水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法.doc

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1、植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (1): 6773, doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00067技术方法水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法丁承强, 马丹, 王绍华, 丁艳锋*南京农业大学农学院, 南京 210095摘要 双向电泳是分析蛋白质混合物的一种有力手段, 已在蛋白质组研究中得到广泛应用。水稻(Oryza sativa)作为重要的粮食作物, 对其蛋白质组学研究开展较早。但由于技术复杂, 对实验操作要求高, 初学的研究者很难在较短的时间内掌握该 实验技术。该文介绍了水稻研究中适合多个组织的双向电泳实验方法和优化流程。

2、该优化流程能使新的研究者逐步优化实 验条件, 更快更好地完成双向电泳实验。同时详细介绍了实验关键环节的操作方法。关键词 蛋白质组学, 水稻, 双向电泳丁承强, 马丹, 王绍华, 丁艳锋 (2011). 水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法. 植物学报 46, 6773.双向电泳作为蛋白质组研究的3大核心技术之一(另2种是质谱技术和蛋白质组信息学), 是由OFarrel 于1975年建立的, 并成功分离到约1 000个大肠杆菌 蛋白质。这项技术利用蛋白质的2种特性, 分2步将蛋 白质混合物进行分离。第1步为等电聚焦(isoelectric focusing, IEF), 即根据蛋白质等电点(pI)

3、的差异将蛋 白质分离开。第2步为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝 胶电泳(SDS-PAGE), 即根据蛋白质相对分子量(Mr) 的差异将蛋白质进行分离。理论上, 不同的蛋白质可 以通过这2步分离以单个蛋白质斑点呈现在凝胶图谱 上。在最初的双向电泳技术中, 由于第1向使用的是 含有载体两性电解质的聚丙烯酰胺管胶, 双向电泳的 分辨率和可重复性较低。后来Gorg开发出新的双向电 泳技术, 即用固相pH梯度代替载体两性电解质产生 的pH梯度, 并用一面带有支持膜的凝胶代替管状凝 胶进行第1向蛋白质分离。此后这一技术得到广泛的 应用。目前利用双向电泳技术, 在水稻(Oryza sativa) 中的研究很多

4、, 范围也非常广泛, 涉及水分(Ali and Komatsu, 2006)、温度(Lin et al., 2005; Hashimoto and Komatsu, 2007)、盐胁迫(Yan et al., 2005)、CO2 (Bokhari et al., 2007)、激素(He and Li, 2008)、重金 属 (Yang et al., 2007b) 、生 长发 育 (Yang et al.,2007a)、虫害(Wei et al., 2009)、病害(Kim et al.,收稿日期: 2010-09-20; 接受日期: 2010-11-092004)、有机物(Ge et al.

5、, 2008)和农药(Lin et al.,2008)等。然而, 由于双向电泳实验环节较多, 处理方法各 异, 使初学者难以掌握。在已经发表的介绍实验方法 的文献中, 主要进行了各实验条件的比较(丁坤善等,2005; 付忠军等, 2009; 王清等, 2009), 只有经验丰 富的研究人员才能从中得到进一步优化实验的信息。 而没有研究经验的人员在进行实验方法的摸索时, 往 往不知道应该先进行哪种条件的优化。在面对不理想 的胶图时, 也无法确定是由哪些条件的处理不当引起 的, 往往无序地进行实验条件的摸索, 造成时间和金 钱的大量浪费。另外在国内还未见有文献介绍水稻中 双向电泳的实验方法。由于水

6、稻组织具有一定的特异 性, 即使在已经发表的论文中, 双向电泳图谱的质量 仍然不高。存在的主要问题有 : 竖条纹 严重 (Sengupta and Majumder, 2009)、染色较深(Lee et al., 2007)以及分离胶浓度不合理(Jagadish et al.,2010)等。因此有必要对水稻的双向电泳分离技术进 行系统的分析介绍。本文介绍了一套双向电泳实验优化流程, 并利用 这一优化流程进行了水稻茎和幼穗的蛋白质分离, 证 明这一流程在水稻各个组织的双向电泳中具有普适性。此外, 本文还介绍了大量实验中的细节问题, 这 些问题往往是初学者经常遇到的, 很容易导致实验结基金项目:

7、国家自然科学基金(No.30471016)和国家科技支撑计划(No.2006BAD02AB-3-2)* 通讯作者。E-mail: dingyf果不理想。我们力图使更多的初学者能尽快掌握这一实验技术, 以期有力推广水稻蛋白质组的研究工作。所用试剂均为国产分析纯试剂。以上所有试剂均为分析纯, 所有溶液均使用超纯 水配制。1材料与方法1.3 双向电泳1.3.1 蛋白质提取液氮预冷研钵, 称量1.5 g水稻根部组织, 冷研钵中将 样品反复加液氮研磨至粉末状。将样品转移到50 mL 离心管中, 加入10倍体积(相对于样品)的10%(w/v) TCA-丙酮(含1 mmolL1 PMSF, 10 mmolL

8、1 DTT) 悬浮, 超声处理5分钟, 于20C下静置过夜后, 4C、20 000 g离心15分钟, 弃上清。用10倍体积(相对于 样品 ) 的丙酮 ( 含 1 mmolL1 PMSF, 10 mmolL1DTT)重悬沉淀, 20C下静置1小时后, 4C、20 000g离心15分钟, 弃上清。用10倍体积(相对于样品)的 乙醇/乙醚(1:1)混合液重悬沉淀, 于20C下静置过 夜后, 4C、20 000 g离心15分钟, 弃上清。再次用 丙酮溶液重悬沉淀1次后, 离心取出沉淀真空干燥约5分钟(避免干燥过度)。另一种处理方法是在TCA-丙 酮沉淀后, 使用80%丙酮沉淀蛋白质(重复3次)。得到干

9、粉后, 每20 mg干粉末加入200 L蛋白质 抽提液, 超声处理5 分钟, 20C 下充分溶解1 小时,20C、35 000 g离心15分钟。取上清重复离心1次, 所得上清即为提取的蛋白质溶液。采用Bradford法进 行蛋白质定量。1.1 材料扬稻6号(Oryza sativa L. ssp. indica)在Yoshida水培 液(Yoshida et al., 1976)中培养2个月后, 切取整个根 部组织, 立即放入液氮中冷冻, 并保存在80C。成 熟期的茎、幼穗组织取自盆栽培养的水稻。1.2 试剂配制蛋白质抽提液: 7 molL1 尿素(GE), 2 molL1 硫脲 (GE),

10、4%(w/v)CHAPS(Sigma), 0.5%(v/v)两性电解 质(pH3.59.5, GE), 1 mmolL1PMSF(Amresco), 10 mmolL1DTT (Amresco)。分装后于20C保存。考马斯亮蓝G-250 原液 : 100 mg 考马斯亮蓝G-250(Amresco)溶于50 mL 95%乙醇, 加入100 mL85%(w/v)磷酸; 考马斯亮蓝工作液(使用前配制): 将 原液与双蒸水按15:85(v/v)混匀, 过滤。2 gL1牛血清白蛋白(BSA, Sigma)溶液储液, 配制后于室温稳定2小时。分装后在20C可保存68 个月, 80C下保存1年。胶条平衡缓

11、冲液储液: 6 molL1尿素, 2%(w/v) SDS(Sigma), 0.38 molL1 Tris-HCl(pH8.8)(Amresco),20%(v/v) 甘油(Amresco), 分装后于20C 保存; 胶条平衡液A: 使用前每10 mL储液中加入0.1 g DTT; 胶条平衡液B: 使用前每10 mL储液中加入0.2 g碘乙 酰胺(BIO-RAD)。琼脂糖封胶 液 : 0.5% 琼脂糖 (Amresco), 25 mmolL1Tris, 192 mmolL1甘氨酸(Amresco), 0.1% (w/v) SDS, 0.001%溴酚蓝(Amresco)。电泳缓冲液: 25 mmol

12、L1 Tris, 192 mmolL1甘 氨酸, 0.1%(w/v) SDS。固定液: 200 mL乙醇, 50 mL冰醋酸, 定容到500 mL; 敏化液: 150 mL乙醇, 34 g乙酸钠, 1 g硫代硫酸 钠, 定容到500 mL; 银染液: 1.25 g AgNO3, 200 L37%甲醛(使用前加入), 定容到500 mL; 显色液: 25g Na2CO3, 400 L 37%甲醛(使用前加入), 定容到1L; 终止液: 10 g甘氨酸, 定容到500 mL。银染步骤中1.3.2 等电聚焦本实验分别采用pH310NL、pH47和pH58 17 cm IPG胶条进行等电聚焦。上样体积

13、为300 L, 按照上 样量的大小计算所需样品体积、上样缓冲液体积及两 性电解质体积(pH310NL)。混匀后于35 000 g离心15分钟。取上清液300 L加入聚焦盘中, 将IPG胶条 胶面朝下放入槽内, 使上样缓冲液均匀分布在槽内, 并确保无气泡后, 加入1.5 mL矿物油, 加盖。放入等 电聚焦仪(Bio-Rad)中, 温度控制在20C, 被动水化6 小时, 主动水化(50 V)6小时。水化结束后立即开始等电聚焦, 推荐程序见表1。1.3.3胶条平衡完成等电聚焦程序的步骤4后, 用超纯水冲洗胶条5丁承强等: 水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法 69表1 等电聚焦程序(每个胶条限流50

14、A, 20C)Table 1 The program of isoelectric focusing (limit to 50 Aper strip, 20C)表2 SDS-PAGE分离胶配方Table 2 The volume of each component in the separating gel of SDS-PAGEStepVoltage rampingmethodVoltage(V)Time (hours/voltagehours)ComponentVolume (mL)10% sepa-rating gel12% sepa-rating gel12345RapidRapid

15、Linear RapidRapid2001 0008 0008 0005001 h1 h2 h60 000 V h5 h30% acrylamide, 0.8%N,N-methylenebis acrylamide1.5 molL1 Tris (pH8.8)10% SDS10% ammonium persulfateTEMED Ultrapure waterFinal volume16.72012.50.50.50.0219.85012.50.50.50.0216.550秒,然后放入加有6 mL胶条平衡液A的水化盘中平衡15分钟。立即冲洗5秒, 放入6 mL平衡液B中再平衡15分钟。1.3.4

16、 SDS-PAGE配制凝胶的各成分比例参照表2, 聚合2小时以上。室 内温度低于20C 时, 可增加过硫酸铵(ammonium persulfate)的量(最多30%), 以加快聚合。而当室内温 度高于30C时, 减少30%的过硫酸铵, 可减缓聚合, 提高凝胶质量, 但同时要避免凝胶聚合时间过长。凝胶聚合后, 用电泳缓冲液冲洗凝胶上端。将平 衡好的胶条放在凝胶上端, 并排除气泡。倒掉多余的 电泳缓冲液, 加琼脂糖封胶液封住胶条, 即将凝固 时, 加入含标准蛋白质的滤纸片。将凝胶放入电泳槽 (Bio-Rad PROTEAN PLUS Dodeca cell), 第1步在50 V下电泳40分钟,

17、第2步在200 V下电泳至结束(溴 酚蓝迁移至底边)。向电泳分离图。从图1可以看出, 该优化流程是有效的。蛋白质点在整个胶图中分布均匀, 数量多且圆,没有明显的拖尾及横向条纹, 且胶图背景干净。 当进行水稻蛋白质双向电泳实验时, 按照4步优化方法能够在很短的时间内获得很好的实验结果。4 步法优化流程为: 蛋白提取方法、第2向分离胶凝胶 浓度、上样量和聚焦程序。2.2 蛋白质提取方法的优化蛋白质的提取是双向电泳的第1步, 也是最为关键的 一步。图2A显示了利用Tris-HCl缓冲液提取蛋白质, 经过TCA-丙酮沉淀及3次丙酮清洗后的电泳结果。图2B为利用TCA-丙酮法提取蛋白质的电泳结果。通过

18、比较图2A和B可以看出, 不同的蛋白质提取方法对双 向电泳的分离效果影响巨大。根据不同的研究目的, 应选择不同的蛋白质提取方法。如果需要研究组织中 尽可能多的蛋白质, 可以选择TCA-丙酮法。这一方法 是目前应用最广的蛋白质提取方法。而当研究目的是 可溶性蛋白质时, 可以使用Tris-HCl 缓冲液进行提 取。如果研究不同的亚细胞器, 则最常使用梯度离心 的方法, 分别提取不同亚细胞器的蛋白质。大部分研究都需要尽可能多地分离蛋白质。按照 这一目的, 我们对TCA-丙酮法进行了调整。根据我们 的实验结果, 在水稻中利用乙醇/乙醚(按照1:1的比例 混合)清洗沉淀的效果更好。具体实验流程可以参考

19、“材料与方法”中的蛋白质提取部分。如果提取的组织中含有大量的糖类, 可以增加乙醇/乙醚的清洗次1.4 银染将凝胶从玻璃板中取出, 放入瓷盘中进行染色。按以 下步骤进行: 固定处理30分钟; 敏化30分钟; 水洗10 分钟, 重复3次; 银染20分钟(遮光); 水洗1分钟(重复2次); 显色30秒, 倒掉显色液, 加入新的显色液,到染色点清晰可见; 终止处理2小时。直2结果与讨论2.1 优化流程及适用性通过大量的实验, 摸索总结出一套行之有效的用于水 稻组织的双向电泳实验优化流程。图1为使用该流程 进行优化后水稻根(A)、茎(B)和幼穗(C)中蛋白质的双图1 水稻不同组织蛋白质的双向电泳凝胶图(

20、A) 根; (B) 茎; (C) 幼穗Figure 1 2-D electrophoresis maps of proteins in different tissues of rice(A) Root; (B) Stem; (C) Young panicle数。这种方法得到的双向电泳图, 背景比用丙酮清洗的更加干净。pH310 的 IPG 胶条 , 上样 量往往在 100200 g;pH58或pH47的胶条, 上样量一般在200300 g。 在完成蛋白质提取方法和凝胶浓度的优化后就 可以进行上样量的优化。这步优化是极为重要的。很 多研究者并不重视该步骤, 认为上样量只要差别不大 对结果影响很

21、小。其实不然。图3AD显示, 上样量依 次递减20 g, 分离结果相差很大。上样量增大, 分离 的蛋白质点数减少(图3A); 上样量减小, 胶图背景变 深(图3D)。综合比较各个上样量的分离效果, 选择蛋 白质点数多且背景较好的上样量进行双向电泳实验。 就此实验来说, 图3C中蛋白质点数较多且背景在可 接受的范围内, 但是蛋白质点横纹较多, 所以还需要进行聚焦程序的优化。2.3 SDS-PAGE凝胶浓度的优化第2向凝胶浓度对蛋白质的分离效果影响很大。这就 需要确定一个较适宜的分离胶浓度。不同物种的最佳 分离胶浓度 不同 , 如大豆 (Glycine max) 、棉花 (Gossypium sp

22、p.), 较为适宜的分离胶浓度为12%; 但是在水稻中, 采用10%的分离胶浓度效果更好。从 图2可以看出两者的差异明显。图2B显示, 采用12% 的分离胶浓度, 大部分蛋白质集中于胶图的中部和上 部。通过将分离胶浓度减小, 可以显著拉大蛋白质点 的间距。如图2C所示, 采用10%的分离胶浓度, 蛋白 质点分布更加均匀, 这样在调整好上样量后能够分离 到更多的蛋白质。在研究过程中, 还应根据研究目标蛋白质的不 同, 对分离胶的浓度进行适当调整。如NB-LRR是一 类参与植物抗病的蛋白质。这类蛋白质分子量较大, 通常大于100 kDa。因此当研究植物的抗病反应时,2.5 聚焦时间的优化通过电泳图

23、可以很容易地判断聚焦时间是不够还是 太长, 只要适当调整就能较快地确定合适的聚焦伏小 时数。如图3C和D所示, 蛋白质点的右侧有明显拖尾 而左侧没有, 这是由于聚焦伏小时数过多, 聚焦过度 引起的, 应减少聚焦时间。图4A中蛋白质点的两侧均 有明显的拖尾, 这是由于聚焦伏小时数过少, 没有完 全聚焦引起的, 应增加聚焦时间。通过最后的聚焦程序优化, 就可以很好地分离水 稻组织蛋白质(图1AC)。但是双向电泳操作步骤繁 多, 很多环节细节处理的好坏往往决定了最终实验的 成败。在讨论中将对决定分离效果的关键环节进行为了尽可能多地分离这类蛋白质,胶的浓度。就应适当减小分离2.4上样量的优化对上样量影

24、响最大的因素有2个:一是染色方法, 如果采用银染, 那么上样量通常在100300 g; 二是IPG胶条, IPG胶条的pH值范围越大, 上样量越少。丁承强等: 水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法71图3 上样量的优化(A) 160 g; (B) 140 g; (C) 120 g; (D) 100 gFigure 3 Optimization of sample load(A) 160 g; (B) 140 g; (C) 120 g; (D) 100 g图2 蛋白提取方法和SDS-PAGE凝胶浓度的优化(A) Tris-HCl提取法, 12%凝胶浓度; (B) TCA-丙酮提取法, 12%凝胶浓

25、度; (C) TCA-丙酮提取法, 10%凝胶浓度Figure 2 Optimization of protein extraction methods andSDS-PAGE concentration(A) Tris-HCl buffer method, 12% gel concentration; (B) TCA- acetone method, 12% gel concentration; (C) TCA-acetone method, 10% gel concentration图4 双向电泳实验中的常见问题(A) 横条纹; (B) 胶图扭曲; (C) 竖条纹; (D) 染色过度详述。

26、Figure 4 Common problems in 2-D electrophoresis(A) Horizontal streaking; (B) Distortion of 2-D pattern; (C)Vertical streaking; (D) Over-staining2.6 讨论在蛋白质提取过程中, 要尽量保持低温, 同时添加 DTT、EDTA和PMSF以减少蛋白质的降解和修饰。 在测定蛋白质浓度时, 使用GE或Bio-Rad的试剂盒 能提高定量的准确度和可重复性, 并且所有样品应尽量同时测定。蛋白质提取液最好分装使用, 避免反复冻融。在进行IPG胶条水化前, 蛋白质样品应

27、在30 000g的转速下离心30分钟, 这有助于减少条纹。在进行 等电聚焦程序时, 经常碰到的问题是, 电压很难升到 最高电压。如果步骤4很难一开始就升至8 000 V, 可 以将步骤2延长至3小时。如果仍难达到, 则可以同时 将步骤3延长至3小时。由于植物组织间的差异性, 步 骤4可以进行适当调整, 一般为50 00070 000 Vh, 以使蛋白质斑点聚焦成一个圆点。在做胶条平衡前, 可以利用步骤5短期保存IPG胶条, 但时间不宜过长。 也可以将胶条冲洗后, 于70C保存待用, 但最终的 分离效果会变差。聚焦步骤的效果决定了是否会有明显的横条纹, 而竖条纹主要受IPG胶条向SDS-PAGE

28、转移过程的 影响。当转移到凝胶上方时, 要在使IPG胶条紧贴 SDS-PAGE上沿的同时, 不能损坏IPG胶条并且排除 胶条与SDS-PAGE间的气泡。当凝胶上沿或胶内有气 泡时会观察到类似图4B的现象。IPG胶条或第2向凝 胶胶面损坏后会出现类似图4C的现象。在进行第2向电泳时, 每次跑胶的数量应相同。 不同的凝胶数量对电泳过程中的电流变化影响很大。 多次实验间会由于不同的电流而影响蛋白质点的相 对位置, 这对胶图的分析比较会造成较大的困难。为 了尽量缩小不同实验批次对胶图的影响, 可以通过增 加空白的第2向凝胶来加以调节, 以确保较高的重复 性。凝胶染色的效果直接决定了实验的成败。染色操

29、作中主要注意2点: 一是实验中使用的甲醛必须是新 鲜的, 尽量使用生产日期较近且新开封的甲醛溶液; 二是显色前的水洗时间要严格控制。水洗时间过短,完善操作细节, 减少条纹以降低胶图分析的复杂度。但是由于各个实验室的条件不同加之双向电泳的复 杂性, 还有许多问题需要解决。在获得较好的胶图后, 应尽快利用质谱技术鉴定差异蛋白质, 不应将大量时 间用于双向电泳图谱的完善上。参考文献丁坤善, 郑彩霞, 包仁艳, 姜春宁 (2005). 油松雌性不育系球果蛋白质双向电泳. 植物学通报 22, 190197.付忠军, 丁冬, 进茜宁, 王长城, 李永亮, 汤继华 (2009). 玉 米花丝蛋白质组双向电泳

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35、 则会引起背景变黄,时间变长, 蛋白质点明显减少。当室温较高时,当减少甲醛用量, 避免显色过快; 室温较低时,显色应适 则应增加甲醛用量, 加快显色进程。显色时间一般控制在24分钟, 如果时间过长, 也应该检查药品并更换新 的染色药品。第1次显色时, 溶液变浑浊后, 不要用手 指按压有蛋白质点的区域, 否则会留下指纹。第2次 显色时, 注意观察凝胶的背景色, 并及时终止。否则 染色过深(图4D)不利于图谱分析。总之, 本文介绍的优化流程能够使新研究者在进 行双向电泳实验条件的摸索时, 减少实验的盲目性, 明确每个阶段的优化目标, 加快实验流程, 通过不断丁承强等: 水稻蛋白质组双向电泳优化流程

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41、ract 2-D electrophoresis is a powerful tool for analyzing protein mixtures. It has been widely used in proteomeresearch. Rice is an important food crop, and proteomic research into rice has been extensive. Because of the technical complexity and time constraints, performing the procedure accurately

42、has been difficult. This paper describes an optimi- zation process for 2-D electrophoresis of various organs of rice. This method can help researchers optimize experimentalconditions with better accuracy.Key words proteomics, rice, 2-D electrophoresisDing CQ, Ma D, Wang SH, Ding YF (2011). Optimization process and method of 2-D electrophoresis for rice proteomics.Chin Bull Bot 46, 6773.* Author for correspondence. E-mail: dingyf(责任编辑: 刘慧君)