380.A毒死蜱降的微生物降解及中间产物分析 论文正文.doc

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1、 工程大学本科毕 业 设 计（论文）专 业： 生物工程题 目：毒死蜱的微生物降解及中间产物分析作 者 姓 名： 导师 及 职称： （教授）导师所在单位： 工程大学 二零一零年五月二十六日毒死蜱降解菌株的降解谱及中间产物分析摘 要 随着世界范围内农药的广泛使用尤其是毒死蜱类有机磷农药的应用，使得农药污染成为环境污染的一个重大问题。本课题（毒死蜱降解菌株的降解谱及中间产物分析）有利于解决农药污染问题，为其提供新的思路和方法。研究毒死蜱降解菌株的降解谱及中间产物的分析在微生物农药降解领域有重要的研究和实践意义，中间产物的分析更是有利于深刻认识农药降解的整个过程。本论文实验中知，该实验中的毒死蜱降解菌

2、株对毒死蜱降解能力较强,对50 mg/L的毒死蜱最高降解率达73.97%,可为构建基因工程菌提供菌种资源,具有良好的研究价值和应用前景。在通过对pH值、底物浓度等环境因子进行单因素多水平实验,得出该降解菌株在30、pH 7.5、底物浓度50 mg的条件下具有最佳降解性能。该降解菌株与已报道的毒死蜱生物降解的机理相同，都是将毒死蜱降解为TCP，且TCP都有不同程度的积累。对于毒死蜱的环境污染治理，可以在毒死蜱污染区域混合培养毒死蜱降解菌和TCP降解菌，以期提高环境污染的治理效率和治理效果，将毒死蜱完全降解为对环境、生物都无污染、无破坏、无毒的化合物。也可以通过诱变筛选出能够高效、广谱降解毒死蜱等

3、农药的变异降解菌株，以提高降解效果。关键词：毒死蜱；降解；中间产物A B S T R A C T With the widespread use of pesticides around the world, especially organophosphorus pesticide chlorpyrifos application class，it make pesticide pollution is a major problem of environmental pollution. This issue help to resolve the pesticide pollution

4、of Chlorpyrifos-degrading bacteria and degradation of spectral analysis of intermediate products, it provide new ideas and methods for the pesticide degradation. The degradation of chlorpyrifos-degrading bacteria and intermediate spectral analysis have important research and practical significance i

5、n the field of Microbial degradation of pesticides. Analysis of the intermediate products is conducive to a profound understanding of the whole process of degradation of pesticides.From the thesis experiment, the experimental strains in the degradation of chlorpyrifos chlorpyrifos degradation strong

6、 .It rate 73.97% on the 50 mg / L of chlorpyrifos highest degradation. Construction of genetically engineered bacteria can provide strain resources, good research value and application prospect. Through on pH, substrate concentration and other environmental factors more than the level of single fact

7、or experiments, the degradation of strain obtained in 30 , pH 7.5, substrate concentration of 50 mg has the best under the conditions of degradation. The strains with the reported degradation of chlorpyrifos degradation mechanism of the same biological. The chlorpyrifos is degradation to TCP,and TCP

8、 has a different degree of accumulation.Chlorpyrifos contaminated areas in the mixed culture of chlorpyrifos and TCP degrading bacteria degrading bacteria for controling chlorpyrifos in environmental pollution and to in order to improve efficiency and control of environmental pollution control effec

9、t. Chlorpyrifos will be completely degraded and it will be no pollution,no damage,no-toxic compounds for the environment and the living things. Also mutation can be screened by high efficiency, broad-spectrum pesticides such as variations in degradation of chlorpyrifos-degrading bacteria to enhance

10、degradationKeyword: Chlorpyrifos; Degradation; Intermediates目录摘要ABSTRACT目录插图清单表格清单引言1第1章：绪论21.1 毒死蜱降解研究背景及研究意义21.2 毒死蜱研究发展现状21.2.1 毒死蜱的理化性质及毒性21.2.2 毒死蜱的应用发展现状31.2.3 毒死蜱降解的研究发展现4第2章：实验材料与方法62.1 实验药品与试剂62.2 实验仪器与设施62.3 实验方法步骤72.3.1 配制毒死蜱降解菌的培养基72.3.2 制备缓冲溶液72.3.3 制备毒死蜱降解菌菌悬液72.3.4 毒死蜱降解中间产物分析体系72.3.5

11、 毒死蜱的微生物降解特性分析体系8第3章：实验结论与分析93.1 毒死蜱标准曲线的绘制93.2 毒死蜱微生物降解特性分析研究93.2.1 初始pH值对毒死蜱降解的影响93.2.2 外加碳源浓度对毒死蜱降解的影响103.2.3 毒死蜱初始浓度对毒死蜱降解的影响103.2.4 接种量对毒死蜱降解的影响113.2.5 培养温度对毒死蜱降解的影响123.2.6 摇床转速对毒死蜱降解的影响123.3 毒死蜱降解中间产物分析13结果与讨论15致谢16参考文献17插图清单图1-1 毒死蜱化学结构式2图3-1 毒死蜱标准曲线9图3-2 初始pH值对毒死蜱降解的影响9图3-3 外加碳源浓度对毒死蜱降解的影响10

12、图3-4 毒死蜱初始浓度对毒死蜱降解的影响11图3-5 接种量对毒死蜱降解的影响11图3-6 培养温度对毒死蜱降解的影响12图3-7 摇床转速对毒死蜱降解的影响12图3-8 24h降解的未加菌的对照13图3-9 24h降解的加菌的样品13图3-10 48h降解的未加菌的对照13图3-11 48h降解的加菌的样品14图3-12 72h降解的未加菌的对照14图3-13 72h降解的加菌的样品14图4-1 毒死蜱的降解过程15表格清单表1-1 毒死蜱在各种溶剂中的溶解度（25）2引言毒死蜱农药作为一种高效低毒的广谱性有机磷杀虫剂，其为世界农业实现粮食增加以满足世界人口不断增长的需求作出了重大的贡献。

13、农药在世界范围的广泛使用也对世界环境产生了严重的污染。尤其，有机氯农药在环境中的残留和生物蓄积对各种生物和非生物目标都具有严重的潜在毒性。虽然毒死蜱类有机磷农药的降解速度比有机氯农药快，但是由于它们有能力抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）而具有急性毒性。乙酰胆碱酯酶可作为一种神经传递调节酶，可在交界处的突触降低乙酰胆碱的浓度。当AChE在突触灭活，例如通过一种有机磷农药，乙酰胆碱的浓度在突触的浓度仍然很高，肌肉或神经纤维持续发生刺激，最终导致衰竭和抽搐1。毒死蜱的残留和降解一直是人们关注的问题。国内外科学家们对毒死蜱的降解作了许多的研究，生物降解尤其是微生物降解作为一类降解毒死蜱的有效方法日益成为科

14、学家们关注和研究的焦点。对于毒死蜱的降解产物研究，Me1kle等检测到了O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯和3，5，6-三氯-2-吡啶酚(TCP)两种产物。Custavo等检测到了O，O-二乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)磷酸酯，O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫逐助磷酸酯和TCP三种产物。Walia等检测到了O,O-二乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)磷酸酯一种产物。申丽等检测到了O，O-二乙基-O-3，5，6-三氯-2-吡啶基)磷酸酯，O，O-二乙基-O-(5，6-二氯-2-毗陡基)硫代磷酸酯，O，O-二乙基-O-(5-氯-2-吡啶基)

15、硫代磷酸酯，O，O-二乙基-O-2-吡啶基磷酸酯，和TCP五种产物。Jalal检测到了二乙基磷酸酯，三乙基磷酸酯，O，O，O三乙基硫代磷酸酯，O，O-二乙基-O-甲基-硫代磷酸酯，二乙基-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯，2，3，5-三氯-6-O-乙基吡啶，2，3，5-三氯吡啶，和TCP七种产物。也有研究只检测到了TCP一种产物。本实验论文主要研究毒死蜱降解菌株对毒死蜱的降解以及对微生物降解毒死蜱的中间产物的分析。研究微生物对毒死蜱的降解效果，分析微生物降解毒死蜱产生的中间产物，有利于分析研究微生物降解毒死蜱的降解过程，从而掌握微生物降解毒死蜱过程中各种物质的变化，为进一步研究毒死蜱

16、的微生物降解提供研究基础，为世界范围内解决毒死蜱残留和降解问题的新方法和措施提供可能。第1章 绪论11 毒死蜱降解研究背景及研究意义 毒死蜱是一种广谱性有机磷杀虫剂，是目前世界上杀虫剂中销售额最大的品种，是陶氏化学公司于1965年在美国登记推广并获得专利。也是目前全球应用最广泛的五种杀虫剂之一。其被世界卫生组织分成卫生类和农用类两个类别，分别用来作卫生杀虫剂和农用杀虫剂2。毒死蜱于1997年在我国取得了正式登记。本论文实验主要利用微生物对毒死蜱的降解作用，研究某种毒死蜱降解菌株对毒死蜱的降解作用以及对其他农药降解能力的分析，研究该菌株对毒死蜱降解的降解过程和降解谱，并对其降解中间产物进行分析。

17、本实验有利于深刻了解和研究毒死蜱降解菌株对毒死蜱的降解作用及其降解过程，有利于毒死蜱降解过程中产物的研究，对毒死蜱降解菌株降解毒死蜱的过程研究及目前毒死蜱污染问题的解决具有深刻的研究意义和实践意义。1.2 毒死蜱研究发展现状1.2.1 毒死蜱的理化性质及毒性毒死蜱（chlorpyrifos）,又名乐斯本、白蚁清，其有效成分的化学名称为O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯，化学结构式为：图1-1 毒死蜱化学结构式纯品毒死蜱为白色或者灰色颗粒状晶体，工业用毒死蜱为淡黄色晶体，有微弱的硫醇味。毒死蜱属中等毒性杀虫剂，原药大鼠急性经口LD50为163/，急性经皮LD50为2g

18、/kg，对试验动物眼睛有轻度刺激，对皮肤有明显刺激，长时间多次接触会产生灼伤。大鼠亚急性经口无作用剂量为0.03mg/kg，慢性经口无作用剂量为0.1mg/kg。狗慢性经口无作用剂量为0.03mg/kg。在试验剂量下未见致畸、致突变、致癌作用。室内空气中最高允许浓度为（TLV）0.1mg/m3。对鱼类及水生生物毒性较高，虹鳟鱼LC50为15mg/L(96小时，72)。毒死蜱密度1.398（43.5），熔点41.5-43.5；汽压为2.5mPa（25），在水中的溶解度为1.2mg/L,溶于大多数的有机溶剂3。详见下表：溶剂水丙酮苯二硫化碳四氯化碳三氯甲烷溶解度0.00012650790590P3

19、10630溶剂乙醇甲醇二氯甲烷二甲苯1,1,1-三氯乙烷溶解度6345400400400表1-1 毒死蜱在各种溶剂中的溶解度（25）1.2.2 毒死蜱的应用发展现状毒死蜱于1965年被美国陶氏化学公司首次开发以来，其作为以前高毒杀虫剂的替代品已经得到广泛的利用。毒死蜱对昆虫具有触杀、胃毒和一定的熏蒸作用, 是一种广谱高效的杀虫、杀螨剂。毒死蜱是一种神经毒剂, 能抑制乙酰胆碱酯酶的活性, 使神经突触部位大量乙酰胆碱积聚, 致使突触后膜不断激活, 神经纤维长期处于兴奋状态, 正常的神经传导受阻, 从而使昆虫中毒致死。毒死蜱在植株叶片上的残留期不长, 但在土壤中残留期较长。1.2.2.1 毒死蜱的应

20、用现状毒死蜱广泛用于防治蝼蛄、蛴螬、地老虎等地下害虫, 喷雾可防治棉花、果树、蔬菜、甘蔗、花卉等作物上的多种害虫及螨类等; 还可以防治蚊、蝇、跳蚤、蜚蠊等卫生害虫; 近年来在桑树上的应用逐渐增多, 已在美国、日本、加拿大、中国等 10 多个国家和地区注册, 同时在非农业中也有所应用。毒死蜱是一种在麦类、水稻、玉米、棉花、甘蔗、果树等多种作物上普遍使用的高效广谱杀虫剂, 对防治小麦吸浆虫和地下害虫等都有较好效果。1.2.2.2 毒死蜱等有机磷杀虫剂的特点由于有机磷杀虫剂的品种繁多，性能也千差万别，但作为杀虫剂使用，它们都有一些相同的特点。有机磷杀虫剂对害虫包括螨虫都有较强的毒力，其一般在气温较高

21、时，表现出较高的杀虫效力，而且害虫对有机磷的耐药性发展较为缓慢。有机磷类杀虫剂一般对作物安全，易降解（分解成无毒物质），对环境污染小。在植物体内可代谢降解而解毒，在植物体表面可经日晒及风雨的作用而分解，因而在农产品中残留量低。在动物体内易降解而排除体外，无积累，对人畜无蓄积毒性。绝大多数品种的有机磷杀虫剂遇碱易分解。品种繁多的有机磷杀虫剂因为其多种多样的种类，它们的杀虫谱也又宽又窄。有机磷杀虫剂的杀虫作用方式多样，能适应多方面的需要。大多数品种具有触杀和胃毒作用；某些品种具有熏蒸作用如敌敌畏；若干品种具有内吸作用，是很好的内吸杀虫剂，如乐果等；更多的品种具有不同程度的内渗作用。不同品种的有机磷

22、杀虫剂其毒性差异也较大。有些品种毒性很低，如马拉硫磷，辛硫磷；但多数品种的毒性偏高，有的品种剧毒，如甲拌磷，甲胺磷，致螟磷等。1.2.2.3 毒死蜱的残留毒性及污染现状 毒死蜱在叶片上的残留期因不同作物而异, 各种作物收获前停止用药的安全间隔期, 棉花21d, 水稻7d, 小麦10d, 甘蔗7d, 大豆14d, 花生21d, 玉米10d, 叶菜类7d4。Lee 5等研究了大米在煮前和煮后的毒死蜱含量, 结果表明, 煮前用水洗大米, 能够去除60%的毒死蜱;煮熟后, 大米中还残留占总药量30%的毒死蜱。OByme 等研究了不同的食品加工方法中毒死蜱的残留情况, 结果表明, 通过煮、烘烤和加工成罐

23、头三种方法加工的食品,毒死蜱残留量为煮加工成罐头烘烤。Yen 等对三种土壤进行的实验结果表明, 土壤温度从25升到35,毒死蜱的半衰期分别从28、15、12d 降到2、3、7d。毒死蜱具有较高的急性毒性, 是农产品安全性问题重点关注的农药品种之一, 在对外贸易中是农药残留检测的主要项目6。关于毒死蜱的环境行为研究报道很多: 毒死蜱对人的神经系统和脑发育会有一定影响, 对儿童有潜在的健康危害; 毒死蜱的广泛应用对环境造成了严重的污染。目前以鼠为对象研究毒死蜱对人体的毒害作用也正成为人们研究的热点7; 美国环境保护局官员Browner 指出, 毒死蜱在土壤中的降解受土壤温度、湿度、毒死蜱的浓度、土

24、质、微生物活动等影响较大。由于毒死蜱使用范围及用量的不断扩大, 毒死蜱在环境中的转归不容忽视。1.2.3 毒死蜱降解的研究发展现状1.2.3.1 光化学降解农药施用以后，无论是残留于植物表面还是进入土壤、水体或大气，均会因受到太阳辐射，而发生光化学降解。其实质是化合物接受光辐射能量后，光能转化到化合物分子键上，使农药中的C-C、C-H、等键断裂而发生内部反应的过程。毒死蜱在自然光下的半衰期约为34周，降解比较缓慢，但自然界中大量存在的腐殖质等光敏剂能显著加速其光解速率8。另外，其他农药和表面活性剂也影响光解速率。岳永德等研究发现:毒死蜱在玻片表面的光解半衰期为42.62h,抗蚜威、丙烯菊酯对毒

25、死蜱的光解有显著的加速光解作用；林丹、氟氯菊酯、杀螟松对毒死蜱有显著的延缓光解作用,6种表面活性剂中,2201、0201、JFC对毒死蜱的光解有显著的加速光解作用。虽然光解是农药在环境中消解的主要途径之一，但它受到光照的限制，一般只发生在表层水、土壤中，光解半衰期是34周9。1.2.3.2 水体中的降解虽然毒死蜱农药目前一般不会直接用于水体，但农药施用以后，一部分会通过径流、渗漏、冲刷等途径进入水体，严重威胁着水体的质量。另外，残留在土壤中的农药也因土壤中所含的水分而发生降解。在开放的水体中，毒死蜱的浓度和持久性主要根据剂型的不同而有所差异。例如，在施用于开放水体中时，乳剂和可湿性粉剂使水体中

26、毒死蜱浓度趋于增加的现象。当农药被吸附到沉淀物上时，浓度又迅速下降。微粒剂和缓释剂则不会增加浓度，且持久性时间增长。毒死蜱进入淡水或海水中，主要是喷雾或者是土壤微粒携带进入。在水中，毒死蜱迅速被悬浮沉淀物和底部物质吸附。蒸发是毒死蜱减少主要的途径。蒸发半衰期是3.520d。研究还表明，这类杀虫剂在水体中是不稳定的。水解速率随温度升高而增大，每降温10，速率降低2.53倍。在酸性-中性水中，水解速率变化不大。但在碱性水中，速率呈增加趋势10。另外，农药本身的浓度也影响其水解速率，60d内高浓度时水解速率明显小于低浓度时的水解速率。由此看出毒死蜱在环境中的水解速率除受所属环境条件的影响外,还受农药

27、初始浓度的制约。1.2.3.3 土壤的吸附土壤颗粒能强烈吸附毒死蜱农药，不易水解。在土壤中，毒死蜱表现出了很强的稳定性。不易透过土壤层，污染地下水，在粘土和粘性砂土中不容易移动。土壤对毒死蜱的主要降解产物TCP吸附能力不强，毒死蜱在土壤中表现出适当的流动性和持久性。在氧气充足的土壤中，在结构上从砂土到粘土、pH值从5.47.4七种土壤条件中，毒死蜱的半衰期从11141d。毒死蜱在高pH值下不稳定，半衰期不受土壤结构、有机质浓度影响。在缺氧土壤中，在砂土中的半衰期为15d，粘土中的半衰期为58d。土壤中吸附的毒死蜱将被光解、化学水解、微生物降解等。在潮湿的土壤中，毒死蜱的有效半衰期为45163h

28、。另有研究表明，在施药30d后，2.6%9.3%的毒死蜱分别残留在砂土和疏松的土壤中。毒死蜱在土壤中的半衰期一般为60120d，但根据土壤类型、气候和其他条件的不同，其半衰期可缩为2周或延续到1a以上11。1.2.3.4 毒死蜱的生物代谢降解（一） 植物上的消解有研究表明，植物可从土壤或水系统中富积毒死蜱。植物富积毒死蜱后具有毒性，如莴苣等。且这种杀虫剂及其在土壤中的代谢物可能会加速其自身在一些作物上的富积。通过实验发现毒死蜱在大棚青菜上的降解速度明显慢于在露地青菜上的降解12；在研究毒死蜱在水稻上的消解实验中发现:毒死蜱能有效防治一些钻蛀性害虫是由于具有一定的渗透性能。（二） 毒死蜱在人和动

29、物体内的代谢降解毒死蜱主要分布在动物肝脏、肾脏、脾脏等血流量高的器官。毒死蜱无生物蓄积性，经皮吸收极少。经皮给药量是口给药量的10倍时，血液浓度也只有经口吸收的1/15。不同动物类型对毒死蜱的积累能力也不同13。在研究海洋动物对农药的富积实验中发现，富积能力由大至小顺序：小弹涂鱼、实验贝类、褶痕相手蟹。不同动物对毒死蜱的降解能力各不相同，弹涂鱼的降解能力最强，毛蚶次之，波纹巴非蛤和文蛤的降解能力较差。在研究鲮鱼对毒死蜱的代谢时发现：鲮鱼能迅速富集水中的农药而达到最高值，随后浓度明显下降。各器官组织的峰值高低顺序为：内脏团整体鳍眼剩余部分肌肉。（三） 微生物降解大量的毒死蜱降解研究表明,利用微生

30、物及其产生的降解酶对环境中农药残留的去除与净化是治理农药污染的有效方法,并已显示了良好的应用前景。从受农药污染严重的土壤或水体筛选、分离具有优良性状的菌种是目前采用最多的一种方法14。有关毒死蜱微生物降解的研究已经取得一定进展,筛选和分离出了一些降解毒死蜱的微生物。报道最早的毒死蜱降解微生物是从施用二嗪农和对硫磷的土壤中筛选出来的,它们通过共代谢作用降解毒死蜱,不能以毒死蜱为唯一碳源。有学者将前人找到的降解对硫磷等的黄杆菌(Flabobacterium sp.)和节杆菌(Arthrobacter sp.)用来降解毒死蜱,取得了良好的效果。此外还有很多降解菌的报道。国内对毒死蜱的微生物降解起步较

31、晚,但发展比较迅速。杨丽从蔬菜大棚土壤中分离到一株能以毒死蜱为唯一碳源和能源生长的菌株DSP3,该菌在土壤实验中20d对毒死蜱(100mg/kg)的降解率接近100%15。Mallick16等分离到的降解对硫磷等的微生物Flabobacterium sp.Arthrobacter sp用来降解毒死蜱,取得了良好的效果。李晓慧从长期受毒死蜱污染的污水处理池中分离到一株毒死蜱高效降解菌株,该菌株能在24h内完全降解100 mg.L-1的毒死蜱。王金花等从污水排放口污泥中分离到三株以毒死蜱为唯一碳源生长的真菌WZ-、WZ-和WZ-鉴定均为镰孢霉属(FusariumLK.exFx),三株菌5 d内对5

32、0 mg/L毒死蜱的降解率分别高达93.5%、91.4%和83.5%17。Getzin LW18在4种土壤中进行的毒死蜱降解实验中,用14C标记毒死蜱,结果表明,毒死蜱经土壤微生物降解,初步降解产物为3,5,6-三氯-2-吡啶酚(TCP),最终降解产物为CO2。刘新等从连续使用毒死蜱的土壤中分离了1株可降解毒死蜱的真菌曲霉Y,该菌还对甲胺磷有较强的降解能力,对乐果有一定的降解能力19。第2章 实验材料与方法2.1 实验药品与试剂磷酸二氢钾（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钾（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司无水氯化钙（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司无水硫酸镁（分析纯） 国药集团

33、化学试剂有限公司七水合硫酸亚铁（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司氯化钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司无水硫酸钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司牛肉浸膏（生化试剂） 国药集团化学试剂有限公司蛋白胨（生化试剂） 国药集团化学试剂有限公司丙酮（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司二氯甲烷（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司冰醋酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司甲醇（色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司乙腈（色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司硫酸铵（分析纯） 中国医药（集团）上海化学试剂公司磷酸氢二钠（分析纯） 中国医药（集团）上海化学试剂公司磷酸二氢钠（分析纯） 中国医药（集团）上海化学

34、试剂公司琼脂毒死蜱标准品（100g/L）48%毒死蜱乳油88%TCP原粉（工业纯）实验室提供的毒死蜱降解菌株A2.2 实验仪器与设施TD5Z台式低速离心机 湖南凯达科科学仪器有限公司HH-2恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司BS-IEA振荡培养箱 國華電器DHG-9143BS-电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂气相色谱检测器 日本岛津质谱仪 日本岛津全塑防腐通风柜 南京航宇建筑配套工程有限公司无菌工作台冰箱 三菱公司pH精密试纸 上海三爱思试剂有限公司定性滤纸 杭州新华纸业有限公司0.22m水系膜细菌过滤器DR79045

35、 20-200L移液枪 芬兰DRAGONMED500ml锥形瓶 酒精灯250ml锥形瓶 接种环烧杯 移液管玻璃棒 试管培养皿 漏斗针筒注射器 容量瓶BP211D电子天平 色谱柱2.3 实验方法步骤2.3.1 配制毒死蜱降解菌的培养基2.3.1.1 牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 3g； 蛋白胨 10g；氯化钠 5g；琼脂 20g；蒸馏水 1000mL；pH 7.07.22.3.1.2 富集培养基牛肉膏 3g； 蛋白胨 5g；氯化钠 5g；蒸馏水 1000mL；pH 7.07.22.3.1.3 基础培养基（无机盐培养基）0.4g MgSO47H2O, 0.002gFeSO47H2O, 0.2gK2HP

36、O4, 0.2g(NH4)2SO4, 0.08gCa SO4,蒸馏水 1000mL, pH 7.07.2(以上培养基均在121下高压蒸汽灭菌锅内灭菌30min)2.3.2 制备pH=7.2的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液72mL 0.2mol/L Na2HPO4溶液+28mL 0.2mol/L NaH2PO4溶液2.3.3 制备毒死蜱降解菌菌悬液把菌种接菌于牛肉膏蛋白胨培养基上，活化3天后，将菌苔用接种环刮下，接种于富集培养液上，24h后，离心（5000r/min,15min），弃取上清液，收集菌体。然后将菌体用磷酸缓冲液洗涤3次，最后再用缓冲液制成菌悬母液。2.3.4 毒死蜱降解中间产物分析体系2.3.4.