花卉植物病毒检测规程.doc

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1、ICS 65020B 62N Y中华人民共和国农业行业标准NYT 1491-2007花卉植物病毒检测规程Rules for viruses detection on floral plants20071218发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布NYT 1491_2007前言本标准的附录A、附录B和附录C为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。 本标准主要起草单位：农业部花卉产品质量监督检验测试中心(昆明)、农业部蔬菜产品质量监督检验测试中心(北京)。本标准起草人：唐开学、王继华、王丽花、瞿素萍、张颢、熊丽、刘肃、陆琳、苏艳。NvT 14912007花卉植物病毒检测

2、规程1范围 本标准规定了主要花卉植物常见病毒的检测方法。本标准适用于主要花卉植物常见病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 18247-2000主要花卉产品等级3定义31脱毒核心材料nuclear stock of virus free初次应用茎尖分生组织脱毒或其他有效脱毒方法培养形成的无病毒的再生材料。32扩繁材料propagation st

3、ock由脱毒核心材料在严格的隔离条件下生产出的符合质量标准的种苗(球)。33生产用材料certified stock用扩繁材料在隔离条件下生产出的符合质量标准的种苗(球)。34病毒病株允许率tolerance of virus plant同一检验批次的花卉植株中，病毒病株允许存在的最大限度，用病毒病株数占植株总数的百分率 表示。4抽样4 1脱毒核心材料 每株(粒)均需检测。在继代培养中，每3个月检测一次。随机选取每株的中、上位置组织作为检测样品。样本在46下保存，24 h内检测。42扩繁材料及生产用材料 抽样方法分为两次抽样。第一次抽样从同一检测批次中随机抽取，抽样比例小于等于10 000株(

4、粒)，按610抽取，最低抽样数量为100株(粒)，不足100株(粒)时全部作为检测样品；大于10 000株(粒)，按35抽取。最大样品抽样数为1 000株(粒)。第二次抽样在第一次抽取的样品中 再随机抽取10。5主要检测对象51麝香石竹1NYT 14912007麝香石竹斑驳病毒Carnation mottle carmovirus(CarMV) 麝香石竹坏死斑点病毒Carnation necrotic fteck closterovirus(CNFV) 麝香石竹潜隐病毒Carnation latent carlavirus(CLV) 麝香石竹蚀环病毒Carnation etched ring

5、caulimovirus(CERV) 麝香石竹叶脉斑驳病毒Carnation vein mottle potyvirus(CVMV) 麝香石竹环斑病毒Carnation ringspot dianthovirus(CRSV)52菊花菊花B病毒Chrysanthemum B carlavirus(CVB) 番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus(TSWV) 番茄不孕病毒Tomato aspermy cucumovirus(TAV) 黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic cucumovirus(CMV)53满天星黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic c

6、ucumovirus(CMV)54火鹤芋花叶病毒Dasheen mosaic potyvirus(DsMV)55非洲菊烟草脆裂病毒Tobacco rattle tobravirus(TRV)黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic cucumovirus(CMV)番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus(TSWV)56月季苹果花叶病毒Apple mosaic ilarvirus(ApMV) 李坏死环斑病毒Prunus necrotic ringspot ilarvirus(PNRsV)57一品红一品红花叶病毒Poinsettia mosaic tymoviru

7、s(PoMV)58洋桔梗黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic cucumovirus(CMV)烟草脆裂病毒Tobacco rattle tobravirns(TRV)59补血草黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic cucitmovirus(CMV)芜菁花叶病毒Turnip mosaic potyvirus(TuMV)510百合黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic cucumovirus(CMV)百合无症病毒Lily symptomless carlavirus(LSV)百合斑驳病毒Lily mottle potyvirus(LMoV)511郁金香郁金香碎色病毒Tulip br

8、eaking potyvirus(TBV)黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic cucumovirus(CMV)百合无症病毒Lily symptomless carlavirus(I。SV)512鸢尾鸢尾重花叶病毒Iris severe mosaic potyvirus(ISMV)水仙潜隐病毒Narcissus latent macluravirus(NaLV)5 13唐曹蒲2MYT 14912007菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic potyvirus(BYMV) 烟草花叶病毒Tobacco mosaic tobamovirus(TMV)黄瓜花叶病毒Cucumber m

9、osaic cucumov)is(CMV)5 14马蹄莲芋花叶病毒Dasheen mosaic potyvirus(DsMV)5 15水仙黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic cuculnovirus(CMV) 水仙花叶病毒Narcissus mosaic potexvirus(NMV) 水仙黄条斑病毒Narcissus yellow stripe potyvirus(NYSV)516兰花建兰花叶病毒Cymbidium mosaic potexvirus(CymMV) 齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot tobamovirus(ORSV) 烟草花叶病毒Tobacco

10、 mosaic tobamovirus(TMV)5 17凤仙花凤仙花坏死斑点病毒Impatiens necrotic spot tospovirus(INSV)黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic cucumovirus(CMV)番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus(TSWV)518仙客来黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic cucumovirus(CMV)519凤梨番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus(TSWV)6检测方法 指示植物检测法按附录A执行。双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)按附录B执

11、行。 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)按附录C执行。7质量要求各种花卉种苗(球)病毒病株允许率应符合GBT 18247-2000中的规定。NVT 14912007附录A (规范性附录) 指示植物检测法A1指示植物的栽植 每次检测指示植物数量不应少于4株。种子播种于经过消毒的富含有机质土壤的花盆中，出苗后移栽到苗盘，真叶长至2片3片时分盆 移栽，第4叶6叶完全展开后接种。栽植的环境条件：温度为2025，光照时数为12 h。A2机械摩擦接种将待测样品与3倍量(wV)的磷酸缓冲液(o2 molL，pH 74)混合研磨，用细纱布过滤匀浆液， 在l 000 g10 000 g下离心iomin15ma

12、n后取上清液。接种时，叶面喷撒300目600目金刚砂粉， 用毛笔醮上清液摩擦叶片表面。接种后，立即用蒸馏水冲洗被接种叶片。每株指示植物只接种一个样品，且每株指示植物接种两片以上叶片。 每次检测均设阳性、阴性和空白对照。A3管理将植株栽培于2025。C严格隔离的防虫温室中，盆间距50 cm。逐日观察记录指示植物症状。 各种花卉病毒在指示植物上的症状见表A1。A4结果判断根据指示植物症状，确定病毒有无。在所有接种的指示植物中只要有一株表现典型症状，该样品即为阳性。表A 1指示植物及症状指示植物病毒种类 指示植物症状 中文名拉丁学名麝香石竹坏死斑点病毒 苋色藜 Chenopodium amarant

13、icolar 局部褪绿斑 菊花B病毒 矮牵牛 Petunia hvbHda黄化或坏死斑 番茄不孕病毒 心叶烟 Nicotiana glutinosa 褪绿或坏死斑 黄瓜花叶病毒 黄瓜 Cucumis sativus 系统花叶 芋花叶病毒 春羽蔓绿绒 Philodendron selloz删系统性叶脉褪绿烟草脆裂病毒 克利夫兰烟 Mcotiana clevelandii 局部坏死斑或褪绿芜菁花叶病毒 白肋烟 Nicotiana tabacurm cu White Burley 边缘褐色的局部坏死斑 百合无症病毒 麝香百合 Lilium longifzor埘 叶片出现扭曲和白色条斑 郁金香碎色病毒

14、 台湾百合 Lilium fot?l,$anu71$ 斑驳或条纹水仙花叶病毒 豌豆Pisum sativum局部坏死斑兰花叶病毒 苋色藜 Chenopodium amaranticolor 接种叶上形成大的污渍状病斑 齿兰环斑病毒 三生烟 Nicotiana tabacum CV,XanthiNC局部坏死斑或环形斑NYT 14912007附录B(规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)检测法B1设备和材料 所用移液枪头、离心管、镊子等皆用蒸馏水清洗后，高温消毒。R 11微量移液器：200 td1 000“L、20 ttL200 td。、10 tzL100 FL、0B 1 2电

15、子天平：感量为001 g、00001 g。R 13离心机。 B1 4冰箱。 B15恒温箱。 B16酸度仪。 B17洗板机。 B18酶标检测仪。B 2药品和试剂 所用试剂为分析纯，水为蒸馏水，酶标抗体为碱性磷酸酶标记抗体。B 21包被缓冲液(O 05 molL Na2C03-NaHC03缓冲液。pH 96)Na2C03 15 g NaHC03 29 g NaN3 02 g加蒸馏水溶解至1 000mL，调至pH为96。R 22洗涤缓冲液(PBST。pH 7 4)NaCl 80 g KH2P04 02 g Na2HP0412H20 29 gKCl 02 gTween 20 05mL加蒸馏水溶解至l

16、000 mI，调至pH 74。B2 3样品磨碎缓冲液脱脂奶粉 20 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，MWz。m一，。) 100 g无水亚硫酸钠 13 gNaN3 02 gTween 20 100 g溶于PBST中，定容至1 000 mI。，4。C保存。R 24酶标抗体稀释缓冲液(pH 7 4)牛血清白蛋白BSA 20 gNYT 14912007聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Mwzt ooooo)100 gNaN302 g溶于pBST中，定容至1 000 mL，4保存。 B25底物缓冲液二乙醇胺 970mL氯化镁 01 gNaN302 g溶于800mL蒸馏水中，用2molL盐酸调pH至98，定容至1 000

17、mL，4保存。 B26底物溶液(现用现配)1 mg PNPP溶于1 mL底物缓冲液中，浓度为1 mgmL。B27终止液(3 toolL氢氧化钠溶液)NaOH 120 g，溶于1 000 mL蒸馏水中。 B3操作步骤B31包被抗体在酶标板孔中加入100止用包被缓冲液按工作浓度稀释好的抗体，将酶标板放入湿盒中，置于4冰箱内孵育过夜或室温(2025)下孵育4 h。 B 32样品准备将植物材料和研磨缓冲液按1；10(wv)的比例放入一次性自封袋中，将袋口封紧，碾压样品。 B33洗板孵育结束后，用洗涤缓冲液清洗酶标板4次6次。每孔每次加PBST洗液400肛L，每次停留1 mln2 rain。B34包被样

18、品取B20研磨后的上清液，每孔加i00 pL，每个待测样品进行2次重复，同时设阴性对照和阳性对照。将酶标板放入湿盒中，4冰箱内孵育过夜或2124下孵育25 h。B35洗板 同B33。B 36包被酶标抗体包被前i0 min准备酶标抗体，将特异性酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液稀释至工作浓度，每孔加100“L。酶标板放人湿盒，2124下孵育2-5 h。B37洗板 同B33。B3 8加底物溶液每孔加入100 pL的底物溶液。酶标板放入湿盒中21+(224下蔽光显色30 min60 min。B39加终止液每孔加入50止终止液终止反应。B 3 10酶联检测终止反应20 rain内，将酶标板置于酶标仪中，在4

19、05 nm下测定吸收值(OD一)，记录反应 结果。NYT 14912007B 4结果判断 阳性对照和阴性对照按预期结果显色时，检测结果有效。检测样品平均OD40s阴性对照平均OD40s2时，检测样品为阳性。NYT 14912007附录C (规范性附录) RNA病毒的反转录一聚合酶链式反应(1itICR)检测法C 1设备和材料 枪头、离心管和PCR小管等用具均用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理。C1。1微量移液器：200扯L1 000肛L、20LL200 pL、10,aI一100弘L、05 pI一10肛L。C1 2电子天平：感量为001 g和00001 g。C 13高速冷冻离心机。C 14热循环仪(

20、PCR仪)。 C15水平凝胶电泳系统。 C16凝胶成像系统。C2药品和试剂 所用试剂为分析纯，用水为双蒸水。C2 1RNA提取试剂Trizol，氯仿，异丙醇，70乙醇，双蒸水。C 22反转录试剂MMLV反转录酶，5MMLV缓冲液(250 mmolI。TrisHCl pH 83，375 mmolL KCl，15mmolLMgCl2，50retoolLDTT)，核糖核酸酶抑制剂，20 pmolpL随机引物，10mmolL dNTP。-20贮藏。C23PCR试剂Taq DNA聚合酶，10Buffer(i00 mmolL TrisHCl pH 83，500 mmolL KCl，15 retoolLMg

21、Clz)，PCR引物(上游、下游)。C24 5XTBE缓冲液Tris54 g硼酸 275 g05toolLEDTA(pH 8O)20mL定容至1 000 mI。，4C保存。 C25加样缓冲液025溴酚蓝溶解于40(wV)蔗糖水溶液，4保存。 C3操作步骤C31RNA的提取将005 g样品组织放人灭菌研钵，加入1 mITrizol溶液研成匀浆，将匀浆液移人15 mL离心管 中，室温(2025)放置5 rain，使组织充分裂解。加入200,uL氯仿，用力颠倒离心管以混匀，静置5min后，12 000 rmin离心10min。吸取上层水相，移至另一个15mL离心管中。加入500 pI一异丙 醇，混匀

22、，室温(2025)放置10 rain。12 000 rmin离心5 min，弃上清。加入1 mI，75NL醇，振荡8NYT 14912007片刻后，7 500 rmin离心5 rainJ、心地弃上清。室温(2025)静置5 min15 rain，使RNA沉淀 恰好干燥，加入50肚L双蒸水，溶解后备用。C32反转录在05 pL PCR管中依次加入以下试剂：双蒸水ddHz0 8止，20 pmolpL随机引物05 pI。RNA模板2pL，70变性10min，冰上5min。然后加入5MMLV反转录缓冲液4pL，10mmolL dNTP3pL，40 upL核糖核酸酶抑制剂05pL，200 u止MMLV反

23、转录酶1止。将以上所有成分混匀，低速离心后，热循环仪中42反应1 h。C 3 3 PCR扩增依次在PCR管中加入：双蒸水327 pL，10PCR缓冲液5止，20 pmolpL上游引物1 pI。，20 pmoltlL下游引物1以，5 u止TaqDNA聚合酶03止，反转录产物10pL。充分混匀，按如下程序进行PCR扩增：9410rain，然后按94变性30 s、退火(温度详见本附录表Ct)60 s、72延伸60 S进 行35个循环，再72延伸10 rain。C 3 4扩增产物检测将5TBE以1：5稀释成1TBE工作液，与琼脂糖配制成15(wv)的溶液，加热使琼脂糖完全熔化。待凝胶液冷却至50*c6

24、0C时，加入适量的溴化乙锭(终浓度为05弘gpL)，灌制平台，冷 却。将PCR产物按6：1混合加样缓冲液，点样。按1 vcmlO vCFll电泳，至溴酚蓝迁移超过胶板 长度的12以上，停止电泳。把胶板取出后，用凝胶成像系统进行观察、照相。C 4结果判断 阳性对照有目标带出现，阴性对照无带时，检测的结果为有效。检测样品有与阳性对照相同的目标带时为阳性，无目标带为阴性。表C1花卉病毒的特异性引物病毒名称 引物序列(5一3)退火温度(Tm值)()产物(bp) 百合隐症病毒 P1：atg caa tea aga Ce-q gca ca52876(LSV) P2：tca tcc att art tgc

25、gta tc百合斑驳病毒 P1：gtt ggt gct acc aaa att tc56560(LMoV) P2：cat ctg ttg tat gtc tct cc黄瓜花叶病毒 P1：cgt tea eat eta tca ccc ta56335(CMV) P2：tac ttt ctc atg tcg cct at李坏死环斑病毒 P1：atg gtt tgc cga att tgc aa58680(P1氓SV) P2：ctc tag atc tca agc agg tc郁金香碎色病毒 P1；gag tac ggt ctc Itltc gac g52200(TBV) P2aga ttt gag aag tgc gcc atg香石竹斑驳病毒 P1：ttlt gtt tgc ccc cgt tgg taa cc60610(CarMV) P2：aag cgt cat cgt tga ate Celt gag菊花B病毒 P1：ctg gtg aag ctg tga gga ttt ctg62780(CVB) P2：tgc c8c agc tgc ata gag acg gca