1702.小刺猴头菌发酵工艺优化研究.doc

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1、小刺猴头菌发酵工艺优化研究摘 要药用真菌是指对疾病有治疗、预防或抑制作用以及对人体有保健作用的一类真菌。由于目前我国中药无序开发，资源枯竭，生物多样性锐减，多数药用真菌的天然资源稀缺。人工栽培由于生长期长，受外界环境因素影响大，难以满足社会需求。而液体发酵技术简易可行，因此药用真菌的液体发酵技术成为了中药研发的一个重要方向。小刺猴头菌也属于药用真菌，目前已有以小刺猴头发酵浸膏为原料治疗慢性胃炎的制剂应用于临床。过去对小刺猴头子实体多糖在化学结构，药理作用等方面进行了系统的研究，结果表明：小刺猴头子实体多糖可明显抑制胃窦及胃体粘膜的萎缩变薄，增加胃蛋白酶消化活性，降低血清胃泌素含量。由此可见，对

2、于小刺猴头菌的需求将日益增多。本文系统研究了小刺猴头菌的液态发酵培养基及发酵条件。结果显示，小刺猴头菌的最优培养条件是25，150ml装量，150r/min，pH5.5，接种20%，培养7天；最优的碳源是葡萄糖，最优的氮源是酵母膏；最优的培养基是葡萄糖4%，小麦粉2%，酵母膏3%，麸皮1.5%，KH2PO4 0.15%，MgSO47H2O 0.075%，VB1 0.1%。本研究为今后小刺猴头菌的大规模工业化生产奠定了基础。AbstractMedical Fungi are kinds of fungi possessing disease treatment as well as human

3、health care. Because of the disorderly development of Chinese medicine in China, the exhausted resources and the sharp drop in biodiversity, Most of the natural resources of medicinal fungi are rare. Cultivation can hardly meet the needs of society for its long growth cycle and being easily affected

4、 by outside environmental factors. However, the liquid fermentation technology is simple and feasible. In this case, the study on the fermentation technology of medical fungi has become an important direction in Chinese medicine research and development. Being one kind of medical fungi, the Hericium

5、 Caput-medusae has its own medical worth. Now there are clinical preparations made of Hericium Caput-medusaes fermentation extract treating chronic gastritis. The past research on the chemical structure and pharmacological effect of polysaccharides from fruiting bodies of Hericium Caput-medusae indi

6、cates that the polysaccharides from fruiting bodies of Hericium Caput-medusae can inhibit the atrophy of gastric antrum and gastric mucosa, increase the digestive activity of pepsin, and lower the levels of serum gastrin. This shows that the need for Hericium Caput-medusae is growing continuously. W

7、e studied on the fermentation technology of Hericium Caput-medusae in order to increase the product, preparing for its large-scale industrial production. The final results showed that the optimal conditions for cultivation are 25, 150ml capacity, 150 r/min, ph 5.5, 20% inoculation, 7 days; the optim

8、al carbon source is glucose and the best source of nitrogen is yeast extract; the optimal medium includes 4% glucose, 2% wheat flour, 3% yeast extract, 1.5% bran, 0.15% KH2PO4, 0.075% MgSO47H2O, and 0.1% VB1.第一章 前 言1.1 药用真菌1.1.1 中国药用真菌概况在自然界现存的真菌大约有20-25万种，我国至少有10万余种，已报道的有8000种左右。传统药用及经试验证实具有药效的真菌已超

9、过400种，主要集中在担菌亚门和子囊菌亚门，虽其种类繁多，大小不同，形态各异，但一般都是由菌丝体和子实体两大部分组成1。菌丝体是药用真菌的营养器官，由许多菌丝集合而成，多呈丝状或须状，广泛存在于土壤、树木等各种基质中，相当于高等植物的根、茎、叶。子实体是药用真菌的繁殖器官，相当于高等植物的花、果，是药用真菌产生孢子的机构2。药用真菌是指能治疗疾病、具有药用价值的一类真菌，即在菌丝体、子实体、菌核或孢子中能产生氨基酸、维生素、多糖、甙类、生物碱、甾醇类、黄酮类及抗生素等多种物质，对人体有保健作用，对疾病有预防、抑制或治疗作用的真菌。组成药用真菌的化学成分与其它生物基本相似，主要是水、蛋白质、核酸

10、、碳水化合物、脂类及各种无机盐类3,4。我国的真菌资源非常丰富，真菌是寻找新的抗生素和抗菌素等药物的宝贵资源库。真菌等微生物在长期的生物进化过程中，为抗拒外来物侵袭以及适应外界环境产生了大量的化学防御物质和生长调节物质。现有的研究结果表明，已知对肉瘤和艾氏癌抑制率达60%-100%的真菌有近300种，且大多数真菌抗肿瘤活性物质是具有特定结构的多糖和蛋白结合的多糖体5，把传统中医药和民间用药积累的宝贵经验与现代科学技术手段紧密结合，从丰富的真菌资源中寻找新的物质资源，更好的发挥它在中医药中的作用，是真菌开发的主要方向之一。1.1.2 药用真菌的开发前景和展望自1929年英国的阿历山大、弗莱明发现

11、青霉素的抗菌作用以来，世界上利用真菌作为新的医药资源的研究工作进展很快。我国从20世纪50年代开始首先对麦角进行了研究，近几十年来，先后对灵芝、猪苓、茯苓、冬虫夏草等药用真菌的化学、药理和临床开展了较深入的研究。通过比较逐步了解了不同种类的药用真菌及其在不同发育阶段如子实体、菌丝体、孢子体所含的有效成分或有效组分，为提高临床疗效、改进生产工艺、改造药物剂型提供了理论依据。随着人类社会的发展，人们越来越普遍地认识到天然药物的重要性，药用真菌以其多方面的生物活性和安全无毒副作用的特点而备受青睐，药用真菌的合理开发和利用，以及有效的保护便成了科技工作者关注的热点，特别是真菌多糖的开发、研制工作发展得

12、很快，不仅研制出一系列药品和保健品，而且在传统的丸、汤剂基础上又开发了针剂、冲剂、片剂、胶囊、糖浆乃至保健口服液、饮品、速溶茶、酒饮料等各种产品。我国真菌资源丰富，具有很大的开发潜力，近年来许多学者对资源进行考察发掘，有一些新的药用真菌得到了深入研究并投入生产，但是从总体上来说，该学科发展还是较慢，研究力度不够，直至2000年版药典收载的药用真菌只有7种6。虽然我国在药用真菌的应用方面有着悠久的历史，但从目前生产情况看，生产技术、设备、管理水平及产量等，与一些发达国家相比仍有较大差距。所以，我们应该继承和发扬我国药用真菌生产与应用的丰富经验，在发展药用真菌的同时，注意培养世界一流水平的高科技专

13、业人才，继续加强对药用真菌的科学研究工作，不断培育出产量高、质量好的优良菌株，改进栽培管理技术，努力提高药用真菌的生产能力，以适应市场发展的需要。传统中药中所用的药用真菌多半是子实体或是菌核，我国药用真菌目前主要依靠野生资源，今后真菌学和医学工作者要在驯化新品种、开发新产品以及在真菌药制剂等的药理、入药途径和生产制作标准上加强工作。而多数药用真菌不能进行人工驯化，所以今后人工驯化栽培是十分重要的工作，同时也要不断提高液体和固体发酵技术，完善生产工艺。药用真菌的医疗价值和保健作用已引起世界各国的广泛重视。随着世界各国对药食用真菌需求量的不断增长，我国必将成为世界药食用真菌的生产大国、出口基地和重

14、要的消费市场。今后我们应着重加强对药用真菌的化学和药理学方面的研究，不断开发新产品、开拓新市场，使我国的药用真菌产品走向世界，为人类健康作出更大的贡献。1.1.3 小刺猴头菌简介小刺猴头菌Hericium caput-medusae (Bull : Fr.) Pers.隶属菌物界(Kingdom Fungi)，担子菌门(Basidiomycota)，层菌纲(Hymenomycetes)，猴头菌科(Hericiaceae)，猴头菌属(Hericium)。子实体小或中等。直径5-10cm，肉质，基部着生于树木上，密被针刺，形成球形或帽状，初期雪白色，后变为浅褐灰色，刺长1-2cm，锥状，开始直，细

15、长而下垂，上部的刺常扭曲。菌柄部即基部很短，长1.5-2.5cm，不发育或膨大成菌盖的一部分。菌肉白色，纤维质，松软，味甘。孢子5-7m4-6m，近球形，透明无色，光滑。在夏季生长于阔叶林内腐树枝干上。主要分布在河北、河南、吉林、辽宁、黑龙江、内蒙古、四川等省。此菌可食用，其味比较鲜美，稀有，是我国名贵的一种食用菌。发酵提取物主要含有多糖、单糖、蛋白质及氨基酸，还含有少量的生物碱、甾醇和脂类等成分。猴头菌在民间被称为“山珍”，是一种珍贵的药膳两用菌1。据刘波中国药用真菌（1978）记载：“猴头菌性平，味甘，能利五脏，助消化，滋补，抗癌，治疗神经衰弱。”因其具有抗菌、抗肿瘤及免疫调节作用，对胃炎

16、、胃溃疡及胃癌等消化系统炎症具有较好的治疗效果7-13，因此栽培量日益增大。在栽培过程中，通常以棉籽壳、木屑、玉米芯、酒糟、麸皮及米糠等为原料制备培养基，并主要采用塑料袋培养14。近年来对猴头菌的研究报道较多，临床应用猴头子实体及菌丝体提取物治疗消化性溃疡，萎缩性胃炎均有较好效果15-18。药理研究证明，猴头子实体及菌丝体多糖具有明显的免疫调节作用，能增强巨噬细胞的吞噬能力，促进溶血素生成，对荷瘤小鼠NK细胞活性有激活效应，对荷瘤小鼠的肿瘤生长有显著的抑制作用19,20。小刺猴头菌作为与猴头菌同属的一种菌种，其化学成分以及药效作用是否与猴头菌相似，目前鲜有报道。一直以来对猴头菌属真菌多糖提取的

17、研究主要集中于猴头菌(Hericium erinaceus)21，但从最近关于小刺猴头菌子实体多糖的提取、分离及纯化的文章不断发表来看22,23，未来这种菌会有很大研究价值。1.2 真菌发酵1.2.1 发酵条件通常来说，真菌培养在25-28，pH5-6，转速150-180 r/min的条件下，培养5-10天均会生长良好24，其它条件可能影响菌的生长，甚至死亡。另外，为了让真菌能够更好地生长，接种量，容氧量也是需要考虑的因素。1.2.2 真菌培养基培养基是适合于微生物生长繁殖的各种营养物质配置而成的营养基质。根据微生物的生理需要，培养基主要成分包括：水分、碳源、氮源、无机元素和生长因子等。真菌等

18、多种微生物在培养基中生长繁殖所共同需要的一些营养物的主要功能如下：一是供给微生物合成体细胞的原生质及其代谢产物所需的氮源与碳源；而是供合成反应及生命活动所需的能量；三是调节新陈代谢作用25。常用的基础营养物质如下。1.2.2.1 蛋白胨蛋白胨是用动物或植物性蛋白质，经过蛋白酶适当的水解，精制而成的蛋白质各种衍生物，如胨、肽及氨基酸等复杂的混合物，其中因胨的含量较多，故名为蛋白胨，是培养细菌、真菌等微生物生长繁殖最好的综合性含氮化合物。蛋白胨吸温性很强，易溶于水，是两性化合物，具有一定的缓冲作用。但因所用蛋白胨的品种不同，水解的酶类和产物不一，以及精制的方法各异，蛋白胨的具体成分、质量及适用对象

19、，都有较大差别，故其效果很不一致，因此使用前应做生化及细菌学的质量检验，符合规定的标准时再选购备用为宜。1.2.2.2 葡萄糖等碳水化合物葡萄糖是很多微生物能量的主要来源，也是合成菌丝体中的糖类、脂类、氨基酸、嘌呤和嘧啶等有机物的碳源。但不同的微生物对糖类的需要差别很大，很多微生物尚需要其它单糖、双糖、多糖或淀粉等作为碳源或能源。在单糖中，以己糖的利用最为普遍，几乎每种微生物都能利用葡萄糖和果糖，甘露糖或半乳糖虽能利用，但一般利用速度较为缓慢；其它己糖能否被微生物所利用，主要决定于微生物体内有无把它们转化为葡萄糖或果糖的酶系。戊糖如木糖、阿拉伯糖的利用不如己糖普遍，但对少数真菌较为适宜。双糖中

20、蔗糖和麦芽糖是微生物普遍能利用的碳源。多糖是单糖或其衍生物的聚合物，广泛存在于谷物、食品、纤维制品中，其中淀粉是大多数真菌都能利用的碳源。1.2.2.3 无机盐类无机盐类在微生物生命活动中的主要功能有：构成菌丝体的成分；作为辅酶或酶的组成部分或维持酶的活性；调节细胞渗透压、氢离子浓度、氧化还原电位等；某些自养微生物可以利用无机盐作为能源。在实验室中，用合成培养基、半合成培养基培养真菌时，一般需加入磷、硫、钾、镁、铁等元素，通常以K2HPO4、KH2PO4、MgSO4及FeSO4等的形式加入，以满足真菌对这几种主要无机元素的需要。1.3 本论文的研究背景及设计思想1.3.1 研究背景药用真菌是指

21、对疾病有治疗、预防或抑制作用以及对人体有保健作用的一类真菌，其药用部位有子实体、菌核菌丝体和发酵液等。由于目前我国中药无序开发，资源枯竭，生物多样性锐减，多数药用真菌的天然资源稀缺；人工栽培由于生长期长，受外界环境因素影响大，难以满足社会需求。而液体发酵技术简易可行，在发酵过程中除菌丝体或孢子大量增殖外，还会产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、酶、核酸、氨基酸、维生素、植物激素等多种具有生理活性的物质，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗溃疡等功效，因此药用真菌的液体发酵技术成为了中药研发的一个重要方向26。液体发酵技术是随着抗生素工业发展起来并运用到药用真菌发酵中的。近年来，药用真菌发酵技

22、术应用越来越广泛，改进发酵条件，提高产物品质，降低发酵成本，是液体发酵研究的重点27。但是目前药用真菌发酵培养还存在一些问题：药用真菌本身不具有抗菌能力，易污染杂菌28；菌种分离过程中菌丝体消亡严重，继代培养难于成活等29。提高药用真菌发酵培养技术必将会为中药新药研发开辟新的道路，拓展更广阔的发展空间，也必将有利于推进中药现代化和国际化进程，提高我国中药行业的国际竞争力，为中药走向世界、造福全人类做出新的贡献。小刺猴头菌系多孔菌目猴头菌科真菌，具有与猴头菌相类似的药理作用及临床功效15-17,20。目前已有以小刺猴头发酵浸膏为原料治疗慢性胃炎的制剂应用于临床30。过去对小刺猴头子实体多糖的化学

23、结构，药理作用等进行的系统研究结果表明，小刺猴头子实体多糖可明显抑制胃窦及胃体粘膜的萎缩变薄，增加胃蛋白酶消化活性，降低血清胃泌素含量。由此可见，对于小刺猴头菌的需求将日益增多，而不同发酵工艺对小刺猴头菌产量的影响则未见报道。为了更好地开发和利用小刺猴头菌资源，我们主要从几个方面对小刺猴头菌液体发酵进行了较为细致的研究，以期为小刺猴头菌工业化液体发酵提供科学依据。1.3.2 设计思想本实验室已经从吉林农业大学购得小刺猴头菌菌种。本研究主要是通过优化小刺猴头菌的液体发酵条件，如培养温度、摇瓶装量、摇瓶转速、接种量、种子培养时间等，来提高小刺猴头菌的产量。然后进一步从多种氮源及碳源中选择相对最合适

24、的组成培养基，从而提高小刺猴头菌的产量。1.3.3 实验流程下面是本实验的实验流程，本论文主要是研究小刺猴头菌的发酵工艺，对其进行优化并争取得到较高的产量，为今后小刺猴头菌的大规模工业化生产做好准备。小刺猴头菌保藏菌种斜面培养斜面母钟摇瓶培养摇瓶菌种转移（1）培养温度的优化 （1）培养基碳源的优化（2）摇瓶装量的优化 二级摇瓶培养（3）摇瓶转速的优化 （2）培养基氮源的优化（4）培养基起始pH的优化（5）接种量的优化 （3）最佳培养基的优化（6）种子培养时间的优化第二章 小刺猴头菌发酵条件的优化2.1 引言通常来说，大部分的真菌都需要相同或相似的培养条件，如温度25-28，pH5-6，转速15

25、0-180r/min等等。但是，这些条件究竟是否适合小刺猴头菌的生长还有待研究。本实验主要对培养温度、摇瓶装量、摇瓶转速、培养基起始pH、接种量以及种子培养时间这六种培养条件进行优化选择，以使小刺猴头菌能够进行最优生长。2.2 实验材料及试剂2.2.1 主要仪器DNP-9162型电热恒温培养箱 上海精密实验设备有限公司DZP-102型恒温振荡器 哈尔滨东联电子技术开发有限公司SCI-BRIDGE型无菌操净台 北京赛伯乐实验仪器有限公司BA210S型电子分析天平 德国Sartorius公司SKG-01型电热恒温干燥箱 湖北黄石医疗器械厂2.2.2 主要试剂葡萄糖 北京化工厂甘露糖 北京化工厂纤维

26、素 北京化工厂谷氨酰胺 北京化工厂尿素(NH2)2CO2 北京化工厂硝酸钾(KNO3) 北京化工厂硫酸镁(MgSO47H2O) 北京化工厂磷酸二氢钾(KH2PO4) 北京化工厂麦芽糖 北京奥博星生物技术责任有限公司蛋白胨 北京奥博星生物技术责任有限公司琼脂 北京奥博星生物技术责任有限公司维生素B1（VB1） 上海惠世生化试剂有限公司酵母膏 英国OXID LTD2.2.3 实验菌种小刺猴头菌保藏菌种（宋猴） 吉林农业大学2.2.3 培养基2.2.3.1 PDA（斜面）培养基31马铃薯（去皮切块） 30%葡萄糖 2%琼脂 2%2.2.3.2 基础（液体）培养基葡萄糖 2%蛋白胨 2%KH2PO4

27、0.15%MgSO47H2O 0.075%VB1 0.1%2.3 实验方法将小刺猴头菌保藏菌种接入PDA斜面培养基，放入恒温培养箱中，25培养7 d。然后从斜面培养基上取4块0.5 cm2等量菌块接种于盛有150ml基础（液体）培养基的500ml摇瓶中，入旋转摇床，转速150 r/min，25震荡培养7d扩种后，将长满小刺猴头菌的一级菌种接入各组实验培养基的二级摇瓶中（接种量约10%），上摇床进行二级摇瓶培养，各组实验均进行两次重复。培养完成后称量菌丝体干重。将发酵液过滤后，用水冲洗干净，置70烘箱中干燥至恒重，用电子天平称重，取两次实验的平均值。2.3.1 培养温度的选择 取5个500ml摇

28、瓶编为1-5号，每个瓶中装入150ml基础液体培养基，高压蒸汽灭菌。按10%接种量将一级菌种中接种于每个摇瓶中；将5个摇瓶分别置于19、22、25、28、31下，150r/min发酵培养7d；称量各个摇瓶中的菌丝体干重。2.3.2 摇瓶装量的选择 取5个500ml摇瓶编为1-5号，分别装入90ml、120ml、150ml、180ml、210ml基础液体培养基，高压蒸汽灭菌；按10%接种量将一级菌种中接种于每个摇瓶中；将摇瓶置于25、150r/min下发酵培养7d；称量各个摇瓶中的菌丝体干重。2.3.3 摇瓶转速的选择 取5个500ml摇瓶编为1-5号，每个瓶中装入150ml基础液体培养基，高压

29、蒸汽灭菌。按10%接种量将一级菌种中接种于每个摇瓶中；将5个摇瓶分别置于50r/min、100r/min、150r/min、200r/min、250r/min下，25发酵培养7d；称量各个摇瓶中的菌丝体干重。2.3.4 培养基起始pH的选择 取5个500ml摇瓶编为1-5号，每个瓶中装入150ml基础液体培养基，高压蒸汽灭菌，然后分别用HCl调pH值为4.5、5、5.5、6、6.5；按10%接种量将一级菌种中接种于每个摇瓶中；将5个摇瓶置于25下，150r/min发酵培养7d；称量各个摇瓶中的菌丝体干重。2.3.5 接种量的选择 取5个500ml摇瓶编为1-5号，每个瓶中装入150ml基础液体

30、培养基，高压蒸汽灭菌。分别按5%、10%、15%、20%、25%接种量将一级菌种中接种于摇瓶中；将摇瓶置于25、150r/min下发酵培养7d；称量各个摇瓶中的菌丝体干重。2.3.6 种子培养时间的选择 取5个500ml摇瓶编为1-5号，每个瓶中装入150ml基础液体培养基，高压蒸汽灭菌。按10%接种量将一级菌种中接种于每个摇瓶中；将摇瓶置于25、150 r/min下分别发酵培养5d、6d、7d、8d、9d；称量各个摇瓶中的菌丝体干重。2.4 结果与讨论2.4.1 培养温度的优化为了探讨温度对小刺猴头菌发酵的影响，我们将小刺猴头菌置于不同温度下进行发酵培养。结果如表2-1和图2-1所示，随着温

31、度不断升高，菌丝体量不断增加，但在25-28之间差别不大，并且在28后继续升温，菌丝体量不再增加反而减少，可见25-28为小刺猴头菌适宜培养温度。表2-1 不同培养温度下的菌丝体干重温度（）1922252831干重A（g/100ml）0.3330.5520.8750.9220.623干重B（g/100ml）0.2850.5380.8690.8580.651平均干重（g/100ml）0.3090.5450.8720.8910.637图2-1 培养温度对菌丝体产量的影响2.4.2 摇瓶装量的优化分别用不同装量的摇瓶对小刺猴头菌进行发酵培养，并通过比较不同装量摇瓶中菌丝体的重量来探讨摇瓶装量对小刺猴

32、头菌发酵的影响。结果如表2-2和图2-2所示，当装入150ml培养基时，菌丝体产量最多，但在摇瓶装量超过180ml之后，菌丝体产量急剧减少，说明菌株需要一定的通气量，而150ml-180ml的装量最适合小刺猴头菌培养。表2-2 不同摇瓶装量下的菌丝体干重摇瓶装量（ml）90120150180210干重A（g/100ml）0.4860.6610.7880.7320.314干重B（g/100ml）0.5070.6370.7560.7050.362平均干重（g/100ml）0.4970.6490.7720.7190.338图2-2 摇瓶装量对菌丝体产量的影响2.4.3 摇瓶转速的优化为了寻找小刺猴头

33、菌发酵培养的最佳摇瓶转速，我们将小刺猴头菌置于不同转速下进行发酵培养。结果如表2-3和图2-3所示，当摇瓶转速为150r/min时菌丝体产量最多，而其它转速下菌丝体产量相比之下都比较少，说明150r/min的转速最适合小刺猴头菌培养。表2-3 不同摇瓶转速下的菌丝体干重摇瓶转速（r/min）50100150200250干重A（g/100ml）0.1870.5820.7930.6440.305干重B（g/100ml）0.2250.5550.7700.6130.338平均干重（g/100ml）0.2060.5690.7820.6290.322图2-3 摇瓶转速对菌丝体产量的影响2.4.4 培养基起

34、始pH的优化 pH值主要通过影响菌体细胞膜电荷、膜渗透性以及营养物质离子化程度，从而影响菌体对养分的吸收。由于摇瓶发酵过程中的pH值难以控制，只能控制发酵液的初始pH值。因此，本试验在配制了最佳培养基之后，将初始pH值分别调至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，并进行发酵培养。结果如表2-4和图2-4所示，随着pH值不断升高，菌丝体量不断增加，但在pH5.5时菌丝体产量最大，之后如果pH值继续增高则菌丝体量不再增加反而减少，可见初始pH5.5为小刺猴头菌适宜培养条件，不过其它pH值对产量的影响并不太大。表2-4 不同培养基起始pH下的菌丝体干重培养基起始pH4.555.566.5干重A（g

35、/100ml）0.4420.5730.6840.5570.474干重B（g/100ml）0.4040.5820.6950.5380.459平均干重（g/100ml）0.4230.5780.6900.5480.467图2-4 培养基起始pH对菌丝体产量的影响2.4.5 接种量的优化为了研究小刺猴头菌发酵培养的最适接种量，我们将不同接种量的转瓶置于相同条件下进行发酵培养。结果如表2-5和图2-5所示，当接种量为20%时，菌丝体产量最多；少于20%，菌丝体产量都比较少，说明20%-25的接种量最适合小刺猴头菌培养。表2-5 不同接种量下的菌丝体干重接种量（%）510152025干重A（g/100ml

36、）0.3490.6210.6840.7850.725干重B（g/100ml）0.3110.5980.6980.7940.689平均干重（g/100ml）0.3300.6100.6910.7900.707图2-5 接种量对菌丝体产量的影响2.4.6 种子培养时间的优化我们探讨了种子培养时间对小刺猴头菌发酵的影响，结果如表2-6和图2-6所示，随着培养天数的增加，菌丝体量不断增加，在7-8d时产量达到最高，并且从第9d开始下降，可见小刺猴头菌适宜培养时间为7-8d。表2-6 不同种子培养时间下的菌丝体干重种子培养时间（d）56789干重A（g/100ml）0.3980.6250.8940.9130

37、.841干重B（g/100ml）0.3560.6170.8860.9250.838平均干重（g/100ml）0.3770.6210.8900.9190.84图2-6 种子培养时间对菌丝体产量的影响2.5 小结相对猴头菌26，150r/min，pH5.0，接种量15%，培养7d来说32，与其同属猴头菌属的小刺猴头菌的最优培养条件稍有不同，其培养条件为25，150ml培养基，150r/min，20%接种量，7-8天培养。这说明尽管培养条件的范围相近，但不同菌种仍存在细微差别。但是，对于小刺猴头菌来说，这只是相对最优的培养条件，可以看出其整体产量并不是很高。尤其要注意接种量，虽然接种量大可缩短发酵延

38、迟期，减少污染几率，但接种过多不仅种子培养费工、费时，种子中代谢产物的带入对液体发酵也会造成很大影响。所以为了提高产量，使其能够进行大规模生产，仍然需要更进一步的培养条件的优化研究。第三章 小刺猴头菌培养基成分的优化3.1 引言培养基是适合于微生物生长繁殖的各种营养物质配置而成的营养基质。根据微生物的生理需要，培养基主要成分包括：水分、碳源、氮源、无机元素和生长因子等。不同真菌在培养的过程中，对每种营养成分的吸收都不相同，比如对于同一种碳源来说，可能有的真菌容易吸收利用，而有的菌却无法吸收。本实验主要对小刺猴头菌培养基的碳源和氮源进行优化选择。3.2 实验材料及试剂3.2.1 主要仪器DNP-

39、9162型电热恒温培养箱 上海精密实验设备有限公司DZP-102型恒温振荡器 哈尔滨东联电子技术开发有限公司SCI-BRIDGE型无菌操净台 北京赛伯乐实验仪器有限公司BA210S型电子分析天平 德国Sartorius公司SKG-01型电热恒温干燥箱 湖北黄石医疗器械厂3.2.2 主要试剂葡萄糖 北京化工厂甘露糖 北京化工厂纤维素 北京化工厂谷氨酰胺 北京化工厂尿素(NH2)2CO2 北京化工厂硝酸钾(KNO3) 北京化工厂硫酸镁(MgSO47H2O) 北京化工厂磷酸二氢钾(KH2PO4) 北京化工厂麦芽糖 北京奥博星生物技术责任有限公司蛋白胨 北京奥博星生物技术责任有限公司琼脂 北京奥博星生

40、物技术责任有限公司维生素B1 上海惠世生化试剂有限公司酵母膏 英国OXID LTD3.2.3 实验菌种小刺猴头菌保藏菌种（宋猴） 吉林农业大学3.2.3 培养基3.2.3.1 PDA（斜面）培养基马铃薯（去皮切块） 30%葡萄糖 2%琼脂 2%3.2.3.2 基础（液体）培养基葡萄糖 2%蛋白胨 2%KH2PO4 0.15%MgSO47H2O 0.075%VB1 0.1%3.2.3.3 实验用碳源选择培养基碳源 3%蛋白胨 2%KH2PO4 0.15%MgSO47H2O 0.075%VB1 0.1%3.2.3.4 实验用氮源选择培养基葡萄糖 2%氮源 2%KH2PO4 0.15%MgSO47H

41、2O 0.075%VB1 0.1%3.3 实验方法将小刺猴头菌保藏菌种接入PDA斜面培养基，放入恒温培养箱中，25培养7d。然后从斜面培养基上取4块0.5cm2等量菌块接种于盛有150ml基础（液体）培养基的500ml摇瓶中，入旋转摇床，转速150r/min，25震荡培养7d扩种后，将长满小刺猴头菌的一级菌种接入各组实验培养基的二级摇瓶中（接种量约20%），上摇床进行二级摇瓶培养，二级摇瓶培养条件按照之前的小刺猴头菌培养条件优化实验所得结果进行，各组实验均进行两次重复。培养完成后称量菌丝体干重。将发酵液过滤后，用水冲洗干净，置70烘箱中干燥至恒重，用电子天平称重，取两次实验的平均值。3.3.1 培养基碳源的选择 取9个500ml摇瓶编为0-8号，采用去葡萄糖的基础液体培养基为基质，选择小麦粉、大米粉、淀粉、土豆、麦芽糖、甘露糖、葡萄糖、纤维素这八种碳源配成实验用碳源选择培养基（1-8号），以无碳源为对照（0号）。每个瓶中装入150ml培养基，高压蒸汽灭菌。按20%接种量将一级菌种中接种于每个摇瓶中，并置于25、150r/min发酵培养7d；称量各个摇瓶中的菌丝体干重。3.3.2 培养基氮源的选择 取9个500ml摇瓶编为0-8号，采用去蛋白胨的基础液体培养基为基质，选择酵母膏、玉米粉、麸皮、黄豆饼粉、蛋白胨、谷氨酰胺、尿素、硝