食品微生物检测.doc
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1、食品有害微生物与检测导 言 随着科学技术日新月异的发展和人们生活水平的不断提高,食品安全、卫生已成为人们关注的焦点。 WHO及各国食品卫生、安全管理部门一直对食品微生物污染问题给予极大的重视和关注。 食品微生物检验是食品质量安全控制方面的重要技术之一,对控制微生物引起的食源性疾病具有重要作用,已成为食品安全中的重要研究领域。 近年来,食品微生物检测技术得到了很大的发展,正从传统的培养和生理生化的方法向快速的免疫学检测方法、分子生物学检测方法、快速的基于培养及生理生化特征的检测方法、自动化仪器检测方法、生物传感器检测方法方面发展。 食品微生物检验技术现已被食品质量与安全、食品科学与工程等相关专业
2、列为主干课程 第一节 病原微生物与食品安全一、病原微生物污染现状 上世纪末和本世纪初接二连三发生的重大食源性疾病令全球震惊 如,日本大肠埃希菌O157:H7引起的出血性肠炎、英国的疯牛病和美、法、日等国的李斯特菌食物中毒等,对消费者健康和安全带来严重威胁,引起了人们对食源性病原体的高度关注。p 国际上发生的食品安全重大事件 1989年新疆,戊肝 1996年欧洲,牛肉,疯牛病 1996年日本,蔬菜,O157 1997年香港,禽流感 1999年比利时,畜禽类,二噁英 2000年法国,熟制肉类,李斯特菌 2000年日本,乳品,金黄色葡萄球菌 2000年英国、法国, 口蹄疫 2004年南亚、东南亚、中
3、国,禽流感 p 疯牛病p 毒黄瓜 2011年5月中旬,食用毒黄瓜引起的疫病在德国开始出现。2011年5月30日,德国因食用有毒黄瓜,感染出血性大肠杆菌而死亡的人数已升至14人,目前疫情仍在蔓延恒天然毒奶粉系乌龙 新西兰奶粉产业受影响p 食源性疾病(food borne disease) 是指通过摄食而进入人体的有毒有害物质(包括生物性病原体)等致病因子所造成的疾病。 一般可分为感染性和中毒性,包括常见的食物中毒、肠道传染病、人畜共患传染病、寄生虫病以及化学性有毒有害物质所引起的疾病。 食源性疾患的发病率居各类疾病总发病率的前列,是世界上最突出的卫生问题。 食源性疾病(foodbornedise
4、ase),是一种涵盖范围非常广泛的疾病,在全世界范围内都是一个日益严重的公共卫生问题。 从粮食生产到消费(“从农场到餐桌”),任何一个阶段都可能发生食品污染,也有可能是环境污染的结果,包括水、土壤或空气污染。微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的主要因素 美国,每年约有7200万人发生食源性疾病,造成3500 亿美元的损失 80年代,上海,毛蚶,甲型肝炎爆发,累及30万人 1999年,宁夏,沙门氏菌污染肉品,食物中毒暴发, 发病人数上千人 2001年,江苏、安徽等地,肠出血性大肠杆菌O157:H7,造成177人死亡,中毒人数超过2万人u 监测数据显示,2011年,中国每6.5人中就有一人曾经发
5、生过食源性疾病 。食品安全的头号杀手食源性疾病 漏报率高达99%,食源性疾病的危害已经远超违法滥用添加剂、农药残留等食品化学性污染二、现代食品微生物检测技术在食品安全中的重要作用 食品安全是一个遍及全球的公共卫生问题。 与其他任何一类疾病相比,由病原微生物引起的食源性疾病是危害最大的一类。p 食品微生物检验的意义u 衡量食品安全质量的重要指标,也是判断被检食品能否食用的科学依据;u 判断食品加工环境及食品卫生情况,对食品被细菌污染的程度作出正确的评价,为各类卫生管理工作提供科学的依据,提供传染病和人类、动物的食物中毒的防治措施;u 是预防为主的措施,有效地防止或者减少食物中毒和人畜共患病的发生
6、;u 提高产品质量,避免经济损失。 传统的食品微生物检测技术主要靠微生物培养和生理生化实验,耗时长、效率低、敏感性差,不能及时检出食品中的有害微生物。 快速、准确、高效的现代食品微生物检测技术应运而生!第二节 现代食品微生物检测的研究内容一、免疫学快速检测技术 1. 荧光抗体检测技术(FAT) 2. 免疫酶技术 二、分子生物学快速检测技术 1. 核酸探针技术 2. 多聚酶链式反应技术(PCR) 3. 生物芯片技术三、基于培养基生理生化特征的检测技术 1. 电阻抗法 2. 微量生化法 3. 快速酶触反应及代谢产物的检测四、自动化检测 1. ATB Expression细菌鉴定及药敏智能系统 2.
7、 Bactometer系统 3. 微生物总数快速测定仪五、生物传感器检测技术第三节 现代食品微生物检测技术的发展趋势及应用一、现代食品微生物检测技术的发展趋势 1. 更加注重快速、准确、实用 2. 与生物技术成果相结合 3. 大力发展在线无损的检测技术 二、现代食品微生物检测技术的应用 1. 免疫学方法 2. 核酸探针法 3. PCR技术 4. 基因芯片技术 5. 生物传感器 第一章 免疫学检测技术的基本原理免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应。免疫学技术的发展 免疫学检验(1aboratoryimmunology)是研究免疫学技术及其在医学检验领域应用的一门学科,是医学检验专业的重要学科之一。
8、第一节 抗原(antigen, Ag)一、抗原的概念p 凡能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答,并能与相应免疫应答产物(抗体或致敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合的物质,统称为抗原(antigen, Ag)p 多系异体的大分子蛋白质。二、抗原的基本特性1. 免疫原性(immunogenecity) 是指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答(产生特异性抗体及免疫效应细胞)的性质。2. 抗原性 (antigenicity) 又称免疫反应性,是指抗原分子与免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)发生特异性结合的性质。第二节 抗体(antibody,Ab)(一) 抗体的概念 又称免疫球蛋白(immunoglob
9、ulin,Ig)是由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类糖蛋白,主要存在于血清等体液中,能与相应抗原特异性地结合,具有免疫功能,是介导体液免疫的重要免疫分子 分泌型(secreted Ig, SIg) 免疫球蛋白 膜型(membraneIg, mIg) 前者存在血液和组织中,具有抗体各种免疫功能,由浆细胞产生。 后者是B细胞表面的抗原受体,是由成熟B细胞产生免疫球蛋白。(二)抗体的基本结构 p 四条肽链的对称结构。p 两条重链(H)和两条轻链(L)p 每条重链和轻链分为氨基端和羧基端。第二节 体外免疫反应的特点及影响因素一、抗原抗体反应的特点1. 高度特异性 (specificity)
10、 一种抗原分子通常只能与其刺激机体后产生的抗体结合,这种反应的专一性; 抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性所决定的; 可用已知的抗原(或抗体)来检测相应未知的抗体(或抗原)。2. 可逆性(reversibility) 由于抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合,形成的复合物是不牢固的; 在一定的条件下可以解离,抗原抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一动态平衡过程。3.比例性(proportionality) 抗原与抗体发生可见反应需要遵循一定的量比关系 决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见反应 沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系4.阶段性(2阶段) 第1阶段:特异性结合阶段。反应快,
11、可在数秒钟至数分钟内完成,一般不能为肉眼所见; 第2阶段:可见阶段,根据参加反应的抗原的物理性状不同,可出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象。反应可见阶段所需时间较长,数分钟、数小时到数日不等。二、抗原抗体反应的影响因素(一)反应物自身因素 抗原和抗体是反应主体,它们的性质、活性及浓度(效价)等直接影响二者的结合反应。 抗原的理化性状、抗原表位种类和数目均可影响抗原抗体反应的结果 不同动物来源的抗体反应性有差异。(二)环境因素适宜的环境条件,如电解质、酸碱度、温度等能促进抗原抗体分子的紧密接触,增强分子间引力,促进分子聚合。1、电解质 抗原抗体等电点分别为pI3-5和pI5-6,在中性或弱碱性条件下
12、表面带有较多负电荷; 适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而相互结合。2、温度 通常为37,适当提高反应温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会; 56以上可使抗原或抗体变性失活。3、酸碱度 最适pH值在6-8之间,pH值过高或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质; 当pH值接近等电点时,抗原抗体多带正负电荷相等,由于自身吸引而出现凝集,导致非特异性反应。第三节 检测抗原和抗体的体外实验一、抗原抗体结合力二、抗原抗体的亲和力与亲合力亲和力(affinity):指抗体分子上一个抗原结合点与相应的抗原决定簇之间相适应而结合的强度,它是抗原抗体间固有的结合力。亲合力(avidity):指一个抗体分子与整
13、个抗原表位之间结合的强度,与抗体结合价直接相关。三、免疫学检测技术的类型(一)早期建立的免疫学检测技术p 直接用抗原抗体反应产生的现象判断实验结果p 包括:凝集现象、沉淀现象p 补体系统参与的溶血现象等1.凝集反应p 细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下结合,出现肉眼可见的凝集团现象。直接凝集反应间接凝集反应 将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上,形成致敏颗粒,然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集,叫间接凝集反应。 如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。 凝集反应常用于溶血性疾病的诊断:2
14、.沉淀反应可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物。免疫比浊法单向免疫扩散双向免疫扩散免疫电泳(二)现代免疫标记技术 (immunolabelling technique)p 用高度敏感的示踪物质(如荧光物质、放射性核素、酶或化学发光物质等)标记抗原或抗体,进行抗原抗体反应后,通过检测标记物对抗原或抗体进行定性、定位或定量分析。p 特点:灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点,拓宽了免疫学检测技术的应用范围,是目前应用最广泛的免疫学检测技术免疫标记技术常用方法p 按检测现象不同: 放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光免疫技术 金免疫技术等p 按实际用途: 定位测定组织或细胞中固定成分
15、的免疫组织化学技术 检测液体标本中抗原或抗体含量的免疫测定。p 按测定反应体系的物理状态: 均相免疫测定 非均相免疫测定; 单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验第二章 放射免疫分析测定技术检测食品微生物 1986年切尔诺贝利核灾难Yalow和Berson利用放射性核素标记胰岛素,建立了放射免疫分析技术。 雅洛1921年出生于纽约,1945年获得核物理学博士学位,1975年当选美国科学院院士。 因发明了放射性免疫分析法,雅洛获得1976年的拉斯克基础医学奖,成为历史上第一位获得该奖的女性科学家。 1976年,因与同事合作开发了“针对多肽类激素的放射性免疫分析法”而成为诺贝尔生理学或医学奖史上第二位
16、女性获奖者。 第一节 放射免疫技术放射免疫技术 放射免疫技术(radioimmunoassay, RIA)是以放射性核素为示踪物的标记免疫分析技术 常用于定量测定受检样本中的微量物质,在内分泌学、免疫学、药物学、微生物学、生物化学等多个领域得到广泛应用 广义来说,凡是应用放射性同位素标记的抗原或抗体,通过免疫反应测定的技术,都可称为放射免疫技术一、放射免疫技术-分类放射免疫RIAp 以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。 免疫放射IRMAp 以过量标记抗体与抗原非竞争结合,采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。其它 放射受体分析RRA 放射配体结合分析
17、RBA二、放射免疫技术 常用标记核素三、放射免疫技术标记物制备及鉴定 125碘-标记物的制备标记直接标记法 是将125I直接结合在蛋白质侧链的酪氨酸残疾苯环上,形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸。 操作简便,结合效率高,但只能标记含酪氨酸的化合物,有时可能会损害蛋白质的活性【基本原理】p 反应原理不清楚,仅仅是建立在实验基础上,有的学者认为当氯胺T溶于水后释放出次氯酸,将*I-离子氧化成*I2、*I+,在pH为7.0-8.0条件下与蛋白质酪氨酸残基上邻位氢原子发生置换反应,形成放射性碘标记化合物,用偏重亚硫酸钠终止氧化反应,经过分离纯化,获得纯的标记化合物。间接标记法p 联接标记法 先将放射性碘连接到
18、一个小分子载体上,再将这个小分子载体与蛋白质结合。p 具有代表性的方法: bolton-Hunter 法,使用的载体分子是N-琥珀酰亚胺3-(4-羟基苯)-丙酸(SHPP)。p 分两步进行,第一步是用Ch-T法使SHPP碘化,第二步再将碘化SHPP分子偶联到蛋白质分子上,从而使待标记物被碘化。 125碘-标记物的制备纯化 凝胶过滤法 离子交换层析法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 高效液相色谱法 125碘-标记物的制备鉴定标记物质量 高放射化学纯度 高比放射性 完整免疫活性 (1)放射化学纯度p 指结合于抗原上的放射强度占总放射强度的百分率,即碘化蛋白峰的放射强度占总放射强度的百分率。p 影响因素: 被标
19、记物不纯,杂质也被放射性核素标记 标记后的分离纯化不完全 标记化合物贮存过程中的碘脱离单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率应大于95% (2)比放射性 或称放射性比活度,是单位化学量标记物中所含的放射性强度,单位为Bq/g。 标记抗原的比放射性越高,所需标记抗原量越少,实验系统的敏感度越高 但过高的比放射性可能会损坏抗原的免疫活性。如碘标记化合物以单碘标记为宜。 (3)免疫活性 是指标记抗原结合于抗体的放射强度占总放射强度的百分率。以检查标记后免疫活性损失情况 方法:加10倍量抗体和标记抗原反应,测定结合部分(B)和游离部分(F)的放射强度,算出B/(B+F)的百分率,正常应
20、为80以上,该值越大,说明抗原损失越小。 如果值过小,标记抗原应重新强化或废弃重做。四、放射免疫技术抗体选用 抗体是放射免疫技术试剂盒主要组成试剂之一,常采用含特异性抗体的抗血清和小鼠杂交瘤单克隆抗体。 抗体的质量直接影响分析的灵敏度和特异性 抗体的质量指标主要有亲和常数、特异性和效价。第二节 放射免疫分析放射免疫分析(RIA) 是以放射性核素标记抗原和待测抗原竞争结合一定量的特异性抗体,来测定待测抗原含量的一种竞争免疫学方法。即经典的RIA法。 是目前应用最广泛的放射免疫技术。一、放射免疫分析-基本原理标记抗原(Ag*)和非标记抗原(Ag)对特异性抗体(Ab)的竞争结合反应。 标记抗原和抗体
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