illumina SNP 分析技术方案书.doc

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1、 编号: JN-20110912 illumina SNP 分析技术方案书晶能生物技术（上海）有限公司二0一一年九月十二日公司背景Illumina公司是一家从事开发，制造及销售用于分析遗传变异和生物功能的综合系统的高科技公司，于1998年成立，2005年进入中国，2007和2009年两次入选福布斯杂志评出的全美年度成长速度最快的高科技公司，同时亚太地区是Illumina全球增长最快的区域。公司在福布斯所公布的2009年度成长最快的高科技公司中超越Google，位列榜首。Illumina的业务范围包括生物芯片技术，和新一代高通量测序技术两大领域，具体则包括测序分析、基因表达分析、基因调控及表观遗

2、传学分析、蛋白筛选分析、基因分型及CNV（拷贝数变异）分析。当然最为用户所知的是30倍磁珠覆盖产生的业内最高重复度及准确率，另外基因分型分析作为一种新兴遗传学技术，也正成为Illumina的一种核心技术。这项技术能够从核酸水平分析导致个体疾病的遗传变异，为多基因复杂疾病易感性，复杂疾病的发生机制和疾病防治与药物开发等领域的研究提供帮助。在Illumina领先技术引导下，以大规模SNP基因分型数据为基础的全基因组关联分析技术将为未来的个体化疾病诊断奠定基础。Illumina并购新一代高通量测序技术公司Solexa后，测序成为Illumina另一项核心技术，华大基因（BGI）近日花巨资购买的128

3、台最新的测序系统-Hiseq 2000系统是Illumina公司新发布的最高通量测序系统。利用两个流动槽和一种新颖的双表面成像方法，HiSeq 2000能够在单次运行中产生600 Gb的数据，每天能产生75 Gb。该平台已经将人类基因组的测序费用降至1万美元以下。要知道早在几年前人类基因组计划全球数个国家花费了数亿美元才完成这项工作。晶能（Genergy）生物技术有限公司是illumina自中国区总部移到上海后，联合各方资源成立的专业服务平台公司，公司成立以来完成了数百项服务项目，在华东地区竞争激烈的科研外包服务市场取得不错比例的市场份额，也赢得了客户的认可，公司服务实验室装备华东地区第一台H

4、iseq2000测序仪，已经完美运作完成数十项二代深度测序项目。芯片平台如iscan平台至今已完成3项GWAS项目，总计5000个样本；各类基因芯片总计3500张。Sequenom质谱检测系统完成近20万个SNP位点分型。荧光定量服务近百项。晶能旨在能为广大科研开发工作者提供专业可靠的分子生物学科研外包服务。 SNP检测技术背景人类基因组计划的完成,标志着人们进入了新的时代-后基因组学时代，人们从基因的序列研究跨越到功能的研究。人类基因组计划完成后，科学家发现任意两个不相关的人的DNA序列有99.9%是一致的，只有0.1%的差异。而这部分0.1%由于包含了遗传上的差异因素而非常重要。这些差异造

5、成人们罹患疾病的不同风险和对药物的不同反应。单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNP）成为研究及标记人与人之间微小差异的最佳遗传标记。 SNP是在基因组中，不同个体的DNA序列上的单个碱基的差异。如，某些人的染色体上某个位置的碱基是A，而另一些人的染色体的相同位置上的碱基则是G。除性染色体外，每个人体内的染色体都有两份。一个人所拥有的一对等位位点的类型被称作基因型（genotype）。检定一个人的基因型，被称作基因分型（genotyping）。人类的基因不到三万个，存在超过1千万个SNP，其中3百万个SNP决定了人类的异质性。SNP的筛选及检测来

6、发现于疾病相关的SNP位点，是了解引起人类疾病的复杂原因的最重要途径之一。同时这些SNP位点也标记着不同个体罹患各种疾病的风险，以及对药物的不同反应。SNP是继RFLP和STR后的第三代分子遗传标记，以其为标签，可寻找和发现疾病（如肿瘤，高血压，心脏病，各种精神性疾病等等）相关的基因。常用的方法是将一定数量的病人检体与正常人检体作相关基因的SNP 分析，观察特定SNP 在两组人群中出现频率的差别。随着基因分型技术的飞速发展，越来越多与疾病有关的基因以及药物效应的个体差异与基因多型性的关系被阐明，SNP 成为未来医学中个体化的疾病防治提供基础，即朝向针对不同患者的基因型态施以个人化医疗的方向发展

7、。用于SNP分型的技术有高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析技术 ，基于一代Sanger测序技术的分型方法，基于质谱技术的Sequenom MassARRAY 分子量阵列技术，及基于Illumina GoldenGate专利的定制芯片分型技术。目前前两者技术因为分型成本过高逐渐为后面三种技术所取代，而当单一样本需要同时分型的位点数超过100个时，Illumina GoldenGate技术的成本是最低的且国际上公认度最高。人类全基因组计划完成后，全球多个国家合作（美国，英国，日本，中国等）启动了一项后续计划，人类单体型计划(HapMap计划)，这个计划的

8、目的就是研究SNP位点和疾病的关系，旨在建立一个人类健康、疾病以及对药物和环境因子的个体反应差异相关的基因公用数据库。这一全球性计划有70%的数据就是在GoldenGate这个专利技术平台上产生的，其中中国科学家承担了共10%的工作，这中间95%工作都是在GoldenGate技术平台上完成的（见Nature2005年10月封面文章）。下附几种SNP分型技术比较表:SNP分型技术比较表技术名称原理简述单次反应通量平台仪器单样本单位点 分析成本HRM SNP分析技术通过不同基因型不同PCR反应时候退火温度不同，从溶解曲线的差异识别基因型每个样本1个位点一次反应荧光定量PCR仪器50万20-30元一

9、代Sanger测序技术通过对SNP位点前后一段序列测序知道基因型每个样本1个位点一次反应测序仪150万20元Sequenom MassARRAYSNP分析技术 由于SNP位点不同碱基的分子量差别，质谱方法识别通过磁场到达接收装置时间不同来识别基因型每个样本最多30个位点一次反应Sequenom 质谱仪300万8-10元Illumina GoldenGateSNP分析技术针对特定SNP位点设计2-3组探针，其中只有一组探针可以完成扩增，带入的碱基因为事先标记的特定波长荧光信号而被识别每个样本最多1536个位点一次反应Illumina微珠芯片工作站150万5元当样本量及同时分析样本数多时更低要求同

10、时分析样本数480以上 附1：Goldengate的基本原理如下:1 .准备gDNA 250ng2 .将gDNA和固相磁性小珠相连3.加入根据SNP位点特殊分析设计的探针组OPA，如SNP是T/C位点，则合成的等位基因特异性探针末端为A/G；通过等位基因特异性延伸和连接酶连接得到一段包含该SNP位点的片断。同时该片断带有一段特殊设计的地址序列。4.该片断进行PCR扩增，并在反应过程中加入Cy3,Cy5荧光5.杂交：和芯片进行杂交，芯片的微珠上连接有地址序列（Address）的互补序列，通过地址序列完成杂交，杂交效率几乎完全一致。SNP位点通过两种荧光颜色读取区分GoldenGate检测技术和V

11、eraCode平台相结合，可以灵活地根据实验者需要在一个样品中检测48，96，144，192或384个SNP位点，这些位点的设计挑选灵活，完全根据需要而定。在检测中，根据SNP位点设计组不同的探针，每一组分别代表一个SNP的等位基因GoldenGate 检测的特点1.高度灵活：内容高度灵活：完全根据研究需要确定SNP位点制成芯片，每个样品可同时进行384, 768, 1536 plex SNP位点的研究。芯片形式灵活：客户可根据样本量以及SNP位点数量来确定使用何种格式的芯片Illumina公司的芯片有三种格式，universal-12，universal-16，universal-32，每张

12、芯片进行12，16，32个样本的检测，可针对384,768,1536个SNP位点进行探针的设计。universal-32 beadchip2.实验成功率高：GoldenGate 检测芯片采用了特殊的设计，芯片的微珠上仅带有地址序列而没有基因组的对应序列，不同SNP位点的检测差异在OPA探针组的设计上实现，这一专利的设计使芯片杂交在地址序列和其互补序列进行间接杂交完成，和基因组序列无关。所有的地址序列都经过特殊设计，具有近似的杂交温度，退火温度以及CG含量稳定等特点，杂交效率很高。所以，使用微珠芯片进行基因分型实验的成功率也就很高，成功率一般99%。3.实验重复性高：基于微珠芯片以及Golden

13、Gate 检测独特的设计：每个SNP位点有30倍的重复，杂交在地址序列间发生等特点，检测重复性99.7%。4.密度高,信息量大：面积直径为15.75mm1.8mm的微珠芯片包含有900,000个微珠，其密度高达400万/cm2是目前密度最高的芯片，是传统芯片密度的4-400倍，而其研究通量为传统基因分型手段的8至48倍。5.低样品量：250ngDNA可检测1536个SNP位点的基因型信息。6.实验过程全程监控内参微珠：芯片中设计了几百个内参微珠对实验过程进行监控，如：样品污染，延伸特异性等。GenomeStudio基因分型分析软件自动报告实验监控结果。7.完全均一：微珠芯片采用了微珠和光纤的设

14、计，芯片点（微珠）大小完全均一：3微米，点和点之间间距完全均一：5.7微米。解决了传统芯片点大小，定位难以高度均一的瓶颈问题。8.芯片生产100%QC质控：微珠芯片生产过程中专利的解码技术，质控能深入到每张芯片上每个微珠每个特性，保证数据的可靠性和重复性。9. 高性价比：单个位点的分析成本是其他技术的1/4甚至1/10.附2：illumina SNP分析技术部分文献：Sigurdsson S, Nordmark G, Garnier S, Grundberg E, Kwan T, et al. (2008) A risk haplotype of STAT4 for systemic lupu

15、s erythematosus is over-expressed, correlates with anti-dsDNA and shows additive effects with two risk alleles of IRF5. Hum Mol Genet17:2868-76. Karlsson EK, Lindblad-Toh K (2008) Leader of the pack: gene mapping in dogs and other model organisms. Nat Rev Genet9:713-25. Moss?YP, Laudenslager M, Long

16、o L, Cole KA, Wood A, et al. (2008) Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature455:930-5. Cooper GM, Johnson JA, Langaee TY, Feng H, Stanaway IB, et al. (2008) A genome-wide scan for common genetic variants with a large influence on warfarin maintenance dose.

17、Blood112:1022-7. Levran O, Londono D, OHara K, Nielsen DA, Peles E, et al. (2008) Genetic susceptibility to heroin addiction; a candidate-gene association study. Genes Brain BehavEpub ahead of print. , Sakamoto H, Yoshimura K, Saeki N, Katai H, et al. (2008) Genetic variation in PSCA is associated w

18、ith susceptibility to diffuse-type gastric cancer. Nat Genet40:730-40. Chambers JC, Elliott P, Zabaneh D, Zhang W, Li Y, et al. (2008) Common genetic variation near MC4R is associated with waist circumference and insulin resistance. Nat Genet40:716-8. Loos RJ, Lindgren CM, Li S, Wheeler E, Zhao JH,

19、et al. (2008) Common variants near MC4R are associated with fat mass, weight and risk of obesity. Nat Genet40:768-75. Plenge RM, Seielstad M, Padyukov L, Lee AT, Remmers EF, et al. (2007) TRAF1-C5 as a risk locus for rheumatoid arthritis-a genomewide study. N Engl J Med357:1199-209. Thorleifsson G,

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21、for host control of HIV-1. Science317:944-7. Stefansson H, Rye DB, Hicks A, Petursson H, Ingason A, et al. (2007) A genetic risk factor for periodic limb movements in sleep. N Engl J Med357:639-47. Hakonarson H, Grant SF, Bradfield JP, Marchand L, Kim CE, et al. (2007) A genome-wide association stud

22、y identifies KIAA0350 as a type 1 diabetes gene. Nature448:591-4. Moffatt MF, Kabesch M, Liang L, Dixon AL, Strachan D, et al. (2007) Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma. Nature448:470-3. Gudbjartsson DF, Arnar DO, Helgadottir A, Gretarsdottir S,

23、Holm H, et al. (2007) Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature448:353-7. van Es MA, Van Vught PW, Blauw HM, Franke L, Saris CG, et al. (2007) ITPR2 as a susceptibility gene in sporadic amyotrophic lateral sclerosis: a genome-wide association study. Lancet Neurol6:86

24、9-77. Tomlinson I, Webb E, Carvajal-Carmona L, Broderick P, Kemp Z, et al. (2007) A genome-wide association scan of tag SNPs identifies a susceptibility variant for colorectal cancer at 8q24.21. Nat Genet39:984-8. Duerr RH, Taylor KD, Brant SR, Rioux JD, Silverberg MS, et al. (2006) A genome-wide as

25、sociation study identifies IL23R as an inflammatory bowel disease gene. Science314:1461-3. Fung HC, Scholz S, Matarin M, Sim髇-S醤chez J, Hernandez D, et al. (2006) Genome-wide genotyping in Parkinsons disease and neurologically normal controls: first stage analysis and public release of data. Lancet Neurol5:911-6.