长梗木霉纤维素酶基因的克隆及序列分析.doc

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1、微生物学通报Microbiology ChinatongbaoMAY 20, 2010, 37(5): 671676 2010 by Institute of Microbiology, CAS长梗木霉纤维素酶基因的克隆及序列分析石贤爱 1,2*刘月 1陈飞 1杨锦 1(1. 福州大学生物科学与工程学院 福建 福州 350108)(2. 福建省医疗器械和医药技术重点实验室 福建 福州 350002)摘 要: 从富含纤维素环境筛选获得一株纤维素降解菌株 FU05, 通过形态学特征及 ITS 序列分析确定其为长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)。PCR 扩增获得该菌株

2、的 bgl2、cbh2 和 eg1。序列 分析表明, 这 3 种纤维素酶基因与 GenBank 上其他木霉同种纤维素酶基因具有较高同源性: bgl2 基 因与里氏木霉 bgl2 基因(AB003110)同源性达 91%; cbh2 基因与康宁木霉 cbh2 基因 (DQ504304)同源 性达 99%; eg1 基因与长梗木霉 eg1 基因(X60652)同源性达 95%。3 种纤维素酶基因编码的相应氨基 酸序列与其他木霉纤维素酶的氨基酸序列相似性也非常高。对上述纤维素酶基因编码的相应蛋白进 行 PROSITE motif search, 对其 N 端糖基化位点、纤维素结合区、糖基水解酶家族特

3、征结构区等进 行了定位。关键词: 长梗木霉, ITS 序列, 纤维素酶基因, 同源性Cloning and Sequence Analysis of Cellulase Genesfrom Trichoderma longibrachiatumSHI Xian-Ai1,2* LIU Yue1CHEN Fei1YANG Jin1(1. College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350108, China)(2. Fujian Key Laboratory of Medical

4、Instrument and Pharmaceutical Technology, Fuzhou, Fujian 350002, China)Abstract: Strain FU05 with cellulose-degrading activity was isolated from cellulose-rich environment andidentified as Trichoderma longibrachiatum through morphology characteristics and ITS sequence analysis. The cellulase genes b

5、gl2, cbh2 and eg1 were cloned by PCR. By conducting sequence alignment analysis with the reported data it was found that the homology of same cellulase genes between strain FU05 and other Trichoderma were: 91% to bgl2 (AB003110) from Trichoderma reesei; 99% to cbh2 (DQ504304) from Trichoderma koninq

6、ii and 95% to eg1 (X60652) from Trichoderma longibrachiatum. Furthermore, the corresponding amino acid sequences were also quite similar. By means of PROSITE motif search, the loca- tions of N-glycosylation site, cellulose-binding domain and conserved domains of glycosyl hydrolases fam- ily in the c

7、orresponding protein were confirmed.Keywords: Trichoderma longibrachiatum, ITS sequence, Cellulase genes, Homology基金项目：福建省发改委资助项目(No. 闽发改投资2008256 号)* 通讯作者：Tel: 86-591-22866379; Fax: 86-591-22866379;收稿日期：2009-11-18; 接受日期：2010-01-08: shixa近年 来 , 随着 传统 化石燃 料储 量的急 剧减 少 ,开发新的可再生能源已迫在眉睫。木质纤维素是地 球上 来 源 最

8、丰富的 生物 质 资 源 13, 若 能 将 其有效 降解成葡萄糖并用于燃料乙醇生产, 对于改善目前 资源紧张的状况将具有重要意义。纤维素酶是由内 切葡聚糖酶(Endoglucanase, EC 3.2.1.4, 简称 EG)、 纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91, 简称 CBH)和 -葡萄糖苷酶(-glucosidase, EC 3.2.1.21,简称 BGL)等组成的复合酶系4, 在这 3 种酶的协调 作用下纤维素被降解成葡萄糖。由于木霉属能产生大量的胞外纤维素酶, 对纤维素的降解能力较强, 因此对真菌产纤维素酶的研 究主要集中在木霉属56。目前对

9、来源于里氏木霉、绿色木霉和康宁木霉的纤维素酶基因研究较多, 已 克隆 cbh1-3、eg1-5、bgl1-2 等基因, 且不少基因已 在酵母和大肠杆菌中成功表达79。但关于长梗木霉纤维素酶的报道较少, 且多见于纤维素酶的发酵条 件优化及提取1012。目前国内外关于长梗木霉纤维素酶基因表达仅见几篇报道: 王娟等13成功将长梗 木霉 XST1 cbh2 基因在毕赤酵母中表达, 发酵上清 液水解 pNPC 的酶活为 18.1 U/L; 刘海英等14将长梗木霉 SSL 的 eg1 基因表达于毕赤酵母, 经甲醇诱 导后, 胞外重组内切葡聚糖酶 I 的活力达 73 U/mL;Gonzdlez 等15克隆了

10、长梗木霉的 egl1 基因, 置于诱 导型启动子 cyc-gal 下游于酵母中表达, 获得的转化 子可分泌具有酶活性的蛋白。本研究 筛选获得一 株纤 维 素 降 解 菌 长 梗 木 霉FU05, 测定 了其液 态发 酵分泌表 达 纤维素酶的能 力; 通过 PCR 扩增获得 3 种纤维素酶基因 bgl2、cbh2 和 eg1 (其中首次从长梗木霉中克隆获得 bgl2 基因),并对其进行序列比对和同源性分析。本研究不仅有助于完善木霉纤维素酶的分子生物学理论基础, 同 时为长梗木酶纤维素酶基因的克隆、改造和高效表达创造了条件。剂为国产分析纯。1.2 培养基富 集培养基 (g/L): NaNO3 0.

11、5, KH2PO4 1.0,MgSO4 0.5, KCl 0.5, Fe2(SO4)3 微量, 自然 pH。使用 时 以滤纸 为 碳 源 , 剪成 长 条 状 , 放入试管 内 , 略露 出液面。初筛 培养 基 (g/L)16:(NH4)2SO4 1.4, KH2PO42.0, CaCl2 0.3, MgSO4 0.3, 尿素 0.3, 羧甲基纤维素钠 10.0, FeSO47H2O 0.0016, ZnSO47H2OCoCl2 0.002, 琼脂 20, 自然 pH。PDA 培养基: 土豆 200 g 洗净, 去皮,块, 煮沸 30 min, 6 层纱布过滤, 定容至 1 L,0.0014,

12、切成小加葡萄糖 20 g, 自然 pH。若制成平板, 加琼脂 20 g。液体发酵培养基 (g/L): 蛋白胨 3, (NH4)2SO4 2, 酵母膏 0.5, KH2PO4 4.0, CaCl2 0.3, MgSO4 0.3, Tween-80 0.2, 微晶纤维素 20, 麸皮 60。LB 培养基: 胰蛋白胨 10 g, 酵母提取物 5 g, NaCl 10 g, 溶于 950 mL 水, 加 1 mol/L NaOH 调 pH至 7.0 后补水至 1 L。若制成平板, 加琼脂 20 g。1.3 菌株筛选从 福 州 大 学 后山富含纤 维 素 的 环境采集样品 ,加入适量无菌水打散, 制成悬

13、液。吸取样品悬液于 富集培养基, 30C、200 r/min 培养 7 d, 将滤纸取出用无菌水打散制成悬液, 适当稀释后涂布于初筛培 养基平板, 30C 培养 4 d。挑取生长较快的单菌落于 PDA 平板上进行划线分离得到纯化的菌株。将该菌株点接于初筛培养基平板, 30C 培养 1 d, 再往培养 皿内加适量 1 g/L 刚果红染液, 染色 2 h。倾去染液,加入 1 mol/L NaCl 浸泡 1.5 h。选择透明圈较大的菌 株于液体发酵培养基 30C、200 r/min 培养, 每天测 定 1 次酶活。1.4 纤维素酶活力测定取发酵液于 6000 r/min 离心 15 min, 将上清

14、作为 粗酶液 。 滤 纸酶活 的 测 定 : 参照文 献 17略作 改 进, 将 50 mg 滤纸浸入 1.5 mL 0.1 mol/L, pH 4.8 的柠檬酸缓冲液中, 加入 0.5 mL 适当稀释的酶液, 50C水浴反应 30 min, 加入 1.5 mL DNS 试剂终止反应,沸水浴中煮沸 5 min, 立即用流动水冷却, 蒸馏水定 容至 20 mL, 于 540 nm 测定 OD 值。以 100C 水浴灭活 5 min 的粗酶液为空白对照, 通过葡萄糖标 准曲线计算酶的活力。酶活定义: 1 min 内分解底物1材料和方法1.1主要试剂真菌基因组 DNA提取试剂盒购自杭州博日科技有限公

15、司; 质粒 DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒和 pUCm-T 克隆试剂盒购自 Bio Basic Inc.; 即用PCR 扩增试剂盒(含 0.1 U/L 普通 Taq DNA 聚合酶)购自上海生工生物工程技术服务有限公司; 其他试生成 1 g 葡萄糖所需酶量定义为 1 个酶活单位(U)。石贤爱等: 长梗木霉纤维素酶基因的克隆及序列分析6731.5 菌株鉴定1.5.1 菌落形态观察: 将盖玻片沿 45 度角斜插入PDA 培养基平板, 于盖玻片与培养基交接处接种菌 株孢子悬液 30C 培养, 连续几天观察菌落边缘和表 面的质地、颜色、纹饰等形态变化, 并取下盖玻片, 于光学显微镜下观察。1.5.2

16、 ITS 序列分析: 按博日真菌基因组 DNA 提取试剂盒法提取基因组 DNA, 合成引物18进行 PCR扩增 , 1F: 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3; 1R:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。PCR 反应条件:94C 7 min; 94C 1 min, 55C 30 s, 72C 1 min, 30 个 循环; 72C 20 min。胶回收 PCR 扩增产物, 经上海生工测序后, 与 GenBank 上已知真菌 ITS 序列进行 比对分析。1.6 纤维素酶基因的扩增根据 GenBank 上发表的纤维素酶基因序列设计引 物如下 : 根据 - 葡 萄糖苷 酶基

17、因 bgl2 序列 (GenBank accession No. AY343988) 设计 引物 : 2F:5-ATGTTGCCCAAGGACTTTCA-3; 2R: 5-TCAA GCTCTTTGCGCTCTTC-3。根据外切葡聚糖酶基因cbh2 序列 (DQ504304) 设计 引物 : 3F: 5-ATGAT TGTCGGCATTCTCACC-3; 3R: 5-TTACAGGAACGATGGGTTTGC-3。根据内切葡聚糖酶基因 eg1 序列 (M15665) 设计引 物 : 4F: 5-ATGGCGCCCTCAG TTAC-3; 4R: 5-CGCTCTAAAGGCATTGC-3。反应

18、 条件 : 94C 7 min; 94C 1 min, 55C 1.5 min, 72C2 min, 30 个循环; 72C 10 min。胶回收 PCR 扩增产物, 按 pUCm-T 克隆试剂盒 步骤与 T 载体连接, 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞, 挑取转化子, 用通用引物 M13/pUC Sequenc-ing primer F 和 R 进行 PCR 验证, 挑选阳性转化子送 上海生工进行测序。1.7 序列比对分析利用 软 件 MEGA 3 进行 ITS 序列聚类分析 ,DNAMAN 、 Primer Premier 5.0 、 GenBank 上的 BLAST 、 http:/cub

19、ic.bioc.columbia.edu 网 站 上 的 Predictprotein 等 分 析工 具对扩 增 得 到的长 梗木霉 FU05 纤维素酶基因进行序列比对分析。可观察到透明圈, 但透明圈的形态各不一样。有的菌株生长较快, 但透明圈较小; 有的菌株生长较慢,透明圈却很明显; 有的菌株在平板上菌丝体呈疏松 状蔓延生 长 , 菌落 大而 蓬 松 , 周围 无明 显透 明圈 , 但通过平板背面观察可见菌丝覆盖处平板完全呈透明状态。综合平板上刚果红染色透明圈的情况以及 菌株生长状态, 确定 7 株菌用于液体发酵实验, 并分别命名为: FU01、FU02、FU03、FU04、FU05、 FU

20、06、FU07。液体发酵产酶结果显示, 酶活最大的 菌株为 FU05, 培养 6 d 时酶活达 106.4 U/mL, 如表1 所示。2.2 菌株鉴定2.2.1 菌株形态学特征: 菌株 FU05 在 PDA 平板上先以 白 色圆 形绒状生长 , 随后迅速向四周拓展 , 然 后从 菌 落中 央产生绿色 孢子 , 使中 央变 成 绿色 , 最后整个平皿布满黄绿色菌落。显微镜下观察菌丝形态如图 1 所示, FU05 菌丝体上可见明显的瓶颈状分 生孢 子 梗, 且 分枝 与分 生 孢子 梗呈 直角 , 分 生孢子 为圆形, 聚集成圆团状于孢子梗顶端。参考真菌鉴 定手册19初步判断 FU05 为木霉属。

21、Time of maximumMaximum enzyme2结果2.1产纤维素酶菌株的筛选初筛得到的 15 株菌经刚果红染色法复筛后, 均图 1 FU05 菌丝形态 ( 640)Fig. 1 Morphology of strain FU05 ( 640)表 1 菌株产纤维素酶活力Table 1 Activities of cellulases produced by strains菌株编号 达到最大酶活时间 最大酶活Strain No. activity (d) activity (U/mL)FU01 5 70.5FU02 5 65.1FU03 5 62.7FU04 4 61.3FU05 6

22、 106.4FU06 6 88.7FU07 4 62.12.2.2 ITS 序列分析: 将菌株 FU05 ITS 测序结果(GenBank accession No. GU144295)在 GenBank 里进 行搜索比 对 , 与 长 梗木霉 (Trichoderma longi-brachiatum) ITS 序列同源性达 99%, 即确定所筛选的菌株 FU05 为长梗木霉。ITS 聚类分析结果如图 2所示, 可知 FU05 与长梗木霉处于同一分支, 亲缘关 系最近, 且与里氏木霉、拟康氏木霉等也有较近的 亲缘关系。2.3 纤维素酶基因的扩增以 FU05 基因组 DNA 为模板, 2F 和

23、 2R、3F 和3R、4F 和 4R 为引物, PCR 扩增纤维素酶基因, PCR产物进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳, 结果如图 3 所示。 可以看出, PCR 扩增出 10002000 bp 间单一的 DNA在 1500 bp 左右)。2.4纤维素酶基因序列分析bgl2 基因: 长梗木霉 FU05 bgl22.4.1基因全 长1431 bp (GenBank accession No. GU144296), 进行BLAST 搜 索 比 对 , 结 果 表 明 与 里 氏 木 霉 (AB003110)、绿色木霉(AY343988) bgl2 基因同源性 较高, 其中与里氏木霉 bgl2 基因(A

24、B003110)同源性 达 91%。结合以上两种木霉 bgl2 基因内含子位置可知 FU05 bgl2 基因内含子位于 42110 bp 处。将 FU05bgl2 基因编码的相应氨基酸序列进行 Protein blast 搜索比对, 结果显示 FU05 bgl2 基因编码 453 个氨 基酸, 属于糖基水解酶家族 1, 与里氏木霉 bgl2 基因 (AB003110)编码的氨 基酸序列 具有较 高相似 性,达 93%。条带,大小与预期一致(bgl2、cbh2、eg1 基因大小均图 2 FU05 ITS 序列聚类分析结果(N-J 算法)Fig. 2 Cluster analysis of ITS

25、 sequence (N-J algorithm)Note: The number in parentheses represents GenBank accession number. The ruler represents evolutionary distance.石贤爱等: 长梗木霉纤维素酶基因的克隆及序列分析675图 3 PCR 扩增纤维素酶基因片段琼脂糖凝胶电泳图Fig. 3 Gel electrophoresis of cellulase genes obtained by PCRNote: M: DNA marker; 1: bgl2; 2: cbh2; 3: eg1.利用

26、Predictprotein 进行 PROSITE motif search,结果表明 bgl2 基因编码的蛋白含 3 个 N 端糖基化位 点(N55RTA、N135RTE、N367GTS)、4 个蛋白激酶 C磷酸化位点、10 个酪蛋白激酶 II 磷酸化位点、3 个N 端酰基化位点和 1 个糖基水解酶家族 1 的 N 端特 征序列(F6QWGFATASYQIE GA)。2.4.2 cbh2 基因: 长梗木霉 FU05 cbh2 基因全长1584 bp (GenBank accession No. GU144297), 与康 宁木霉 3.2774 cbh2 基因(DQ504304)的同源性非常

27、高, 达 99%, 仅 4 个碱基不同。结合康宁木霉 3.2774 cbh2 基因序列比对分析, FU05 cbh2 基因内含子位于92142 bp、528583 bp、831894 bp 处。氨基酸序 列比对结果显示 FU05 cbh2 基因编码 470 个氨基酸,属于糖基水解酶家族 6, 与康宁木霉 3.2774 cbh2 基 因编码的氨基酸序列具有非常高的相似性, 达 99%, 仅第 30 位的氨基酸不同(长梗木霉 FU05 为 Val, 康宁木霉 3.2774 为 Ala)。PROSITE motif search 分析表明: cbh2 基因编码 的蛋白含 3 个 N 端糖基化位点(N

28、38WSG、N312ASS、N333ITS)、8 个蛋白激酶 C 磷酸化位点、4 个酪蛋白激酶 II 磷酸化位点、11 个 N 端酰基化位点、2 个 糖基水解酶家 族 6 的特征 序列 (V190VYDLPDRDCAALASNG, L238LVIEPDSLA) 及 纤 维 素 结 合 域(C34GGQN WSGPTCCASG STCVYSNDYYSQC)。基因同源性也较高。结合长梗木霉和拟康氏木霉 eg1基 因序列 比对 分析 , FU05 eg1 基因 内含 子 位 于771892 bp、14891545 bp 处。FU05 eg1 基因编码461 个氨基酸, 属于糖基水解酶家族 7, 与拟

29、康氏木 霉 eg1 基因(EF185865)编码的氨基酸序列具有非常 高的相似性, 达 99%, 仅第 5、152 位的氨基酸不同(长梗木霉 FU05 第 5、152 位分别为 Val、Leu, 而康 宁木霉 3.2774 相应位置为 Ala 和 Phe)。PROSITE motif search 分析表明: eg1 基因编码 的蛋白含 5 个 N 端糖基化位点(N78TTL、N164GSL、N204GTL、N208TSG、N394STG)、1 个 cAMP-cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点(R414RSS)、7 个蛋白激 酶 C 磷酸化位点、4 个酪蛋白激酶 II 磷酸化位点、1 个酪氨酸激

30、酶磷酸化位点、16 个 N 端酰基化位点、及 纤 维素结合 域 (C433GGIGYTGCKTCTSGTTCQYGNDYYSQC)。3讨论从富含纤维素环境中分离获得一株纤维素降解菌长梗木霉 FU05, 通过 PCR 扩增获得 3 种纤维素酶 基因 bgl2、cbh2 和 eg1。经序列比对分析发现, 上述 3 种纤维素酶基因与同属内其他木霉同类基因的同源性很高, 达 90%以上; 并对这 3 种纤维素酶基 因编码的相应蛋白进行 PROSITE motif search, 为其进一步的分子生物学研究提供参考依据。2.4.3eg1 基因: 长梗 木 霉 FU05 eg1 基因 全 长1565 bp

31、 (GenBank accession No. GU144298), 与长梗木霉 eg1 基因(X60652)同源性较高, 达 95%; 另外 与拟康 氏木 霉 (EF185865)、木 霉属 (EU935217) eg1纤维素酶包括 3 种酶, 每种酶又各有多种类型。BGL是 Takashima S 等 1999 年发现的一种新型纤维素 酶 , 目前 与 该 酶 相 关 的研究 报道 并不 多 ;CBH含量虽远低于 CBH, 但该酶特异性强且酶活明显高 于 CBH, 其 降 解 微晶纤 维 素的能力比 CBH高两倍。而 EG是内切葡聚糖酶中的中的重 要组分 , 其 表达分 泌量 约 占 木

32、霉 胞 外蛋白 总 量 的10%。因此, 本文对长梗木霉 FU05 选取上述 3 种纤 维素酶的基因 bgl2、cbh2 和 eg1 作为代表进行克隆和序列分析。有关长梗木霉其他类型纤维素酶基因 的克隆、分析, 以及选择合适的载体及表达宿主实127132.黄艳 , 凌敏 , 覃拥灵 , 等 . 康氏木霉 内 切 葡聚糖酶 (EG) 基因的 克隆及表达 . 生物技术 , 2008, 18(2):1013.Gama FM, Faro CJ, Teixeira JA, et al. New methodology for the characterization of endoglucanase a

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