4787.酶促法制备茶黄素工艺初步研究 毕业论文.doc

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1、毕 业 论 文（设计）题 目 酶促法制备茶黄素工艺初步研究 指导老师 专业班级 生物技术及应用0701 姓 名 学 号 2010 年 5 月 30 日摘要研究利用绿茶鲜叶浆及梨汁为酶源，采用体外氧化中酶促法来制备茶黄素。方法：采摘新鲜茶叶，阴凉干燥处摊放12h，-18以下冰柜冷冻6h，组织捣碎机粉碎匀浆，添加新鲜梨汁，并柠檬酸调pH值至4.7；茶多酚40g，加入乙酸乙酯溶解。将上述两部分液体，迅速混匀，加入发酵罐中，温度25，pH值4.7，通入空气流量0.6L/min，高速搅拌，发酵60min。再进一步分离两相，制备得到茶黄素。结论：经过液相检测，本文酶促法制备茶黄素工艺可以制得茶黄素，茶黄素

2、主要在乙酸乙酯相中，含量6.86%。关键词：茶黄素； 茶多酚； 体外氧化； 酶源； 发酵 目 录引言11材料21.1实验材料21.2实验试剂21.3实验仪器22方法22.1实验方法32.1.1酶源制备32.1.2底物处理32.1.3发酵（酶促反应）32.1.4茶黄素萃取32.1.5茶黄素纯化42.2检测方法43结果与分析53.1检测结果53.1.1茶黄素对照品图谱53.1.2酶促发酵茶黄素浓度检测54总结与讨论6参考文献8引言茶是源于我国，遍布世界的无酒精饮料之一，饮茶对人体有保健作用，本草纲目中就有茶叶药用功能的记载。现代科学研究也表明，茶叶是健康饮品，含有茶多酚、咖啡碱、茶多糖、茶氨酸、茶

3、色素等生物活性物质，具有抑菌、抗病毒、防癌抗癌等多种保健功能1。茶色素属水溶性色素，分为茶黄素、茶红素和茶褐素三类。其中茶色素中包含的茶黄素(Theaflavins, TFs)，现代研究表明，茶黄素不仅是红茶的重要品质成分之一，而且具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗突变、抗癌防癌、降血糖、降血脂、防治心血管疾病等功效，并且还对艾滋病毒逆转录酶和多种DNA聚合酶有特异性抑制作用。自Roberts E.A.H.(1957年)发现茶黄素以来，茶黄素一直是茶叶研究的热点。茶黄素有12种组分，其中茶黄素(TF)，茶黄素-3-没食子酸酯(TF2A)，茶黄素-3-没食子酸酯(TF2B)和茶黄素-3,3-双

4、没食子酸酯(TFDG)，是4种最主要的茶黄素。茶黄素的独特生理活性使其生产和研究受到国内外的广泛关注，随着人们对茶黄素结构和性质的认识越来越深入，制取茶黄素的方法研究也取得了很大的进展，但由于红茶茶汤中茶黄素含量低(0.2%2.0%)2，使茶黄素的利用受到很大限制，因此，人们不断探索新的茶黄素制备途径，而儿茶素体外模拟氧化，被作为一条研究茶黄素形成机理及提高其制率行之有效的方法。本文以新鲜茶叶为原料，并利用梨中所含的多酚氧化酶，酶促法体外氧化3制备茶黄素，着力寻求酶促法制备茶黄素的方法，是为更高效、更绿色、更节能的途径。目前市场是直接购买酶源来发酵生产，成本提高，综合利用资源率降低。因此研究利

5、用绿茶鲜叶汁做为酶源，适宜参数条件下，添加到干茶提取液中，发酵生产茶黄素4。如该项技术获得成功，将意义重大、前景广泛。1材料1.1实验材料新鲜茶叶（1芽2-3叶，产于浙江杭州）；梨（购于华联超市）；茶多酚（浙江绍兴东灵保健食品有限公司提供，TP98%）1.2实验试剂柠檬酸，乙酸乙酯，冰醋酸：分析纯食用乙醇乙腈：色谱纯蒸馏水：由纯水器Ultra pure plus制得AB-8大孔吸附树脂1.3实验仪器组织捣碎机（878-B 上海正慧工贸有限公司）电子天平（JY10001 上海华岩仪器公司）分析天平（AR2140 上海力衡仪器仪表有限公司）低温箱（HF-135-U40 成都市生科仪器有限责任公司）

6、冷冻离心机（SIGMA3K15 上海基汇生物科技有限公司）发酵罐（SFV-10L 职业技术学院生物实验室定做）超声波发生仪（KQ-500DB 上海楚定分析仪器有限公司）旋转蒸发仪（RE-52AA 上海亚荣生化仪器厂）冷冻干燥仪（ALPHA 1-2 LD 河南兄弟仪器设备有限公司）高效液相（DIONEX 戴安中国有限公司）2方法利用绿茶鲜叶浆及梨汁为酶源，采用体外氧化中酶促法来制备茶黄素的整体操作路线流程如下图2.1所示。制备酶源（茶叶、梨）处理底物（茶多酚乙酸乙酯溶液）乙酸乙酯相发酵酶促（25，pH4.7，60min）萃取（两相分离）水相柱分离（AB-8）冷冻干燥液相检测图2.1酶促法制备茶黄

7、素操作流程图2.1制备方法2.1.1酶源制备5-8酶源包括来自茶叶的多酚氧化酶和来自梨的多酚氧化酶，酶源制备如下：新鲜茶叶1000g，堆放置阴凉干燥处12h，在-18以下低温箱里冷冻6h，取出冰冻的茶鲜叶，用组织捣碎机将其粉碎匀浆，所得茶浆液冷藏备用；提供足够的梨，采用纵切方式，要捣碎充分，匀质并冷冻离心，取上层清液，所得梨汁冷藏备用；将按上述方法制备所得的茶浆液中添加梨汁至2000ml，并用柠檬酸溶液调节此混合液pH值至4.7，酶源制备完成。2.1.2底物处理称取茶多酚40g放入大烧杯中，然后再加入乙酸乙酯溶解至1000ml，待用。2.1.3发酵（酶促反应）9将上述酶源和底物，迅速混匀，装入

8、10L发酵罐体中，控制温度25，pH值4.7的条件下，通入空气流量为0.6L/min，高速搅拌，持续发酵60min。2.1.4茶黄素萃取发酵结束后，停止通入空气，移出发酵液，转入分液漏斗中，静置分层，移出乙酸乙酯相备用；水相则迅速升温至80，保持30min，抽滤得滤液，滤渣加入2000ml沸水超声波（80）水浴浸提15min，抽滤，合并滤液，70真空浓缩至原体积的1/3，等待进一步处理。2.1.5茶黄素纯化乙酸乙酯相低温真空浓缩，挥发出去乙酸乙酯，加入70%乙醇溶解真空浓缩，赶走去乙酸乙酯，浓缩液冷冻干燥，干燥样品进行HPLC检测。水相浓缩液，AB-8树脂分离。先用2床层的体积蒸馏水除去多糖及

9、杂物；再用25%乙醇2倍床层体积洗脱收集第一馏分；最后用70%乙醇1.5倍床层体积洗脱收集第二馏分。各馏分70真空浓缩，浓缩液真空干燥，干燥样品进行HPLC检测。2.2检测方法1）单体标样配制：分别准确称取TF1 2.4000mg、TF2A 3.2500mg、TF2B 1.3500mg、TFDG 4.6000mg，依次加入10ml容量瓶中，分别配成浓度为TF1 0.240mg/ml、TF2A 0.325mg/ml、TF2B 0.135mg/ml、TFDG 0.460mg/ml的溶液为标准品溶液。2）样液配制：准确称取需要检测的物质50.0000mg，用蒸馏水定溶至25ml，配制成2mg/ml的

10、样液，溶液过微孔滤膜，等待进针。3）HPLC检测方法：色谱柱：岛津VP-ODS（5um，250mm4.6mm）；流动相：A相：0.5%冰醋酸+3%乙腈+水 B相：0.5%冰醋酸+30%乙腈+水；柱温：28；流速：1ml/min；检测波长：280nm ；检测时间：60min。液相梯度洗脱条件： Time=0 B=0% Time=50.01 B=0% Time=45 B=100% Time=60 B=0% Time=50 B=100% Time=0 Stop4）茶黄素含量计算：-公式（2.1）3结果与分析3.1检测结果3.1.1茶黄素的对照品图谱按照2.2检测方法，分析检测茶黄素单体对照品，检测H

11、PLC图谱图3.1所示：图3.1茶黄素4种单体对照品HPLC检测图谱由图3.1不难发现，4种茶黄素单体对照品出峰时间依次为30.005、42.697、53.102、57.027min，详细的样品浓度与对应出峰积分面积如表3.1所示。表3.1茶黄素单体对照品进样浓度及对应峰面积单体保留时间 RT峰面积area进样浓度 mg/mlTF130.00540500510.240TF2A42.69744525480.325TF2B53.10210711100.135TFDG57.02768473700.4603.1.2酶促发酵茶黄素浓度检测结果将按照2.1操作方法制备茶黄素溶液冷冻干燥，获得茶黄素粉末样品

12、按照2.2操作方法进行HPLC检测，检测茶黄素浓度含量如表3.2。表3.2酶促法制备所得茶黄素样品HPLC检测结果样品检测物质保留时间样品峰面积对照品峰面积对照品浓度样品浓度茶黄素总浓度水相25%洗脱TF130.5320800940500510.240 0.01233 0.0387 TF2A43.2117586744525480.325 0.01284 TF2B53.586773810711100.135 0.00854 TFDG57.787402868473700.460 0.00497 水相70%洗脱TF130.7465328840500510.240 0.03871 0.0804 TF2

13、A43.6427165544525480.325 0.01983 TF2B54.1711031210711100.135 0.01390 TFDG58.5011835568473700.460 0.00795 乙酸乙酯相TF130.3886890240500510.240 0.05149 0.1372 TF2A43.0653251144525480.325 0.03887 TF2B53.4120898710711100.135 0.02634 TFDG57.6430575968473700.460 0.02054 结合表3.2检测结果，通过公式（2.1）计算可得茶黄素的含量分别是25%洗脱，1

14、.94%；70%洗脱，2.02%；乙酸乙酯相，6.86%。由此可以发现茶黄素主要集中在乙酸乙酯相，这也是下一步想着重研究的关键环节。4总结与讨论通过酶促法制备茶黄素工艺进行试验，制得了茶黄素，说明酶促法制备茶黄素这一工艺是可行的。检测结果表明制备得到的茶黄素主要集中乙酸乙酯相中， 含量可达6.86%。整套酶促法制备茶黄素的工艺虽然只得了茶黄素，但是相对来说，其含量还是较低，还需继续研究调整有关参数， 提高茶多酚向茶黄素的转变率，这就有待进一步的研究下去。现代化学、生物学和医学实验提高技术和深入研究发现不同的茶黄素具有不同的化学结构，鉴于绿茶中儿茶素类化合物的许多生物活性物质主要源于它们酚羟基结

15、构的抗氧化活性；从化学结构上看，茶黄素类物质含有较多的酚羟基团，因此，茶黄素类物质相比儿茶素类可能有更强的生物活性10。茶黄素制备方法目前有化学氧化和酶促氧化两种，前者不符合生态保护的要求，副产品复杂，产品纯度较低，而后者解决了上述问题并能提高茶黄素的得率，因此今后酶促氧化法是制备茶黄素的理想方法。虽然本文中以绿茶鲜叶浆及梨汁做为酶源，采用体外氧化中酶促法来制备茶黄素的方法，制得的茶黄素的量不大，但是从长久来看酶促法制备茶黄素今后必将和定向固定化酶技术等成为研究热点，另外，利用微生物定向发酵产生茶黄素也将是生产茶黄素的趋势。茶黄素的纯化以Sephadex LH-20柱层析法和高速逆流色谱法研究

16、的最为深入，如何将两者有机的结合起来将是未来研究主要方向。参考文献1袁祖丽，刘秀敏，李华鑫，孙晓楠应用于茶学领域的植物生物技术J安徽农业科学，2008，36(12)：90932李适，黄建安，刘仲华茶黄素体外氧化制备方法的影响因子研究进展J茶叶通讯，2005，32(2)：36393王坤波，刘仲华，黄建安儿茶素体外氧化制备茶黄素的研究J茶叶科学，2004，24(1)：53594黄海涛，屠幼英儿茶素体外氧化制取茶黄素的研究进展J中国茶叶，2003，(6)：15165谷记平，刘仲华，黄建安，施兆鹏酶性氧化合成茶黄素条件优化的研究J茶叶科学，2006，26(4)：2852906黄建琴，王文杰，丁勇等冷冻萎凋对工夫红茶品质的影响N中国茶叶试验研究，2005，(2)：18197王坤波，刘仲华，赵淑娟，傅冬和等.梨多酚氧化酶同工酶组成及其对茶黄素合成的影响J湖南农业大学学报(自然科学版)，2007，33(4)：4594628张建勇，江和源，江用文茶黄素的酸性氧化形成研究J食品科学，2008，(11)：50569毛清黎，朱旗，刘仲华，施兆鹏红茶发酵中pH调控对多酚氧化酶活性及茶黄素形成的影响J湖南农业大学学报(自然科学版)，2005，31(5)：524-52610Robertson(李名君译)理化因素对茶儿茶素体外氧化的影响J国外农学茶叶，1984，(3)：1725