毕业设计（论文）紫草素S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用机制的研究.doc

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1、 学号：0648010217药学院毕业论文论文题目： 紫草素S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用机制的研究 学 生： 指 导 教 师： 年 级、专 业：06级药学02班2010年 月 日牡丹江医学院药学院毕业论文论文题目： 紫草素对S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用机制的研究 In HeLiu mice S180 anti-freckle anti-tumor effect mechanism of research 学 生： 专 业： 药 学 指 导 教 师： 单位： 牡丹江医学院药学院 协助指导教师： 单位：牡丹江友博药业 学习期限：2006年9月至2010年7月学位授予单位：牡 丹 江 医 学 院学术诚信

2、承诺本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得牡丹江医学院或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。签名：_ 日期：_关于论文使用授权的说明本人完全了解牡丹江医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本论文内容以任何形式公开发表或成果转让时须经导师同意。（保密的论文在解密后应遵循此规定）签名：_ 导师签名：_ 日期：_目 录一中文摘要

3、1二英文摘要2三前言3四文献综述4五材料与方法75.1实验材料75.1.1 实验动物及动物瘤株75.1.2 实验仪器75.1.3实验药品与试剂75.2实验方法75.2.1流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率75.2.2流式细胞仪检测P53蛋白8六结果96.1流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率96.2流式细胞仪检测P53蛋白11七讨论137.1紫草素对S180荷瘤小鼠肿瘤抑制率的影响137.2流式细胞仪测定细胞周期137.3对P53蛋白表达的影响13八结论148.1紫草素抗肿瘤作用的药效学研究148.2紫草素的抗肿瘤作用机制14九参考文献15十致谢17十一英文缩写18中文摘要 目的 通过利用特异性荧光探针

4、标记待测的生物靶点，根据荧光信号强弱反映检测目标的变化从而对S180细胞周期变化和P53蛋白含量进行检测以证明紫草素具有良好的抗肿瘤作用。 方法 采用流式细胞仪检测S180细胞周期变化和P53蛋白的含量。结果 随紫草素剂量的增加，S180细胞G1期和S期的含量逐渐增多，故可推测紫草素作用于细胞时，可把细胞阻滞于G1期和S期。随紫草素剂量的增加，P53蛋白的表达随之升高。这说明，紫草素可能上调P53的活性而诱导细胞凋亡。结论 从实验结果可看出紫草素在体内具有良好的抗肿瘤作用。关键词：紫草素；细胞凋亡；Caspase-3,9AbstractThrough the use of specific f

5、luorospectrophotometric probes to mark the biological targets, the fluorescent signal strength to reflect the changes of target detection and S180 cell cycle changes and P53 protein content of the tests are carried out to prove anti-freckle grain has good antitumor effect Increasing the doses of shi

6、konin, S180 cells in G1 phase and S phase in gradually was increasing, it can speculate that when the shikonin act on cells, the cells were blocked in G1 and S phase.It could be found that P53 protein expression rate was increased when increasing doses of shikonin. This showed that shikonin may incr

7、ease the activity of P53 to induce apoptosis.From the experiment results can be applied to see in body good antitumor function Key Words: shikonin; apoptosis;Caspase-3, 9前 言肿瘤是一种严重危害人类生命和健康的疾病，其危害性仅次于心血管疾病，是人类的首要顽敌。随着人类生存环境和生活习性的改变，在不良的外部环境和一些不利因素作用下，肿瘤的发病率正在逐步上升。面对这一严重的社会问题，当今世界控制癌症的主要目标是降低癌症的死亡率，提

8、高生存率。但是迄今的所有抗肿瘤化疗药物几乎无一超出细胞毒作用的范围，毒副作用大大限制了它的广泛应用和疗效的发挥，因此，寻找低毒高效的天然抗肿瘤药物一直是近年研究的热点1。大多数药物都是通过诱导肿瘤细胞凋亡进而达到控制肿瘤的目的。在这个凋亡过程中线粒体发挥着重要作用。在各种刺激所诱导的细胞凋亡的实验中发现，细胞凋亡时线粒体膜的通透性增加，线粒体内的各种蛋白质被释放出来。通过一系列的反应最终诱导细胞发生凋亡。从文献报道可以发现，目前对紫草素的研究在体外细胞水平上研究了紫草素对不同肿瘤细胞的抑瘤活性及其作用机制，在动物水平上，只对紫草的粗品进行抑瘤活性研究，因此，本试验从动物（S180小鼠）水平上系

9、统地研究紫草素的抑瘤活性及其体内促凋亡机制，主要从线粒体途径研究其促进肿瘤细胞凋亡机制。 文献综述 近年来，肿瘤基础领域的研究取得了很大的进展，尤其是现代分子生物学技术的发展，使人们对肿瘤本质的认识有了新的突破，人类基因组计划的完成极大地推动了肿瘤治疗新方法和一些新型抗肿瘤药物的开发。目前，抗肿瘤药物的研究正从传统的细胞毒型药物向基因治疗产品和针对癌症关键治病基因的特异性拮抗剂发展。预计一些新型药物如:抗血管生成药物、反义药物、蛋白激酶C抑制剂、癌基因抑制剂、细胞凋亡激动剂和端粒酶抑制剂、抗癌疫苗、基因药物、新的单克隆抗体产品以及对现有产品的更新，将成为抗癌药市场的主流2 。线粒体在细胞凋亡的

10、过程中发挥重要作用。在各种刺激所诱导的细胞凋亡的实验中发现，细胞凋亡时线粒体膜的通透性增加，线粒体内的各种蛋白质被释放出来。这些蛋白包括细胞色素c及细胞凋亡因子AIF (apoptosis inducing factor)等。细胞接到凋亡信号时，线粒体释放细胞色素C到细胞质中，与凋亡蛋白霉活化因子Apaf-1及caspase-9前体形成凋亡体(apoptosome)，在细胞质中存在的dATP的共同作用下，活化caspase-9前体，启动caspase级联反应，最终诱导细胞发生凋亡。P53在细胞凋亡的调控中也起着重要的作用。它的主要功能是对G1和G2/M期校正点的监测。P53下游基因P21编码蛋

11、白是一个依赖cyclin的蛋白激酶抑制剂，可与周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)与cyclin的复合物cyclin-cdk结合抑制相应蛋白激酶的活性，引起G1期阻滞。P53下调cyclin B 1的表达，细胞不能进入M期。Caspase家族在细胞凋亡的调控中同样起着举足轻重的作用。Caspase主要受其激活因子和抑制因子的调节，一个凋亡信号往往能引发辅因子、caspase启始因子及抑制因子三条途径的调控：在辅因子激活过程中，Bax促进 cyto c的释放，而Bcl-2则阻止cyto c的释放3。 Bcl-2通过与Apaf-1的相互作用，阻止cyto

12、c对caspase的激活，延迟细胞凋亡。但当Bcl-2与Bax形成异二聚体时，则又启动死亡周期4 ；调控caspase启始因子与辅因子的相互作用也能实现对细胞凋亡的调节；细胞凋亡抑制因子(inhibitors of apoptosis, IAPs)家族则是通过抑制caspase效应分子的活性来阻止凋亡的5。紫草素及其衍生物的抗肿瘤作用越来越受到重视。Singh6等证明，紫草素能显著抑制人表皮癌细胞(A431)的生长，抑制强度与药物处理的时间及药物浓度呈依赖性，吴振7等也证明，紫草素能显著抑制人恶性黑色素瘤细胞(A375-S2)、人宫颈癌细胞（hela）、人乳腺癌细胞(MCF-7)、小鼠纤维肉瘤

13、细胞(L929)的生长，并呈剂量和时间依赖性，且对四种细胞的IC50值均小于90uM，表明紫草素对多种肿瘤均有较强的细胞毒活性。紫草素又称紫草醌，化学结构为萘醌类，英文名:shikonin，分子量:288.2994，分子式：C16H16O5，化学名：（+）-5，8-dihydroxy-2-（1-hydroxy-4-methyl-3-pentenyl）-1，4-naphthoquinone。（结构式如图1-1）紫草素是紫红色带有金属光泽的针状晶体，熔点147149，微溶于水，易溶于苯、乙醇、乙醚等有机溶剂，由于能够吸收500-560nm波长的光而呈现红色，且吸收光谱会随pH而发生迁移。它具有酸碱

14、稳定性，并且溶液颜色随着pH而变化，酸性条件下呈红色，中性时紫色，碱性时呈蓝色。图1-1 紫草素的结构目前对紫草素的抗癌机制研究较多，其可能的机制有：选择性地抑制DNA拓扑异构酶I。拓扑异构酶(topoisomerase)在细胞的分裂和增殖中起着重要作用。拓扑异构酶I减少DNA的负超螺旋，而拓扑异构酶II引入的DNA负超螺旋。它们的协同作用控制着DNA的拓扑异构结构。复制时需要较高水平的负超螺旋，有利DNA解旋。复制结束后需要降低DNA的负超螺旋水平，以便在活性染色质(常染色质)部位进行转录8。紫草素对拓扑异构酶I有强力的抑制作用。它和阿卡宁(alkannin)是拓扑异构酶I潜在的抑制剂，对拓

15、扑异构酶I有强力的抑制作用。线粒体途径：紫草索诱导A375-S2细胞的凋亡是通过线粒体途径发挥作用的。线粒体在细胞凋亡的过程中发挥重要作用。在各种刺激所诱导的细胞凋亡的实验中发现，细胞凋亡时线粒体膜的通透性增加，线粒体内的各种蛋白质被释放出来。这些蛋白包括细胞色素c及AIF (apoptosis inducing factor)等。细胞接到凋亡信号时，线粒体释放细胞色素c到细胞质中，与Apaf-1及caspase-9前体形成凋亡体(apoptosome)，在细胞质中存在的dATP的共同作用下，活化caspase-9前体，启动caspase级联反应，最终诱导细胞发生凋亡。肿瘤是威胁人类健康和生命

16、安全的重要疾病。对它的治疗多采用手术疗法9、放射线疗法10、化学药物疗法11、介入疗法以及中药的内服、外救等方法12。近年来，肿瘤基础领域的研究取得了很大的进展，尤其是现代分子生物学技术的发展，使人们对肿瘤本质的认识有了新的突破，推动了肿瘤治疗新方法和新型抗肿瘤药物的开发。但是迄今抗肿瘤化疗药物几乎都存在细胞毒作用，因此寻找低毒高效的天然抗肿瘤药物成为人们研究的热点。紫草素存在于紫草科植物紫草的根，从紫草的根中分离得到的生物活性成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤13等生物活性，国内外对紫草素防癌抗癌的药用研究有许多报道。现代科学研究证实紫草素的防癌抗癌功效确切、显著，但目前的实验多采用体外实验来进行

17、抗肿瘤作用研究，体内抗癌作用机制还未见报道。本课题就紫草素体内抑瘤实验、体内凋亡机制等方面进行抗肿瘤作用研究，为人类攻克癌症提供有效的药物和理论依据，从而有利于进一步的新药研发和临床应用。 材料与方法5.1实验材料5.1.1 实验动物及动物瘤株昆明种小鼠，18-22g，雌雄兼用，由哈尔滨市肿瘤医院动物养殖中心提供。动物移植性肿瘤小鼠S180，由哈尔滨医科大学附属肿瘤医院提供。5.1.2 实验仪器光学显微镜 (Leica公司) Sartorius BS110S型万分之一电子天平(德国BSS)LD4-2A型台式低速离心机(北京医用离心机厂) 微量移液器(Gilson SAS公司) 涡旋振荡器(江苏

18、海门麒麟医用仪器厂) HH-S恒温水浴(天津市泰斯特仪器有限公司) CLOUTER EPICS-XL流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司)5.1.3实验药品与试剂紫草素 徐州弘康科技有限公司，含量（30%） 无水乙醇 天津市化学试剂分厂六厂5-氟脲嘧啶 浙江海正药业股份有限公司生理盐水 哈尔滨制药六厂 苏木素 武汉博士德生物工程有限公司小牛血清白蛋白(BSA) Sigma公司 多聚甲醛 武汉博士德生物工程有限公司 95%乙醇 天津市天新精细化工开发中心 甲醛 天津市天新精细化工开发中心 30%双氧水 沈阳市新西试剂厂 枸橼酸盐缓冲液 武汉博士德生物工程有限公司 TritonX-1

19、00 上海华舜生物工程有限公司 兔抗P53 武汉博士德生物工程有限公司 FITC标记山羊抗兔IgG 武汉博士德生物工程有限公司5.2实验方法5.2.1流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率14,15小鼠分组及给药: 分组：将接种小鼠随机分为5组，每组10只。分别为实验组：高剂量组、中剂量组、低剂量组；阳性对照组：5-Fu；阴性对照组：10%乙醇。给药：小鼠接种相应的肿瘤细胞24小时后实验组采用腹腔给药紫草素10 mgkg-1d、5 mgkg-1d、2.5 mgkg-1d，阳性对照组5-Fu 20 mgkg-1d，阴性对照组同体积10%乙醇。无菌连续给药10天。肿瘤细胞的制备：无菌条件下处死S180小鼠

20、，然后将瘤块取下来放在300目细胞筛上进行研磨，再加入PBS溶液清洗，1000 rmin-1，离心10min，去上清，重复两遍，最后再加入PBS调成浓度为1106 L-1，混匀制成细胞悬液备用。细胞涂片的制作16,17：取适量离心后的沉淀物，置于载玻片的合适位置，再用推玻片（推玻片必须是边缘非常光滑无缺口的玻片）的边缘接触载玻片上的沉淀物，这时沉淀物会立即沿着载玻片与推玻片的边缘渗开，可根据沉淀物的稠稀程度，选择适宜的角度（指推玻片与载玻片之间的角度）和速度向前匀速推进，直至沉淀物推完为止。在推片过程中，不能改变角度和速度，更不能中途停顿，必须一气呵成，否则推出来的涂片厚薄不匀。在沉淀物较稠时

21、，宜选择角度小、速度慢进行推片，沉淀物较稀时反之则是。固定：用体积分数为4%的多聚甲醛在常温下固定5-10 min。染色：苏木素染色5min，自来水洗1min，盐酸乙醇分化30s，自来水浸泡15 min，用伊红复染2min。常规脱水、透明、封片：用95%的乙醇洗涤两次，每次1min。再用无水乙醇洗涤两次，每次1min。然后用二甲苯透明1min，再重复透明一次。最后用中性树脂封固，在显微镜下观察。5.2.2流式细胞仪检测P53蛋白18小鼠分组及给药: 同（5.2.1）。肿瘤细胞的制备：同（5.2.1）。细胞的免疫荧光标记：加入4%多聚甲醛的PBS固定5min。再次离心后室温加入0.1Triton

22、X-100的PBS液洗后，用含5%BSA的PBS洗两次，离心弃上清后，加入兔抗P53（1：50），在冰上孵育30 min。PBS液洗后，加入FITC标记羊抗兔抗体（1：200）孵育30 min，PBS洗后，震荡悬于500 L PBS中，300目筛网过滤。流式细胞仪检测参数：488nm激发光，观察515nm处的荧光。结 果6.1流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率流式细胞光度术（flow cytometry，FCM）是将流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术等集为一体，用于对细胞或细胞颗粒定量分析和进行细胞分类研究的一种新技术。其原理是利用特异性荧光探针标记待测的生物靶点，根据荧光信号强弱反

23、映检测目标的变化。细胞凋亡，DNA广泛降解断裂，细胞内DNA含量降低，用DNA结合型荧光探针可直接对细胞DNA染色后FCM分析，检测细胞周期的变化；细胞的每一期的异变都能够导致细胞的凋亡，从而还可检测出细胞的凋亡率。 0 mgkg-1紫草素对S180细胞的作用 2.5 mgkg-1紫草素对S180细胞的作用S180 cell treated with 0 mgkg-1 shikonin S180 cell treated with 2.5 mgkg-1shikonin 5 mgkg-1紫草素对S180细胞的作用 10 mgkg-1紫草素对S180细胞的作用S180 cell treated w

24、ith 5 mgkg-1 shikonin S180 cell treated with 10 mgkg-1shikonin20 mgkg-15-Fu对S180细胞的作用S180 cell treated with 20 mgkg-15-Fu 图6-1 紫草素对S180小鼠肿瘤细胞周期的影响 Pig 6-1 The effects of shikonin on S180 cell cycle kineticsGroupG0/G1(%)S(%)G2/M(%)Apoptosis(%)Control10.09250.9322419.63630.8047970.27130.33396Shikonin-

25、Low18.25000.77332*29.77000.84099*51.98000.74529*9.7230.27912Shikonin-Mid39.24250.85433*37.34630.71276*23.41130.66919*16.2100.36376Shikonin-High47.35130.83498*40.34630.66322*12.30251.22080*28.8130.152795-Fu51.03500.74606*42.46380.55923*6.50130.58060*33.1750.67328表6-1 紫草素对S180 小鼠肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响（n=10,xS

26、）the effects of shikonin on S180 cell cycle kinetics and cell apoptosis（n=10,xS）*与对照组比较P0.01 * Compared with control difference P0.01 从表6-1实验结果中可以看出，紫草素各剂量组和5-氟尿嘧啶组与阴性对照组相比，都能诱导肿瘤细胞凋亡（P0.01），并且能够影响肿瘤细胞的周期。在G0/G1期和S期中，紫草素各剂量组和5-氟尿嘧啶组与阴性对照组相比，肿瘤细胞的比例明显升高（P0.01），并且随着剂量的升高，肿瘤细胞的比例明显升高；而在G2/M期中，与之相比，肿瘤细胞

27、的比例明显降低（P0.01），并且随着剂量的升高，肿瘤细胞的比例明显降低。6.2流式细胞仪检测P53蛋白 通过免疫标记肿瘤细胞，应用流式细胞仪检测肿瘤细胞的阳性表达率，从而测定肿瘤细胞P53蛋白的表达。 0mgkg-1紫草素对S180细胞的作用 2.5 mgkg-1紫草素对S180细胞的作用S180 cell treated with 0 mgkg-1 shikonin S180 cell treated with 2.5 mgkg-1shikonin 5 mgkg-1紫草素对S180细胞的作用 10 mgkg-1紫草素对S180细胞的作用 S180 cell treated with 5 m

28、gkg-1 shikonin S180 cell treated with 10 mgkg-1 shikonin20 mgkg-15-Fu对S180细胞的作用S180 cell treated with 20 mgkg-1 5-Fu 图6-2 紫草素对S180肿瘤细胞P53蛋白表达的影响Pig 6-2 effect of shikonin on the expression of P53 of S180 cells从图6-2中可看出，紫草素的低、中、高剂量组与阴性对照组相比，都对S180细胞的P53蛋白表达有不同程度的提高，其中高剂量组P53的表达率达56.2%。虽紫草素各剂量组P53的表达均

29、没有阳性对照组高，但随着给药剂量的增加，P53的表达率也随之上升。因此，可推测紫草素可能通过上调P53蛋白的表达诱导S180细胞凋亡。 讨 论7.1紫草素对S180荷瘤小鼠肿瘤抑制率的影响实验结果表明，紫草素对S180小鼠表现出不同的抑瘤作用。与对照组比较高、中剂量组表现出良好的抑瘤效果，有显著性差异（P0.01），低剂量有差异（P0.05），与阳性对照比较，高剂量组抑瘤率略低。通过实验可看出，紫草素在小鼠体内对S180有一定的抑制作用，在一定剂量范围内，随紫草素给药剂量的升高，抑瘤效果越明显，并呈一定的剂量依赖关系。7.2流式细胞仪测定细胞周期从实验结果可以看出，紫草素对细胞各期变化都有影响

30、，同时使G1期细胞的比例增加，S期细胞的比例增加，G2期细胞的比例减少，且呈明显的剂量依赖性，表明紫草素对G1期和S期细胞向G2期移行有一定的阻断作用。因此，可推断紫草素使得细胞阻滞在G1期和S期，使得不能修复的细胞凋亡。7.3对P53蛋白表达的影响实验结果表明，紫草素的低、中、高剂量组与阴性对照组相比，都对S180细胞的P53蛋白表达有不同程度的提高，其中高剂量组P53的表达率达56.2%。虽紫草素各剂量组P53的表达均没有阳性对照组高，但随着给药剂量的增加，P53的表达率也随之上升。因此，可推测紫草素可能通过上调P53蛋白的表达诱导S180细胞凋亡。除促进细胞凋亡外，P53的主要功能还体现

31、在阻滞细胞周期和维持基因组稳定性等。实验中我们同时考察了紫草素对细胞周期的影响。紫草素可明显阻滞细胞周期从G1期到S期的转变，这可能使紫草素抑制细胞生长的主要原因。结 论8.1紫草素抗肿瘤作用的药效学研究体内实验表明，紫草素对S180小鼠肿瘤细胞的生存有明显的抑制作用。8.2紫草素的抗肿瘤作用机制可能与以下几个方面有关诱导肿瘤细胞凋亡；使细胞阻滞于作用时间较长的G1和S期；可能通过上调P53蛋白的表达诱导S180细胞凋亡, 从而起到抗肿瘤的作用。参考文献1 董志勇.新世纪肿瘤防治的目标J中华肿瘤杂志，2002，24：311-3122 马丁，周剑峰肿瘤基因临床产品研发的国外现状及评论J中华肿瘤杂

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