色素属水溶性色素,分为茶黄素、茶红素和茶褐素三类。其中茶色素中包含的茶黄素(Theaflavins, TFs),现代研究表明,茶黄素不仅是红茶的重要品质成分之一,而且具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗突变、抗癌防癌、降血糖、降血脂、防治心血管疾病等功效,并且还对艾滋病毒逆转录酶和多种DNA聚合酶有特异性抑制作用。自Roberts E.A.H.(1957年)发现茶黄素以来,茶黄素一直是茶叶研究的热点。茶黄素有12种组分,其中茶黄素(TF),茶黄素-3-没食子酸酯(TF2A),茶黄素-3-没食子酸酯(TF2B)和茶黄素-3,3-双
4、没食子酸酯(TFDG),是4种最主要的茶黄素。茶黄素的独特生理活性使其生产和研究受到国内外的广泛关注,随着人们对茶黄素结构和性质的认识越来越深入,制取茶黄素的方法研究也取得了很大的进展,但由于红茶茶汤中茶黄素含量低(0.2%2.0%)2,使茶黄素的利用受到很大限制,因此,人们不断探索新的茶黄素制备途径,而儿茶素体外模拟氧化,被作为一条研究茶黄素形成机理及提高其制率行之有效的方法。本文以新鲜茶叶为原料,并利用梨中所含的多酚氧化酶,酶促法体外氧化3制备茶黄素,着力寻求酶促法制备茶黄素的方法,是为更高效、更绿色、更节能的途径。目前市场是直接购买酶源来发酵生产,成本提高,综合利用资源率降低。因此研究利
5、用绿茶鲜叶汁做为酶源,适宜参数条件下,添加到干茶提取液中,发酵生产茶黄素4。如该项技术获得成功,将意义重大、前景广泛。1材料1.1实验材料新鲜茶叶(1芽2-3叶,产于浙江杭州);梨(购于华联超市);茶多酚(浙江绍兴东灵保健食品有限公司提供,TP98%)1.2实验试剂柠檬酸,乙酸乙酯,冰醋酸:分析纯食用乙醇乙腈:色谱纯蒸馏水:由纯水器Ultra pure plus制得AB-8大孔吸附树脂1.3实验仪器组织捣碎机(878-B 上海正慧工贸有限公司)电子天平(JY10001 上海华岩仪器公司)分析天平(AR2140 上海力衡仪器仪表有限公司)低温箱(HF-135-U40 成都市生科仪器有限责任公司)
6、冷冻离心机(SIGMA3K15 上海基汇生物科技有限公司)发酵罐(SFV-10L 职业技术学院生物实验室定做)超声波发生仪(KQ-500DB 上海楚定分析仪器有限公司)旋转蒸发仪(RE-52AA 上海亚荣生化仪器厂)冷冻干燥仪(ALPHA 1-2 LD 河南兄弟仪器设备有限公司)高效液相(DIONEX 戴安中国有限公司)2方法利用绿茶鲜叶浆及梨汁为酶源,采用体外氧化中酶促法来制备茶黄素的整体操作路线流程如下图2.1所示。制备酶源(茶叶、梨)处理底物(茶多酚乙酸乙酯溶液)乙酸乙酯相发酵酶促(25,pH4.7,60min)萃取(两相分离)水相柱分离(AB-8)冷冻干燥液相检测图2.1酶促法制备茶黄
7、素操作流程图2.1制备方法2.1.1酶源制备5-8酶源包括来自茶叶的多酚氧化酶和来自梨的多酚氧化酶,酶源制备如下:新鲜茶叶1000g,堆放置阴凉干燥处12h,在-18以下低温箱里冷冻6h,取出冰冻的茶鲜叶,用组织捣碎机将其粉碎匀浆,所得茶浆液冷藏备用;提供足够的梨,采用纵切方式,要捣碎充分,匀质并冷冻离心,取上层清液,所得梨汁冷藏备用;将按上述方法制备所得的茶浆液中添加梨汁至2000ml,并用柠檬酸溶液调节此混合液pH值至4.7,酶源制备完成。2.1.2底物处理称取茶多酚40g放入大烧杯中,然后再加入乙酸乙酯溶解至1000ml,待用。2.1.3发酵(酶促反应)9将上述酶源和底物,迅速混匀,装入
8、10L发酵罐体中,控制温度25,pH值4.7的条件下,通入空气流量为0.6L/min,高速搅拌,持续发酵60min。2.1.4茶黄素萃取发酵结束后,停止通入空气,移出发酵液,转入分液漏斗中,静置分层,移出乙酸乙酯相备用;水相则迅速升温至80,保持30min,抽滤得滤液,滤渣加入2000ml沸水超声波(80)水浴浸提15min,抽滤,合并滤液,70真空浓缩至原体积的1/3,等待进一步处理。2.1.5茶黄素纯化乙酸乙酯相低温真空浓缩,挥发出去乙酸乙酯,加入70%乙醇溶解真空浓缩,赶走去乙酸乙酯,浓缩液冷冻干燥,干燥样品进行HPLC检测。水相浓缩液,AB-8树脂分离。先用2床层的体积蒸馏水除去多糖及
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