毕业设计（论文）精氨酸激酶（AK）的提取与纯化.doc

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1、学号编号研究类型基础研究分类号Q51毕业论文（设计）Bachelors Thesis论文题目精氨酸激酶（AK）的提取与纯化作者姓名指导教师所在院系生物系专业名称生物科学完成时间2007年6月6日主要符号对照表AK 精氨酸激酶E.coli 大肠杆菌IPTG 异丙基硫代-D-半乳糖苷Kanamycin 卡拉霉素CMC CM-CelluloseS-100 SephacrylTM-1002-mercaptoethanol 巯基乙醇Glycine 甘氨酸PMSF 苯甲基磺酰氟 EDTA 乙二胺四乙酸NaN3 迭氮钠Arg 精氨酸ADP 二磷酸腺苷ATP 三磷酸腺苷h 小时min 分钟目 录1引言11.1

2、精氨酸激酶（AK）11.2蛋白质的分离与纯化22实验试剂以及实验仪器：52.1实验材料52.2主要实验试剂与仪器83实验方法93.1活化菌种93.2扩大培养93.3 IPTG诱导AK基因的表达93.4 蛋白质提取93.5蛋白质的检测103.6蛋白质的纯化104结果与分析124.1 AK诱导表达电泳图124.2 蛋白质经CMC离子交换的层析谱图和电泳图134.3蛋白质经分子筛S-100交换的层析谱图和电泳图144.4蛋白质经Qsepharose阳离子交换的层析谱图和电泳图164.5 AK经各步纯化后的SDS-PAGE电泳图谱175讨论18参考文献：20精氨酸激酶（AK）的提取与纯化 摘要：精氨酸

3、激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。重组有AK基因的E. coli Rosetta，在含有50 g/ml的卡纳霉素的LB培养基中培养。当A600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.2 mM的异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时。加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。通过CM-Cellulose阳离子交换层析，SephacrylTM-100凝胶过滤层析，Q-Sepharose阴离子交换层析分离纯化得到电泳纯的精氨酸激酶。关键词：精氨酸激酶 提取与纯化Extraction and Purification

4、of Arginine KinaseAbstract： Argininekinase（ATP：L-arginine phosphotransferaseEC 2.7.3.3），plays an important role in cellular energy metabolism in invertebrate. E. coli Rosetta which contains recombinant AK gene was grown in LB medium containing kanamycin (Final concentration: 25 g/mL). When absorbanc

5、e at 600 nm value was between 0.6 with 0.8, isopropyl -D-thiogalactopyranoside was added to 0.2 mM and the incubation was continued an addition 3 h. The cell was broken and centrifugated, then the crude cell extract was harvested. Furthermore it was purified by following three methods in turn: CM-Ce

6、llulose positive ion exchange chromatography, SephacrylTM-100gel filtrate chromatography, and Q-Sepharose anion exchange chromatography. A purified AK was found to be homogenous by SDS poly -acrylaminde gel electrophoresis. Key words: arginine kinase extraction and purification 精氨酸激酶（AK）的提取与纯化1引言1.1

7、精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶1（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸化的胍基化合物。AK在体内催化如下反应：Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基A

8、K是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。3.环节动物Sabellapavonina中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。某些物种的精氨酸激酶的晶体结构已经被解析出来，AK是由一个小的螺旋组成的N端结构域和一个大的C端结构域组成的，C端结构域与Glu合成酶的C端结构域相似，8股串起来的反平行折叠被7个螺旋所包绕2。过渡态类似物的结合部位不在两个结构域之间，而是在C端结构域的内部3。如下图所示4：图1. 结合有过渡态类似物的AK的晶体结构我们已经克

9、隆有精氨酸激酶基因的菌株，宿主菌含表达质粒pET28a, pET28a含：强启动子序列，两个lac操纵序列；精氨酸激酶基因，核糖体结合位点，多克隆位点，复制起点。在工程菌株中，导入抗Kana青霉素的pET28a质粒，菌株中原有质粒产生阻遏蛋白，这种阻遏蛋白与pET28a的LacO操纵基因结合，阻止外源基因的表达。当加入IPTG诱导时，IPTG与阻遏蛋白结合，解除了阻遏蛋白与pET28a操纵基因结合的抑制作用，使pET28a上面的外源基因能够顺利表达5。IPTG是一种乳糖类似物，我们的主要目的是诱导表达并纯化精氨酸激酶，为后续研究其在蛋白质折叠和分子伴侣中的功能做准备1.2蛋白质的分离与纯化1.

10、2.1细胞的破碎1)高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。2)玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。3)超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波

11、敏感和核酸应慎用。4)反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。5)化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。1.2.2蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。1.2.3蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：1.2.3.1根据蛋白质溶解度不同的分离方法1)蛋白质的盐析中性盐对蛋白

12、质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。2)等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电

13、点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。3)低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。1.2.3.2根据蛋白质分子大小的差别的分离方法1)透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。2)凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂

14、糖凝胶（agarose gel）。1.2.3.3根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。1)电泳法各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。2)离子交换层析法离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素，CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素，DEAE），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱

15、时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。1.2.3.4根据配体特异性的分离方法亲和色谱法 亲和层析法（af inity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一

16、套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。2实验试剂以及实验仪器：2.1实验材料工程菌种：Ecoli工程菌株Rossta LB培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，溶于950ml中，用NaOH调节pH至7.0，补加蒸馏水至总体积为1L，分装2后高压蒸汽灭菌。 缓冲液6： Buffer A 成分 含量 Tris 0.4 M EDTA 1 mM PMSF 25 M 2-mercaptoethanol 10 mMNaN3 5 M 加入浓盐酸调pH 8.0 Buffer B：成分 含量 Tris 10 mM EDTA 0.1 mM 2-

17、mercaptoethanol 10 mM 加入浓盐酸调pH 8.0 贮存Buffer成分 含量 Glycine 0.1 M（NH4）2 SO4 3.2 M2-mercaptoethanol 10 mM 加入NaOH 调至pH8.6工作Buffer：成分 含量 Glycine 0.1M2-mercaptoethanol 10mM 加入NaOH 调至pH8.6测活底物成分 含量57 mM Arg 2.0 ml 66 mM Mg(AC)2 2.0 ml 指示剂 2.0 ml ATP 0.0532g蒸馏水 14 ml加入NaOH调至pH8.2。2.2主要实验试剂与仪器 2.2.1实验试剂Sephac

18、rylTM-100、 CM-Cellulose、Q-sepharose、Glycine、L-Arg 、Mg(CH3COO)2 4H2O、购自Sigma公司，Tris 、Glycine、ATP、Bis - Acrylamide、2 - mercaptoethanol、IPTG 、PEG (Polymthylene Glycol) - 8000、购自Amresco公司, Acrylamide、SDS(Sodium dodecyl sulfate)购自Biomol公司,。其余所用试剂为国产分析纯试剂。2.2.2主要实验仪器 紫外分光光度计U4300（Sweden/GE） YC-1型层析实验冷柜（北京

19、博医康实验仪器司） CXG-1型电脑恒温层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司） ORION pH计（美国orion公司） HD-3紫外检测仪（上海沪西分析仪器厂有限公司） TGL-16LA，GL-2M型冷冻离心机(湖南星科仪器有限公司） GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司） 超声破壁仪（上海之信仪器厂有限公司） 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司） 超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司） 低温恒温槽DH-2120（上海嘉鹏科技有限公司） 电泳仪DYY-5（北京市六一仪器厂） 电子天平TE412-L，TE2101-L，CP64（德国Satorins公司） BS-1E振荡培养

20、箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂) SW-CJ-1FD单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司） 3FG-01B电热恒温鼓风干燥箱 高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）3实验方法3.1活化菌种取工程菌种10 l接入装有3 ml的LB液体培养基的试管（含有卡那青霉素，其工作浓度为50 g/ml）中。于37 摇床振荡培养8-12小时。3.2扩大培养 将试管中活化的1 ml菌液接种到300 ml LB培养基，同时加入300 l卡那青霉素（终浓度50 g/ml）培养基于37 恒温培养箱中培养2-3小时。3.3 IPTG诱导AK基因的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IP

21、TG诱导表达发现，当OD=0.6-0.8时，加150 l的 IPTG至终浓度为0.2 mM时AK的表达量达到最大。 3.4 蛋白质提取（1）将上述各管于4 ，5000 r/m离心10 min；（2）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g沉淀加5 ml裂解液；（3）在冰上进行10 min,间隔为2秒钟的超声波破壁,直到沉淀变得澄清为止； （4）于4，12000 rpm，离心10 min，取上清，得到AK的粗提液。3.5蛋白质的检测 测定AK的活性7： 新鲜配制测活底物，保存于4取5 l上清加入装有1mlAK底物塑料比色皿迅速混匀，通过紫外分光光度法测A575下降值 SDS-PAGE电泳8.9：（1）安

22、装双垂直板电泳槽； （2）配12%的分离胶15ml，浓缩胶5ml；（3) 制样：取样品10 1加样品缓冲液以401混合，100加热5 min ，15000g，4离心1 min；（4）上样：用微量注射器加样15-20 1）电泳：在凝胶上加80V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140V/cm继续电泳直到染料到达底部；（5）电泳：在凝胶上加80 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；（6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；（7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。3.6蛋白质的纯化（1）CMC

23、阳离子交换层析 平衡：3倍柱床体积Buffer A（pH=8.0）平衡上样：插A280滤光片，调A值、T值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。将粗提液60ml上柱，流速约为1.4ml/min 洗脱：Buffer A (pH=8.0)洗柱，同时在280nm处进行连续紫外检测，收集洗脱峰（2）S-100凝胶过滤层析平衡：3倍柱床体积Buffer B 透析平衡上样：待插A280滤光片，调A值、T值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。稳定后将过CMC的洗脱液120 mL浓缩到50 mL 上柱，流速约1 ml/min。 洗脱：Buffer B (pH=

24、8.0)洗柱，同时在280 nm处进行连续紫外检测，根据电脑监测波峰收集蛋白并留样测活、电泳。（3）Q-Sepharose阴离子交换层析平衡：3倍柱床体积Buffer B 透析平衡上样：待插A280滤光片，调A值、T值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。稳定后将经过S-100处理的蛋白上柱，流速约1 ml/min。洗脱：Buffer B (pH=8.0)洗柱将Buffer B溶液和1mol/L NaCl的Buffer B溶液各300mL于梯度混合仪的两容器中逐步混合由低浓度到高浓度进行洗脱蛋白。流速0.98mL/min同时在280nm处进行连续紫外检测，设定每根收集试

25、管收集流出蛋白时间，根据微电脑记录仪显示曲线，分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。4结果与分析4.1 AK诱导表达电泳图诱导后表达的蛋白经检测具有精氨酸激酶活性，并且由图可知，对应分子量43KD处有一条表达量相对较高的蛋白带，这与精氨酸激酶的分子量比较吻合，初步推断其为AK。 97.4 66.243 31 20.1 14.4 1 2 MW (KD)1-1 AK经过CMC离子交换层析图和诱导表达电泳图1、上清 2、标准蛋白质4.2 蛋白质经CMC离子交换的层析谱图和电泳图4.2.1如图1-1所示。由于CMC是阳离子交换树脂，而精氨酸（AK）在Buffer A（

26、pH=8.0）下带负电荷，所以不被吸附在其上；带正电荷的杂蛋白会被吸附，因此可以我们得到的是一个主要由带负电荷形成的单一的峰。图2-1. AK经CMC离子交换后的层析谱图4.2.2 将由CMC纯化后的蛋白溶液收集，经SDS-PAGE电泳检测得到如1-2图所示结果。由图可知，部分在pH=8.0条件下带负电荷的杂蛋白被分离除掉。. 1 2 3AK43KD31KD14.4KD20.1KD66.2KD97.4KD图2-2. SDS-PAGE图谱1、过CMC 2、上清 3、标准蛋白质4.3蛋白质经分子筛S-100交换的层析谱图和电泳图4.3.1将经CMC纯化后的蛋白溶液经浓缩，上样到分子筛S-100进一

27、步分离纯化，得到几个洗脱峰，如图3-1。分步收集每个峰的蛋白溶液进行活性检测，发现第一个峰含精氨酸激酶。通过上面的电泳图可以发现在AK附近存在比其分子量大的杂蛋白，由于分子筛本身的分离效率，分离时的流速等因素的影响，导致在主峰之中出现了杂蛋白峰。图3-1 S-100凝胶层析谱图层AK峰 4.3.2另外通过SDS-PAGE电泳，如图3-2，确定较高纯度的精氨酸激酶来并管，用于进一步纯化操作。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3-2 纯度较高各管SDS-PAGE图谱17以及9道是经S-洗脱收集的有纯度较高的管；8、标准蛋白4.4蛋白质经Qsepharose阳离子交换的层析谱图和电泳图4.4.1

28、 将合并后的含AK蛋白溶液经Qsepharose 纯化后得到如图 ，由于不同的蛋白在pH=8.0的BufferB缓冲液中所带电荷不同，与树脂的结合能力有差别，所以用盐进行洗脱时梯度时，会出现连续几个峰，所示结果。活性检测显示第一个洗脱主峰含AK。由峰形可知纯化效果较好，由于有杂蛋白具有与AK相近的电荷特性，从而导致一个与AK主峰部分重叠的杂峰出现。如图4-1. AK经Q-sepharose离子交换后的层析谱图4.4.2 将主峰处的蛋白分布收集的各管测活后，分别通过SDS-PAGE电泳检测得到图 4-2。 由图可知，AK达到了度，经检测其具有很高的活性。97.466.242.73120.114.

29、4图4-2 过Q-Sepharose的SDS-PAGE图谱17以及9道是经Q-Sepharose洗脱收集的；8、标准蛋白质4.5 AK经各步纯化后的SDS-PAGE电泳图谱如图 5-1 为细胞破碎离心得到的上清溶液以及通过各步纯化后所得溶液的SDS-PAGE电泳图。由该图可知，我们经过的纯化策略达到了比较理想的效果。1 2 3 4 5 6 如图5-1，AK经各步纯化后的SDS-PAGE图谱1、标准蛋白 2、上清 3、盐析 4、经过CMC处理的蛋白质 5、经过S-100处理的蛋白质 6、 Q-Sepharose5讨论（1）由于精氨酸激酶基因的菌种是保存甘油中，我们在进行接种扩大培养到含卡纳霉素的

30、LB培养基锥形瓶中，首先要把原菌液接种到含LB培养基的小试管中进行活化812小时。由于不同的菌种的生长情况有差异，在加IPTG值的要求不同。根据参考文献得出，诱导AK基因表达最适宜的OD600值为0.60.8 ，另外，我们通过实验得出，IPTG诱导时间为3小时。IPTG终浓度，为0.2 mM（2）由于诱导AK表达的IPTG的浓度较低，小于1 mM的情况下，不易产生包涵体，因此，我们在后面的破壁、离心、分别取上清和沉淀，分别用测活和电泳检测，发现沉淀中几乎没有AK。 （3）根据参考文献得出，精氨酸激酶活性可以通过测定在575nm处精氨酸激酶1min内的下降值。所用底物主要包括Arginine，M

31、g(AC)2。观察精氨酸激酶的热力失活曲线知道精氨酸激酶在30 活性最高，另外pH值的变化对精氨酸激酶的活性影响很大，当pH等于8.2时活性最强。测活时底物的要放在25下保温一段时间，最适pH值为8.2。（4）将粗提的蛋白首先通过CMC阳离子交换层析，将带正电荷的杂蛋白挂于柱子，精氨酸激酶和其它蛋白洗脱出来，由于CMC阳离子交换层析有稀释作用，以及分子筛对上样体积的要求（柱床体积的515%），所以需要浓缩洗脱液，然后通过S-100凝胶过滤层析，再经过Q-Sepharose阴离子交换层析进行进一步纯化，精氨酸激酶能结合于柱子，但是却能挂上大量的杂蛋白，然后用1 mol/L的NaCl进行梯度洗脱分

32、部收集得到较纯的精氨酸激酶，由公式计算得NaCl浓度为 0.23M时，AK蛋白开始洗脱下来。在这个过程中都要进行测活以及电泳图谱来确定精氨酸激酶的活性和纯度。（5）由电泳图谱可看出经过于S-100凝胶过滤层析分离纯化的效果不是很明显，主要原因是精氨酸激酶（40 KD）附近有许多杂蛋白的电泳带，而SephacrylTM10 的分离范围是103105。这个范围较大，难于把杂蛋白分开。 （6）要有好的分离效果要注意层析柱的高度和体积；上样量的大小；洗脱梯度的形状和洗脱体积；洗脱速度；分级物的收集量。参考文献：1 France R M, Sellers D S and Grossman S H. Pu

33、rification characterization and hydrodynamic properties of arginine kinase from gulf shimp (Penaeus aztecus). Arch Biochem Biophys, 1997, 345(1): 73-782 Zhou G, somasundaram T,blanc E,et al.Transition state structure of arginine kinase:implications for catalysis of bimolecular reaction .Proo Natl Ac

34、ad sci USA,1998,95(15):357-3593 Tsou C L. Configurational flexibility of enzyme active sites. Science, 1993, 262(5132): 380-3814潘继承 精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究 博士学位论文 北京：清华大学 F2004(4):1-2 5 美J.萨姆不鲁克 D.W.拉萨尔 分子克隆 科学出版社 上册 15章（12171259）。6France,Richard Morris ,Ph.D Purification and phicical characterization of

35、arginine kinase from Penaeus aztecus: Evidence for a molten globule folding intermediate. Univercity of South Florida,1994(1)7Yu Z,Pan J and Zhou H.M A direct continuous pHspectrophotometric assay for arginine kinase activity. Protein and peptide letters,2002.9 (6) 545-552, 8 陆健 等 蛋白质纯化技术及应用 化学工业出版社 第一版 2005：22-24.9汪家政，范明 .蛋白质技术手册.科学出版社.2005：77110