毕业论文木蹄层孔菌Lac的酶学性质研究35750.doc

《毕业论文木蹄层孔菌Lac的酶学性质研究35750.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《毕业论文木蹄层孔菌Lac的酶学性质研究35750.doc（21页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、木蹄层孔菌Lac的酶学性质研究摘 要本文对木蹄层孔菌漆酶的酶学性质进行了研究。结果如下：以ABTS作为底物，酶反应的最适温度为50；最适pH值为3；在40C以下保持酶活力相对稳定，50C酶活性基本全部丧失；在pH值3.54范围内保持相对较高的酶活力。10mM/L的Ba2+、Ca2+、Co+、Fe3+、Na+、K+这六个金属离子对漆酶酶活有较强的抑制作用，其中Fe3+的抑制作用最强，而Mg2+，Cu2+对两种漆酶均有激活作用。以ABTS为底物时，漆酶的Km值为0.05mmol/L。关键词：木蹄层孔菌，漆酶，酶学性质ENZYMATIC PROPERTIES STUDY OF TINDER FUNG

2、US LACCASEABSTRACTIn this paper, the tinder fungus enzymology properties of laccase were studied. Results are as follows: to ABTS as substrate, the enzyme reaction of the optimum temperature is 50 ; The optimal pH value is 3; Enzyme activity stabilization are under 40 C, basic all lose enzyme activi

3、ty under 50 C; Within the scope of the pH value of 3.5 4 remained relatively high enzyme activity. 10 mm/L Co+, Ca2+, Ba2+, Fe3+, Na+, K+ the six metal ions on laccase enzyme activity had a stronger inhibitory effect, one of the strongest inhibitory effect of Fe3+, and Mg 2+, Cu2+ effect on two kind

4、s of laccase are activated. ABTS as substrates, laccase Km value tendency for 0.05 L.Key words: tinder fungus，laccase，enzymatic properties 目 录第1章 绪论11.1木蹄层孔菌国内外研究进展11.2漆酶国内外研究进展11.2.1漆酶理化性质21.2.2漆酶的应用3第2 章 材料和方法42.1实验材料与仪器42.1.1菌种42.1.2实验材料、试剂42.1.3实验仪器52.2实验方法52.2.1木蹄层孔菌的培养52.2.2粗酶液的制备62.2.3漆酶酶学性质6

5、2.2.5数据统计和分析7第3章 结果与分析83.1最适反应pH值及pH稳定性83.2最适温度及热稳定性93.3金属离子及抑制剂对漆酶活性的影响103.4Km11第4章 讨论12致 谢12参考文献12第1章 绪论1.1木蹄层孔菌国内外研究进展木蹄层孔菌(Fomes fomentarius(L.:Fr.)Kick.)是一种多孔菌科的高等药用真菌，是世界性分布的木腐性真菌1。它们生长在北美洲及欧洲的桦木属及水青冈属。单一颗树上就可以有多个子实体。木蹄层孔菌并不能食用，由于其担子果可以阴燃几个小时，故可以用来点火。子实体大至巨大，马蹄形，无柄。多呈灰色，灰褐、浅褐色至黑色，有一层厚的角质皮壳及明显环

6、带和环梭，边缘钝。菌管多层，软木栓质，多年生，生于栎、桦、杨、柳、椴、榆、水曲柳、梨、李、苹果等阔叶树干上或木桩上。子实体和菌丝体中都含有许多具有生物活性的物质，代表物质就是木蹄多糖3、4。往往在生境阴湿或较黑暗的生境出现棒状畸形子实体。分布于我国香港、广东、广西、云南、贵州、河南、陕西、四川、湖南、湖北、山西、河北、内蒙古、甘肃、吉林、辽宁、黑龙江、西藏、新疆等地区2。在18世纪和19世纪，木蹄层孔菌曾被用来作为止血的膏药，在一些传统的药典中被用来作为针灸的工具 5。在中国和亚洲其他许多国家，木蹄子实体水煎服广泛用于治疗食管癌、胃癌、口腔溃疡、肠胃失调、发炎和各种感冒等疾病6-7。国内外对木

7、蹄的研究结果表明，木蹄具有显著抑制肿瘤细胞生长、增强机体免疫功能和抗氧化等功效。目前，对木蹄层孔菌的研究主要是对其甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、正丁醇的提取物的抗肿瘤活性进行研究5。有学者对木蹄层孔菌子实体化学成分做研究表明其含有酚、有机酸、苷类等8。研究表明其子实体和菌丝体中都含有许多具有生物活性的物质，其中的多糖具有抗肿瘤和免疫刺激活性。1.2漆酶国内外研究进展漆酶即多酚氧化酶，是一种蓝色多铜氧化酶家族的糖蛋白氧化酶，它利用分子氧作为氧化剂，氧化木质素中酚型单元成为酚氧游离基，同时还原分子氧生成水。在ABTS存在时，能氧化木质素中的非酚型单元，并且其催化过程不需要 H2O2参与，因此

8、它在催化木质素降解时有一定的优越性9。漆酶按来源可分为漆树漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶，其中以真菌漆酶为主。在产漆酶的真菌中最重要的是担子菌中的白腐菌。白腐真菌漆酶通常以多重基因编码的同工酶形式出现，有来源广泛、单电子氧化还原电位高、可以催化降解多环芳烃类物质等特点10。由于漆酶底物的广泛和人们对漆酶介质的不断研究，漆酶的商业用途也越来越广泛。目前漆酶的研究主要集中于对漆酶的酶学性质研究，酶活测定，发酵条件研究这方面，已有利用漆酶降解木材中的木质素、生产酒精和利用漆酶区分吗啡和可卡因的先例11。1.2.1漆酶理化性质1.2.1.1漆酶催化反应机理漆酶的作用底物具有广泛性，但对氧具有专一性。漆酶催化

9、苯酚类芳香胺等物质的整个催化过程大致包括：酶分子对底物的作用、电子在酶分子中的传递、氧分子对酶分子的还原。就酚类化合物和芳香胺类化合物而言，漆酶利用氧分子作为电子受体，从被氧化的底物分子中，通过单电子提取方式从多酚类化合物的o-位和p-位的-OH和芳胺中去除一个H原子，形成自由基，该自由基不稳定，进一步发生聚合或解聚反应，引起重排、二聚、烷基-芳基断裂、苄醇氧化、侧链和芳环的断裂或生成醌等一系列的非酶促反应。在氧的存在下，还原态漆酶被氧化，氧分子被还原为水。漆酶催化不同类型底物氧化反应的机理主要表现在两方面：一方面是底物自由基中间体的生成。在这一过程中，漆酶从被氧化的底物分子中提取一个电子，使

10、之形成自由基，该自由基不稳定，可进一步发生聚合或解聚反应。在O2存在下，还原态漆酶被氧化，O2被还原为水。另一方面，漆酶催化底物氧化和对O2的还原是通过四个铜离子协同传递电子和价态变化来实现的。漆酶催化4个连续的单电子转移氧化还原性底物，将分子氧还原为水。还原性底物结合于T1cu位点，T1Cu从中提取1个电子，该电子通过Cys-His途径传递到T2/T3Cu三核中心位点，该位点结合了第二底物分子氧，接受T1Cu的电子，并传递给氧，使之还原为水 12。1.2.1.2漆酶底物的专一性漆酶的作用底物具有较大的广谱性，初步统计，漆酶催化氧化不同类型的底物已达250个，而且还有增加的趋势，底物结构大致可

11、归纳如下l2：酚类及其衍生物: 如2，6二甲氧基酚，愈创木酚等。这一类底物最容易被氧化；芳胺及其衍生物：如邻联茴香胺。 这类化合物结构与酚类相似，比较容易被氧化；羧酸及其衍生物：如咖啡酸，阿魏酸等，也可以被氧化；一些人工合成的化合物：如ABTS等非酚类化合物也可以作为漆酶的底物；金属有机化合物：这类底物主要有二茂铁类化合物；其它化合物:这类底物主要包括苯环上连有轻基、烷氧基、氨基、氯代化合物及多环、稠环化合物、杂环化合物等。1.2.2漆酶的应用漆酶作为一种高效，绿色的催化剂，随着固定化技术的不断发展，扩大了漆酶的工业应用范围和前景，固定化酶在废水处理，生物传感器，食品行业方面中有着重要的应用价

12、值。1.2.2.1废水处理的应用造纸工艺中需要去除木质素，传统高温蒸煮去除木质素的纸浆得率低且污染环境，而漆酶能选择性地催化木质素降解的这个特性可用于纸浆生产，减少环境污染，杜绝废水。这是漆酶最有前景的应用13。漆酶还可用作纸浆的生物漂白。漆酶来源广泛、使用方便，降解木质素效率高，固定化后能更有效的发挥作用。目前，漆酶介导系统己经得到了实际应用12。1.2.2.2食品工业中的应用在饮料方面的应用：除去啤酒和果汁等饮料原料中的酚，提高啤酒质量和透明度。另外， 漆酶还在食品分子的交联、改善生面团的性质、增加酱油风味、去除食品异味等工艺中发挥着重要作用。在食用菌和药用菌方面的应用：在食用菌制种过程中

13、加入漆酶制剂能加速木质素的分解，能为菌丝提供更丰富的养料，加快菌丝吃料，缩短培养时间。利用这种方法培养木耳、香菇等将有益于节约成本和扩大生产规模14。1.2.2.3环境保护中的应用去除氯酚类有机化合物：很多研究表明，漆酶具有转化酚型底物的能力，其中包括氯酚、甲基酚、甲氧基酚等。在底物聚合过程中，有氯离子从溶液中被释放出来，这表明漆酶具有去除氯酚化合物毒性的作用。染料降解：在印染和造纸等工业过程中，大量含有染料的废水释放，成为当今主要的环境问题之一。白腐菌漆酶具有广泛的底物专一性，可以氧化芳香环化合物，对纺织染料的脱色及降解效果明显。1.2.2.4生物检测中的应用漆酶在催化过程中消耗氧气，这一过

14、程很容易被转化为电信号而高灵敏地得到检测。在免疫检测中，漆酶有望替代辣根过氧化物酶成为新的标记酶，因为它有如下几个优点：氧气作为第二底物，不形成非产物型的酶-底复合物；相比于过氧化物酶，漆酶对介质中不同价态的金属离子浓度的敏感性较低无需特殊的仪器和试剂。同时由于漆酶能够催化多种酚类物质生成酚类化合物，固定化漆酶电极作为生物传感器在酚类物质的检测中应用广泛15。 第2 章 材料和方法2.1实验材料与仪器2.1.1菌种木蹄层孔菌（东北林业大学遗传学实验室提供）2.1.2实验材料、试剂马铃薯、葡萄糖、琼脂、麦麸、玉米、木屑、可溶性淀粉、麦芽糖、酵母汁、 蛋白胨、牛肉膏、ABTS(1mM)、柠檬酸-柠

15、檬酸钠缓冲液（pH3）、75%的酒精.表2-1 微量溶液的配制药品含量/LMgSo43gMnSo40.5gNacl1gFeSo4.7H2o0.1gCacl20.1gZnSo4.7H2o0.1gCuSo40.1gKal(So4)2.12H2o10mgNaMoO4.2H2o10mg次氮基三乙酸酯（NTA）1.5g表2-2 液体培养基配制药品含量/L白桦木屑10g酒石酸铵0.2gKH2PO42gMgSO40.5gCaCl20.1g琥珀酸（二）甲酯10mM(1.3ml)微量元素70ml硫胺素（VB1）1mg2.1.3实验仪器 紫外可见分光光度计、恒温箱、烘箱、高压湿热灭菌锅、干热鼓风超净台、可调控温度

16、摇床、冰箱、刀、锅、电磁炉、打孔器、镊子、三角瓶、烧杯、容量瓶、棕色试剂瓶、移液枪、离心管、高速冷冻离心机、离心机、磁力搅拌器、酸度计。2.2实验方法2.2.1木蹄层孔菌的培养2.2.1.1 PDA培养基在烧杯中加入300ml蒸馏水，将土豆去皮切成5mm的小方块。去除掉虫蛀和坏的，称取200g土豆料放入纱布中包好，再讲纱布放入烧杯中，将烧杯置于沸水中煮30min，拿出烧杯，将纱布挤干，再称取葡萄糖20g加入土豆汤中，用蒸馏水定容至1L，加入适当琼脂（20g左右），用封口膜封口备用。2.2.1.2 活化菌种在微波炉中溶解土豆培养基，移入超净工作台，将培养基分装在灭菌的培养皿中，等其形成固体后，再

17、分别接上菌种。接菌完成后，用封口膜封好连接口，移入恒温培养箱培养，温度设定为28，在无光条件下培养10天，每天观察菌的生长情况。2.2.1.3 配制液体培养基，接菌培养配制液体培养基（表2-2），将配制好的液体培养基平均分配到100ml三角瓶中，每瓶中加入15ml培养基。在超净工作台上将活化好的菌种接到液体培养基中，每瓶培养液中用打孔器打入3个菌饼进行培养，为测酶活做准备。2.2.2粗酶液的制备取培养10天的培养物4.5ml，分别加入3个1.5ml的离心管中，20C，12000r/min，离心20min，弃沉淀，取上清液，此即为测酶活所用的粗酶液。2.2.3漆酶酶学性质在大离心管中依次加入10

18、0mM的酒石酸钠（pH4.0）300L，1mM的ABTS1.5mL，蒸馏水700L，酶液预热后取500L加入到离心管中混匀，转移到比色皿中在420nm波长下进行吸光光度值的测定，计算酶活。2.2.3.1不同温度对漆酶的影响和漆酶的热稳定性最适酶活温度：将酶和pH的缓冲溶液、ABTS、蒸馏水分别在20、30、40、50、60、70、80、90、100的温度下预热3min后混合测酶活，共9个处理，每个处理3个重复，取平均值做曲线图，找出木蹄层孔菌漆酶的最适酶活温度。最佳耐受温度：将酶和pH的缓冲溶液、ABTS、蒸馏水分别在20、30、40、50下进行预热，共4个处理，每个处理3个重复，各处理1h，

19、处理完毕迅速放入冰里，混合然后在30测酶活。其中20、30、40三组设定24h的对照。2.2.3.2不同pH对漆酶的影响和漆酶的pH稳定性最适pH：将酶液分别和pH值1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0的缓冲溶液、ABTS、蒸馏水分别在30预热10min，混合测酶活，共8个处理，每个处理3个重复，测量三组酶活数据取平均值做曲线图，找出木蹄层孔菌漆酶酶活最大时候的最适pH值。pH耐受：将酶液分别和pH为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0的缓冲溶液、ABTS、蒸馏水30水浴1h后混合测酶活，共9个处理，每个处理3个重复，其中3.5、4.

20、0、5.0三组设定24h的对照，温度为4，测量三组酶活数据取平均值做曲线图，找出木蹄层孔菌漆酶pH耐受的范围。2.2.3.3不同金属离子对漆酶的影响除了底物外，反应体系（100 mM酒石酸钠300l、1mM ABTS 1.5 ml、酶液500 l、H2O 685 l/550l、0.2M 金属离子和抑制剂 15l（1mM）/150l（10mM）混合在30C预热10min后混合测酶活。15l（1mM）金属离子和抑制剂加685l蒸馏水，150l（10mM）金属离子和抑制剂加550l蒸馏水，以酶液事先灭活后的反应混合液为对照，测定各金属离子对漆酶酶活力的影响。2.3.3.4 漆酶酶促动力学 Km即酶促

21、反应达到最大半反应速率时的底物浓度。在最适pH和最适温度下，测定lac在不同浓度ABTS时的酶活。做出lac的酶促动力学曲线，计算酶活。2.2.5数据统计和分析根据查证，漆酶酶活的计算公式如下16：酶的活性单位u/L=A/Min（106）（TVSV）和u/L=A/Min（103m）（TVSV）。酶的活性单位式中，Amin为每分钟吸光度（A）净增或净减的数值；为摩尔消光系数；m为毫摩尔消光系数；TV为反应液的总体积（ml）；SV为样品的体积（ml）。3ml反应体系中稀释后的酶液为0.5ml，100mM的柠檬酸缓冲液(pH3)为300ul，1mM的ABTS溶液1.5ml，蒸馏水700ul。于420

22、nm处测定其吸光光度值，酶液最后加加完后立即测定，测定漆酶与底物反应1min的吸光度。以同体积的蒸馏水为对照组。已知420 nm 处ABTS摩尔消光系数420=3.6104 L/(molcm)17。第3章 结果与分析3.1最适反应pH值及pH稳定性图3-1 体系pH值对酶活力的影响图3-2 酶的pH稳定性在相同温度下，漆酶相对酶活随pH的变化如图3-1所示，漆酶的最适反应pH值为3。漆酶的pH耐受如图3-2所示。当pH低于2的时候，漆酶的酶活极低；处理1h时，pH为3.5和4时酶活都较高，处理24h后酶活仍能保持在60.30%63.42%。处理1h时，当pH大于4，酶活降级较快。故在pH为4的

23、时候，漆酶的酶活最稳定。3.2最适温度及热稳定性图3-3 温度对酶活力的影响图3-4 酶的热稳定性如图3-3所示，在反应温度为50C的时候，酶活最高，故酶的反应最适温度为50C。在相同pH下，漆酶温度的耐受性见图3-4。处理1h时，30C酶活力最高，20C次之，而40C酶活损失一半多，50C基本丧失。处理24h时，20C漆酶耐受性最好，同时发现处理1h和处理24h的漆酶酶活相差很小。因此可知该酶热稳定性较差，温度低于40C还较稳定，高于50C就基本失活。3.3金属离子及抑制剂对漆酶活性的影响表3-1 激活剂和抑制剂对漆酶活力影响抑制剂种类不同浓度抑制剂（mmol/L）作用下的相对活力（%）11

24、0EDTA103.4692.23DDT1.771.38NaN31.561.28图35 金属离子对酶活影响如图35所示，10mM/L的ba2+、ca2+、co+、fe3+、na+、k+这六个金属离子对漆酶酶活的抑制作用都很强，其中fe3+对漆酶酶活的抑制作用最强，Cu2+、zn2+、mn2+、mg2+对漆酶酶活的抑制作用一般。1mM/L时，fe3+的抑制作用最弱。激活剂和抑制剂对酶活影响如表31所示，10mM/L DDT、EDTA、NaN3均对漆酶的酶活性有着抑制作用，其中NaN3的抑制作用最强。1mM/LEDTA对酶活有激活作用。3.4Km 图36 漆酶图37 米曼氏方程双倒数图由图36得出，

25、当ABTS的浓度为0.35mM/L时，漆酶的吸光度数值为最高。此时酶活为213.36u/L。根据图37双倒数图公式，计算得Km=0.05mmol/L。第4章 讨论白腐真菌木蹄层孔菌漆酶酶活的温度和pH耐受实验表明，木蹄层孔菌产漆酶的最佳培养温度为20C，温度过高则会引起漆酶减产，超过50C漆酶酶活丧失。漆酶在温度为50C的时候酶活最高，但时间久了酶活会逐渐丧失。故测定漆酶酶活最佳温度为50C。随着温度的升高，漆酶的酶活下降很快，所以持续的高温会严重影响漆酶的酶活性。对漆酶pH的耐受和最适反应实验表明，当反应体系的pH为3的时候，漆酶的酶活最高。当培养体系的pH为3.5的时候，漆酶的酶活最稳定。

26、随着pH的波动，酶活的衰减并不严重，所以pH对漆酶酶活的影响系数不大。10种不同的金属离子对两种漆酶的活性影响表明：10mM/L的ba2+、ca2+、co+、fe3+、na+、k+这六个金属离子对漆酶酶活的抑制作用都很强，Cu2+、zn2+、mn2+、mg2+对漆酶酶活的抑制作用一般，其中fe3+对漆酶酶活的抑制作用最强，这可能是因为它占据了底物与酶的结合位点(酶的活性中心)，改变了酶的构象，从而使酶活性受到了明显的抑制.由于这6种离子对漆酶的活性中心均有毒害作用，在应用漆酶时应避免在溶液中加入这6种离子。1mM/L时，fe3+的抑制作用最弱。，而Mg2+，Cu2+对两种漆酶均有激活作用，这与

27、Mg2+是很多氧化还原酶的催化激活剂的特性比较一致，而漆酶也是一种氧化还原酶;Cu2+对漆酶有激活作用与Cu2+是漆酶的一个活性中心，也是漆酶分子的一个重要组成成分的特点一致。致 谢本文是在导师尚洁讲师悉心指导下完成的。尚洁老师平易近人，指导认真负责，经常在实验室亲自指导我的实验，解答各种疑问。实验虽然简单，但其中数据的获取耗费了大量的时间，总共跨度达到三个月，在此期间尚洁老师一直给我们指导，帮我们答疑解惑，才使得我们的实验能顺利完成。毕业论文定稿前尚洁老师每次修改都认真负责，小到标点符号的错误，大到文章的整体布局和数据的处理，她都会提出需要改进的地方。在此对尚洁老师的悉心指导表示衷心的感谢！

28、参考文献1 程东升.两类木蹄层孔菌在酶蛋白水平上的遗传分化J.苗物系统,2000,19(1):81一82 中国科普博览.2012,2（12）3 方积年.木蹄层孔菌多糖的研究现状J.药学通报,1986,21(12):944一950.4 黄益丽.层孔菌属多糖的生物活性J.生命的化学,2001,21(5):372一3735 陈洁.木蹄层孔菌多糖的提取工艺及免疫活性研究D.广州：南方医科大学,20116 刘量,郑维发,周守标.木蹄层孔菌乙醇提取物体内抗肿瘤活性及其对荷瘤鼠免疫功能的影响J.徐州医学院学报,2007,27(8):497一4997 刘量,郑维发,周守标.木蹄层孔菌乙醇提取物对肿瘤细胞的抑制

29、作用J.癌变.畸变.突变,2005,40(4):244一2488 魏红福,王志江.响应面法优化木蹄多糖提取工艺研究J.化学工程和装备,2009,9:8一119 王红.论白腐真菌产木质素降解酶在环境治理中的应用J现代商务工业,2009(7) : 297-29810 周雪.白腐真菌漆酶的纯化及性质J.生物加工过程,2011,9(2):53-5711 饶庆隆.金针菇产漆酶发酵条件研究D.南京：南京林业大学,200512 朱琳,木蹄层孔菌漆酶的产生、分离纯化及酶学性质研究D.哈尔滨：东北林业大学,2008 13 朱思明,于淑娟,杨连生.真菌漆酶的生产、性质和应用.中国食品添加剂,2006,1:126一

30、13115 黄乾明,杨婉身,陈华萍,等.粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶的分离纯化及酶学性质研究.菌物学报,2007,26(4):539一54814 初华丽,梁宗琦.漆酶的潜在应用价值.山地农业生物学报,2004,23(6):529一53315 曹治云,郑腾,谢必峰,等.漆酶在生物检测中的应用进展.传感器技术,2004，23(8):1-316 李慧梅,王淑洁,宋蕾,李向岩.动力学法测定酶活性的计算原理及求证J.陕西医学检验,1994,9(2):116-11717司静，崔宝凯，戴玉成. 栓孔菌属漆酶高产菌株的初步筛选及其产酶条件的优化. 微生物学通报, 2011, 38(3): 405416Em

31、loyment tribunals sort out disagreements between employers and employees. You may need to make a claim to an employment tribunal if: you dont agree with the disciplinary action your employer has taken against you your employer dismisses you and you think that you have been dismissed unfairly. For mo

32、re informu, take advice from one of the organisations listed underFurther help. Employment tribunals are less formal than some other courts, but it is still a legal process and you will need to give evidence under an oath or affirmation. Most people find making a claim to an employment tribunal chal

33、lenging. If you are thinking about making a claim to an employment tribunal, you should get help straight away from one of the organisations listed underFurther help. ation about dismissal and unfair dismissal, seeDismissal. You can make a claim to an employment tribunal, even if you haventappealeda

34、gainst the disciplinary action your employer has taken against you. However, if you win your case, the tribunal may reduce any compensation awarded to you as a result of your failure to appeal. Remember that in most cases you must make an application to an employment tribunal within three months of

35、the date when the event you are complaining about happened. If your application is received after this time limit, the tribunal will not usually accept i. If you are worried about how the time limits apply to you If you are being represented by a solicitor at the tribunal, they may ask you to sign a

36、n agreement where you pay their fee out of your compensation if you win the case. This is known as adamages-based agreement. In England and Wales, your solicitor cant charge you more than 35% of your compensation if you win the case.youre clear about the terms of the agreement. It might be best to g

37、et advice from an experienced adviser, for example, at a Citizens Advice Bureau. To find your nearest CAB, including those that give advice by e-mail, click onnearest CAB.For more information about making a claim to an employment tribunal, seeEmployment tribunals.The (lack of) air up there Watch m C

38、ay man Islands-based Webb, the head of Fifas anti-racism taskforce, is in London for the Football Associations 150th anniversary celebrations and will attend Citys Premier League match at Chelsea on Sunday.I am going to be at the match tomorrow and I have asked to meet Ya ya Toure, he told BBC Sport

39、.For me its about how he felt and I would like to speak to him first to find out what his experience was.Uefa hasopened disciplinary proceedings against CSKAfor the racist behaviour of their fans duringCitys 2-1 win.Michel Platini, president of European footballs governing body, has also ordered an

40、immediate investigation into the referees actions.CSKA said they were surprised and disappointed by Toures complaint. In a statement the Russian side added: We found no racist insults from fans of CSKA.Age has reached the end of the beginning of a word. May be guilty in his seems to passing a lot of

41、 different life became the appearance of the same day; May be back in the past, to oneself the paranoid weird belief disillusionment, these days, my mind has been very messy, in my mind constantly. Always feel oneself should go to do something, or write something. Twenty years of life trajectory dee

42、ply shallow, suddenly feel something, do it.一字开头的年龄已经到了尾声。或许是愧疚于自己似乎把转瞬即逝的很多个不同的日子过成了同一天的样子；或许是追溯过去，对自己那些近乎偏执的怪异信念的醒悟，这些天以来，思绪一直很凌乱，在脑海中不断纠缠。总觉得自己似乎应该去做点什么，或者写点什么。二十年的人生轨迹深深浅浅，突然就感觉到有些事情，非做不可了。The end of our life, and can meet many things really do?而穷尽我们的一生，又能遇到多少事情是真正地非做不可？During my childhood, thin

43、k lucky money and new clothes are necessary for New Year, but as the advance of the age, will be more and more found that those things are optional; Junior high school, thought to have a crush on just means that the real growth, but over the past three years later, his writing of alumni in peace, su

44、ddenly found that isnt really grow up, it seems is not so important; Then in high school, think dont want to give vent to out your inner voice can be in the high school children of the feelings in a period, but was eventually infarction when graduation party in the throat, later again stood on the p

45、itch he has sweat profusely, looked at his thrown a basketball hoops, suddenly found himself has already cant remember his appearance.童年时，觉得压岁钱和新衣服是过年必备，但是随着年龄的推进，会越来越发现，那些东西根本就可有可无；初中时，以为要有一场暗恋才意味着真正的成长，但三年过去后，自己心平气和的写同学录的时候，突然就发现是不是真正的成长了，好像并没有那么重要了；然后到了高中，觉得非要吐露出自己的心声才能为高中生涯里的懵懂情愫划上一个句点，但毕业晚会的时候最

46、终还是被梗塞在了咽喉，后来再次站在他曾经挥汗如雨的球场，看着他投过篮球的球框时，突然间发现自己已经想不起他的容颜。Originally, this world, can produce a chemical reaction to an event, in addition to resolutely, have to do, and time.原来，这个世界上，对某个事件能产生化学反应的，除了非做不可的坚决，还有，时间。A persons time, your ideas are always special to clear. Want, want, line is clear, as if nothing could shake his. Also once seemed to be determined to do something, but more often is he backed out at last. Dislike his cowardice, finally found that there are a lot of love, there are a lot of miss, like shadow really have been doomed. Those who do, just green years ones