工业微生物菌种的选育、保藏与培养.doc

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1、工业微生物菌种的选育、保藏与培养自然环境中的微生物是混杂生长的，要想得到生产某一目的产物的野生菌株，就需要采取一定的方法将它们分离出来。菌株分离（separation）就是将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离和筛选是获得目的菌种的两个重要环节。菌株的分离要根据生产实际需要、目的代谢产物的性质、可能产生所需目的产物的微生物种类、微生物的分布、理化特性及生活环境等，设计选择性高的分离方法，才能快速地从环境或混杂了多种微生物样品中获得所需菌种。筛选方法也很重要，在设计筛选方案时有两点必须注意，即所采用方法的

2、选择性和灵敏度。微生物细胞 筛选 设计实验方案 初筛（1株1瓶） 确定采集样品的生态环境 采样 复筛（1株35瓶） 确定特定的增殖条件 结合初步工艺条件摸索 增殖培养 再复筛（1株35瓶） 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法 35株平板分离 单株纯种分离原种斜面 生产性能试验及毒性试验 确定发酵培养基础条件 菌种鉴定一、菌种的分离筛选一）样品采集与预处理总的原则是：样品的来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。特别是在一些极端的环境中，如高温、高压、高盐等极端环境中，可找到能适应苛刻环境压力的微生物类群。1、从土壤中采样土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的

3、地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（10）>放线菌（10）>霉菌（10）>酵母菌（10）>藻类（10）>原生动物（10），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 6543871）根据土壤特点a土壤有机质含量和通气状况一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量

4、丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。从土层的纵剖面看，15cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比525cm土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样最好的土层是525cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来

5、酵母菌分布土层最浅，约510cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。b.土壤酸碱度和植被状况土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤（pH7.07.5）环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。由于植物根部的分泌物有所不同，因此，植被对微生物分布也有一定的影响。如番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌。葡萄或其他果树在果实成熟时，其根部附近土壤中酵母菌数量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌数量比其他植被下占优势。c地理条件南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多，特别是热带和亚热带地区的土壤。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是

6、霉菌、酵母菌，大多从南方土壤中筛选出来。原因是南方温度高，温暖季节长，雨水多，相对湿度高，植物种类多，植被覆盖面大，土壤有机质丰富，造成得天独厚的微生物生长环境。d季节条件不同季节微生物数量有明显的变化，冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少。到了春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加。但就南方来说，春季往往雨水多，土壤含水量高，通气不良，即使有微生物所需的温度、湿度，也不利于其生长繁殖。随后经过夏季到秋季，约有710个月处在较高的温度和丰富的植被下，土壤中微生物数量比任何时候都多，因此，秋季采土样最为理想。2）采样方法用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取525cm处的土

7、样1025g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在1030cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取34撒到试管斜面上，这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。采集含目标微生物样品的另一个原则是：要了解目标产物的性质和可能产目标产物的微生物种类及其生理特征，这样就能提高效率，事半功倍。2根据微生物生理特点采样1)根据微生物营养类型每种微生物对碳氮源的需求不一样,分布也有差异。研究表明

8、，微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。如森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长；在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在，因而，在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌；在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所，容易分离到产生蛋白酶、糖化酶的菌株。若要筛选以糖质为原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样。在筛选果胶酶产生菌时，由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有较多的果胶，因此，从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使

9、用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的结果。在油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株。Hartman等人曾从乙烯氯化物的工厂附近分离到一株以乙烯氯化物为碳源和能源的分枝杆菌。含1%乙烯氯化物的空气通过该菌培养可除去93%的毒性。也有人从含油污泥中筛选出能以20#机械润滑油为惟一碳源的株石油降解菌菌株，分别为动胶菌属（Zoogloea sp.）、氮单胞菌属（Azomonas sp.）和假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。当然，也可将一种需要降解的物质作为样品中微生物的惟一碳源或氮源进行富集，然后分离筛选。此外，不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如

10、以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉或其他糖类物质获得能源而生长。以石油等碳氢化合物为碳源的油田微生物，也可以利用一些糖类为碳源。具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他样品中也会存在。不过数量较少。)根据微生物的生理特性在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。如筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、深海中采样；分离耐压菌则通常到海洋底部采样。因为深海中生活的微生物能耐很高的静水压，如从海中筛到一株水活微球菌（Micrococcus aqui

11、vivus）,它能在600个大气压下生长。分离耐高渗透压酵母菌时，由于其偏爱糖分高、酸性的环境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌。3、特殊环境下采样1)局部环境条件的影响值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和环境条件综合因素的影响之外，还要受局部环境条件的影响。如北方气候寒冷，年平均温度低，高温微生物相对较少。但在该地区的温泉或堆肥中，却会出现为数众多的高温微生物。氧气充足的土层中按理只适合于好氧菌生长，实际上也有一些嫌气菌生活，原因是好气菌生长繁殖消耗了土层中大量氧气，为嫌气菌创造了局部生长的有

12、利环境，故一般土壤中也能分离到嫌气菌。海洋对于微生物来说是一个特殊的局部环境，尽管许多微生物也是经河水、污水、雨水或尘埃等途径而来，但由于海洋独特的高盐度、高压力、低温及光照条件，使海洋微生物具备特殊的生理活性，相应也产生了一些不同于陆地来源的特殊产物。前苏联学者发现，20%50%的海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物。此外，美国马里兰大学也曾从海绵体内的共生或共栖的细菌中分离到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物质。日本发现深海鱼类肠道内的嗜压古细菌，80%以上的菌株可以生产EPA 和DHA，最高产量可达36%和24%。笔者从鳕鱼肠道中分离到一株pj20细菌，产EPA14.78mg

13、/L，在15培养时EPA占脂肪酸的12.7%。日本也从海洋Thraustochvtrium aureum中筛选到一株产DNA达290mg/L的菌株。从海洋中采样时，可参考其中不同种类微生物的分布规律：表层多为好气异养菌，底层由于有机质丰富，硫化氢含量高，厌气性腐败菌和硫酸盐还原菌较多，两层中则多为紫硫菌。具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中。如得克萨斯州中南部的一个岩洞中存在着大量嗜碱性的，能进行氨氧化和产几丁质酶的微生物，其原因是这里生活这2000万只蝙蝠，它们每晚吃钓5万lb（磅）昆虫，其排泄物造成了洞内0m深的丰富营养层，这种特殊的环境对该种微生物起了选择和富集的作用。还有人从

14、侵蚀木船的一种蠕虫肠道中分离到既能固氮又能降解纤维素的微生物。从考拉(Koala)熊肠中也曾分离到萜烯分解酶的产生菌，这可能因为考拉专吃含有高萜烯的桉树类植物，给该种微生物创造了一个适宜的生长环境。美国从用硝酸处理过的花生壳中分离到一株节杆菌，该菌以木质素为唯一碳源，它对处理过的花生壳的消化率可达到63%，再加入酿酒酵母使其蛋白质含量达到13.6%，可作为牛、猪、鸡饲料的添加剂。2)极端环境条件的影响微生物一般在中温、中性pH条件下生长。但在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下，也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端微生物。生活所处的特殊环境，导致它们具

15、有不同与一般微生物的遗传特性、特殊结构和生理机能，因而在冶金、采矿及生产特殊酶制剂方面有着巨大的应用价值。嗜冷菌（thermophiles）的最适生长温度为15，在0也可生长繁殖，最高温度不超过20。主要分布于寒冷的环境中，如南北两极地区、冰窟、高山、深海和土壤等低温环境中。这类微生物在低温发酵时可生产许多风味食品且可节约能源及减少中温菌的污染。最适生长pH在8.0以上，通常在pH910之间的微生物，称之为嗜碱菌（alkaliphiles）。大量不同类型的嗜碱菌已经从土壤、碱湖、碱性泉甚至海洋中分离得到。由于大部分碱湖伴有高盐，许多嗜碱菌同时也是嗜盐菌。该类菌所产生的酶如耐碱蛋白酶和碱性纤维素

16、酶可作为洗涤剂的舔加成分，也可将碱性淀粉酶用于纺织品工业。嗜碱菌中的基因还可以用来调节其他细菌中基因产物的表达和分泌。嗜热微生物是嗜热菌最好的来源。有人从温泉和海底火山口分离出了极端嗜热菌。从意大利境包括热处理、膜过滤法和离心法。热处理方法常用来减少样品中的细菌数。因为许多放线菌的繁殖体、孢子和菌丝片段比革兰氏阴性细菌细胞耐热，加热处理，虽然放线菌数目有所减少，但能增加放线菌同细菌的比例。膜过滤法和离心法常用来浓缩水中的微生物细胞。使用过滤法时，要根据目标菌的类型、大小来选择不同孔径的滤膜。（2）化学方法 通过在培养基中添加某些化学成分来增加特定微生物的数量。如常用添加几丁质的培养基来分离土壤

17、和水中的放线菌；用添加CaCO3稳定培养基的pH来分离嗜碱性的放线菌等。（3）诱饵法 是将一些固体物质，如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等，加到待分离的土壤或水中作成诱饵富集目的菌，待其菌落长出后再进行平板分离，可获得某些特殊的微生物种类。二）菌种的富集培养与分离1、富集富集（enrichment）培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。一般可从以下几个方面

18、来进行富集。1）控制培养基的营养成分微生物的代谢类型十分丰富，其分布状态随环境条件的不同而异。如果环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该物质的微生物也较多。因此，在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。当然，能在该种培养基上生长的微生物并非单一菌株，而是营养类型相同的微生物群。富集培养基的选择性只是相对的，它只是微生物分离中的一个步骤。现举两例，如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源，加入含菌样品，给目的微生物以最佳的培养条件（pH、温度、营养

19、、通气等）进行培养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源无法生长，菌数逐渐减少。此时分离将得到所需的微生物。又如要分离耐高渗酵母菌，由于该类菌在一般样品中含量很少，富集培养基和培养条件必须严密设计。首先要到含糖分高的花蜜、糖质中去取样。富集培养基为5%6%的麦牙汁，30%40%葡萄糖，pH34，在2025温度下进行培养，可以达到富集的目的。在富集培养时，还需根据微生物的不同种类选用相应的富集培养基，如淀粉琼脂培养基通常用于丝状真菌的增殖，配方为（%）：可溶性淀粉4，酵母浸膏0.5，琼脂2，pH6.57.0。在配制时要特别注意酵母浸膏加量，过多会刺激菌丝生长，而不利于孢子的

20、产生。根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点，可通过连续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌。如以苯胺作惟一碳源对样品进行富集培养，待底物完全降解后，再以一定接种量转接到新鲜的含苯胺的富集培养液中，如此连续移接培养数次。同时将苯胺浓度逐步提高，便可得到降解苯胺占优势的菌株培养液，采用稀释涂布法或平板划线法进一步分离，即可得到能降解高浓度苯胺的微生物。移种的时间既可根据底物的降解情况，也可通过微生物的生长情况确定。如在分离环己烷降解菌时，样品经环己烷为惟一碳源的培养基富集后，培养液由原来的无色变为浑浊的乳白色。同时锥行瓶壁上也可观察到微生物的生长情况。此时可以2%的接种量移入新鲜的

21、富集培养基中继续培养。连续富集培养的方法虽耗时较长，有时甚至需要67个月，但效果较好。通过该方法分离DDT、甲基对硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌，也都取得了满意的结果。2）控制培养条件通过微生物对pH、温度及通气等条件的特殊要求来控制培养，达到富集目的微生物菌种。（1）pH值 不同微生物生长繁殖的最适pH值不同，培养基配制时要考虑微生物生长代谢产物如有机酸和培养基成分利用后造成的pH变化,控制培养基的pH值一般通过添加磷酸盐缓冲液体系、碳酸钙以及必要时补加酸、碱的方式来调节。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.07.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（4.56）。因此，富集培养基的pH值调

22、节到被分离微生物的要求范围不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。（2）培养温度和热处理 不同种类的微生物所适宜的生长温度是不同的，利用不同培养温度可使不同的嗜温性微生物生长速度不同。筛选耐高温菌株，有利于发酵工业节约冷却用水，采用5060温度培养，就可使嗜冷、嗜温微生物大量淘汰。细菌芽孢是特别耐热的，可以抵抗100或更高的温度，要分离一般所筛选的微生物通常是好气菌，但有时也分离厌氧菌，严格的厌氧菌不仅可省略通气和搅拌，节省能耗。这时除配制特殊的培养基外，还需要厌氧培养箱、厌氧罐等特殊设备创造有利于厌氧菌的生长环境。3）抑制不需要的菌类在分离筛选的过程中，除了通过控制营养和培养条件，增

23、加富集微生物的数量以有利于分离外，还可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性，100很难杀死，要在121才能彻底死亡。可先将土样加热到80或在50%乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离。在富集培养基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性无抑制作。分离厌氧菌时，可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂，它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。 筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌，使霉菌在样品的比例提高，从中便于

24、分离到所需的菌株；分离放线菌时，在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌）各3050U/ml，以及丙酸钠10g/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长。另外据报道，重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，也可用于选择分离放线菌。在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到100保温1h，可减少细菌和链霉菌的数量。分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间，杀死非目的微生物后再进行分离。对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集培养以提高分离工作效率是十分必要的。但是如果按通常分离方法

25、，在培养基平板上能出现足够数量的目的微生物，则不必进行富集培养，直接分离、纯化即可。2、分离分离的方法很多，大体可分为两类：一类较为粗放，只能达到“菌落纯”，如稀释涂布法，划线分离法，组织分离法等。前两种方法由于操作简便有效，工业生产中应用较多。组织分离法则通常是从有病或特殊组织中分离菌株。另一类是较细的单细胞或单孢子分离方法，可达到“菌株纯”或“细胞纯”的水平。这类方法需采用专门的仪器设备，复杂的如显微操作装置，简单的可利用培养皿或凹玻片作分离小室进行分离。下面对这几种分离纯化方法分别加以介绍。1）好气微生物的分离（1）稀释平皿分离法：把土壤样品以十倍的级差，用无菌水进行稀释，取一定量的某一

26、稀释度的悬浮液，涂抹于分离培养基的平板上，经过培养，长出单个菌落，挑取需要的菌落移到斜面培养基上培养。或者吸取一定量稀释好的溶液注入平板，与冷却至50左右的培养基摇匀混合，培养，挑取单菌落。土壤样品的稀释程度，要看样品中的含菌数多少，一般有机质含量高的菜园土等，样品中含菌量大，稀释倍数高些，反之稀释倍数低些。采用该方法，在平板培养基上得到单菌落的机会较大，特别适合于分离易蔓延的微生物。（2）平皿划线分离法：用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养后备用。该分离方法操作简便、快捷，效果较好。在样品含菌量较少或某种目的微生物不多的情

27、况下，微生物的纯种分离方法可以简化如下：第一种方法，取一支盛有35ml无菌水的粗试管或小三角瓶，取混匀的样品少许（0.5g左右）放入其中，充分振荡分散，用灭菌滴管取一滴土壤悬液于琼脂平板上涂抹培养，或者用接种环接一环于平板上划线培养。这种方法不需要菌落计数，比以上常规稀释法简便。第二种方法，取风干粉末状的土样少许（几十毫克）直接洒在选择性分离培养基平板上或混入培养基中制成平板，置适温培养一定时间，长出菌落。例如分离小单孢菌就可采用该方法，从河泥中取样，风干研碎，取样品粉末2050mg直接加到天门冬酰胺培养基中，混合均匀制成平板，培养后长出鱼卵状菌落。这种方法有时分离不够充分，可用划线法进一步纯

28、化。 2）厌气菌的分离基本方法和上述相同，只是要营造无氧环境，常用的方法有加还原剂、焦性没食子酸法、厌氧缸法、生物耗氧法等。三）菌种的初筛和复筛目的菌种的获得需要在菌种分离的基础上，进一步通过筛选，选择产物合成能力较高的菌株。某些菌可以在菌种分离的同时进行筛选，这类菌一般在平皿上培养时，其产物可以与指示剂、显色剂或底物等反应而直接定性地鉴定。但是，并非所有的菌种产物都能用平皿定性方法鉴定，因此就要使用常规的生产性能测定，即通过初筛和复筛方法来确定。1、初筛：利用平皿的生化反应进行这是一种利用特殊的分离培养基对大量混杂微生物进行初步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代

29、谢产物生化反应来设计的。通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应进行分离，可显著提高菌株分离纯化的效率。（1）透明圈法在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。见下左图。 淀粉透明圈 抑菌圈 （2）变色圈法对于一些不易产生

30、透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。如筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为惟一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在pH6.27.6，当pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。通过平板上的变色圈还可以快速分离筛选产乙醇的菌株。在以糖为碳源的琼脂平板的菌落上，覆盖一层含有盐类的琼脂，该蓝

31、色物质在醇脱氢酶和NAD作用下（在少量乙醇存在时）反应产生的电子脱色。因此生成乙醇的菌落便显出一个淡白色的圈，晕圈的大小可初步表示乙醇的产量。（3）生长圈法生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围周围便会形成一个混浊的生长圈。如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌（如E.coliP264）与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。 同样，只要是筛选微生物所需营养物的产生菌时，都可采用生长圈法，工

32、具菌用相应的营养缺陷型菌株，由于得到所需营养，凡是目的微生物周围便会出现混浊的生长圈。（4）抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选。通常抗生素的筛选要投入极大的人力、财力和时间。据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的生产菌。因此设计一个准确、迅速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。采用该方法已经得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。见上右图。在青霉素菌种选育中，还可利用加入青霉素酶来筛选青霉素高产菌株，做法如下：将产黄青霉孢子进行诱变处理，致死

33、率约为99。分离于琼脂平板上，控制孢子浓度，使长成独立菌落，一直培养到青霉素产量达到顶峰，加入0.106U/mol青霉素酶于鉴定菌枯草芽孢杆菌悬浮液中，铺张于菌落平板表面，凝固后，培养1720h。测量抑菌圈大小，根据有效指标（抑菌圈直径与菌落直径之比）选出高产突变株。 采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，而且还能筛选某些酶类。（5） 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指

34、示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。2、复筛：摇瓶培养复筛是在初筛的基础上进一步鉴定菌株生产能力的筛选，采用摇瓶培养，一般一个菌株重复35瓶，培养后的发酵液采用精确的分析方法测定。在初筛阶段，通过简便、快速的平板活性测定，淘汰85%90%不符合要求的微生物。该方法的不足之处是产物的活性只能相对比较，难以得到确切的产量水平。因此，需要进一步进行复筛，选出较优良的菌株。这种直接从自然界样品中分离得到的具有一定生产性能的菌株，称为野生型菌株。在以上复筛过程中，要结合各种培养条件，如培养基、温度、pH、供氧量等进行筛选，也可对同一菌 株的各种培养因素加以组合，构成不同的培养条

35、件进行实验，以便初步掌握野生菌株适合的培养条件，为以后育种提供依据。四）菌种的鉴定通常把鉴定微生物的技术分成四个不同的水平： 细胞的形态和习性水平，例如用经典的研究方法，观察细胞的形态特征、运动性、酶反应、营养要求和生长条件等。 细胞组分水平，包括细胞组成成分例如细胞壁成分、细胞氨基酸库、脂类、醌类以及光合色素等的分析，所用的技术除常规实验室技术外，还使用红外光谱、气相色谱和质谱分析等新技术。 蛋白质水平，包括氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等技术。 基因或核酸水平，包括核酸分子杂交（DNA与DNA或DNA与RNA），（G+C）值的测定，遗传信息的转化和转导，16SrRNA或18SrRNA

36、寡核苷酸组分分析，以及DNA或RNA的核苷酸序列分析等。在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标尚停留在细胞的形态和习性水平上，这类方法可称作经典的分类鉴定方法。从20世纪60年代起，后三个水平的分类鉴定的理论和技术开始发展，并为探索微生物的自然分类系统打下了坚实的基础。以下就对几种常用的鉴定菌种的方法作简单介绍。1、经典的分类鉴定方法所谓经典分类鉴定方法，是相对现代分类鉴定方法而言，通常指长期以来在鉴定中普遍采用的如形态、生理、生化、生态、生活史和血清学反应等指标，常用的鉴定指标有：（1）形态学特征：包括菌落特征、细胞形态、细胞大小、细胞排列、特殊的细胞结构、染色反应等。（2）生理生化特

37、征：包括营养类型、对氮源的利用能力、对碳源的利用能力、对生长因子的需要、需氧性；对温度、pH渗透压的适应性；对抗生素及抑菌剂的敏感性；代谢产物及其与宿主的关系等。（3）血清学试验与噬菌体分型： 细菌细胞和病毒等都含有蛋白质、脂蛋白、脂多糖等具有抗原性的物质，由于不同微生物抗原物质结构不同，赋予它们不同的抗原特征，一种细菌的抗原除了可与它自身的抗体起特异性反应外，若它与其他种类的细菌具有共同的抗原组分，它们的抗原和抗体之间就会发生交叉反应。因此，可以在生物体外进行不同微生物之间抗原与抗体反应试验血清学试验来进行微生物的分类和鉴定。使用的方法除了凝集反应外，还有沉淀反应（如凝胶扩散、免疫电泳）、补

38、体结合、直接或间接的免疫荧光抗体技术、酶联免疫以及免疫组织化学等方法。通常是对全细胞或者细胞壁、鞭毛、荚膜或粘液层的抗原性进行分析比较。此外，也可以用纯化的蛋白质（酶）进行分析，以比较不同细菌同源蛋白质之间的结构相似性。（4）氨基酸顺序和蛋白质分析：蛋白质是基因的产物，蛋白质的氨基酸顺序直接反映mRNA顺序，与编码基因密切相关。因此，可以通过对某些同源蛋白质氨基酸序列的比较来分析不同生物系统发育的关系，序列相似性越高，其亲缘关系愈近。由此，可以根据蛋白质的氨基酸序列资料构建系统发育树并据此进行系统分类。2、现代分类鉴定方法对微生物鉴定工作来说，已从经典的表型特征的鉴定深入到现代的遗传学特性的鉴

39、定、细胞化学组分的精确分析以及利用计算机进行数值分类研究等新的层次上。（1）微生物遗传型的鉴定A、DNA的碱基（G+C）组成DNA的碱基组成和排列顺序决定生物的遗传性状，所以，DNA碱基组成是各种生物一个稳定的特征。它不受菌龄以及突变因素以外的外界条件的影响，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。分类学上，用G+C占全部碱基的质量的百分数（G+C）来表示各类生物的DNA碱基组成特征。测定DNA碱基组成的方法很多，常用的有热变性温度法、浮力密度法和高效液相色谱法。B、核酸的分子杂交生物的遗传信息以碱基排列顺序形式线性地排列在DNA分子中，不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映这些生物之

40、间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近。由于目前尚难以普遍地直接分析比较DNA的碱基排列顺序，所以，分类学上目前主要采用较为间接的比较方法核酸分子杂交（hybridization），来比较不同微生物DNA碱基排列顺序的相似性进行微生物的分类。核酸分子杂交在微生物分类鉴定中的应用包括DNADNA杂交、DNARNA杂交等。C、遗传重组特性分析大多数真核生物都能进行有性生殖，所以，分类学上用能否进行有性生殖来定义物种。原核生物中，虽然没有有性生殖，但它们可以通过转化、转导和接合作用进行染色体基因的交换，这种交换通常具有种属特异性。研究表明，发生接合、转化和普遍性转导的细菌之

41、间需要存在广泛的染色体同源性，否则此类重组（同源重组）就不能发生。因此，在细菌分类中，发生同源重组可以作为细菌密切相关的证据。例如，转化通常只在同属 Woese等曾测定了200多种原核生物的16S rRNA和真核生物的18S rRNA的寡核苷酸顺序谱，经过比较研究，不但搞清了原核生物和真核生物的许多系统进化问题，而且还导致了古细菌界的建立。该方法是通过比较各类原核生物16S rRNA和真核生物的18S rRNA的基因序列，从序列差异计算它们之间的进化距离，可以绘出生物进化树。选用16S rRNA或18S rRNA的原因是：它们为原核和真核细胞所特有，其功能同源且较为古老，既含有保守序列又含可变

42、序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。原核生物16S rRNA序列分析技术的基本原理就是，通过克隆微生物样本中的l6S rRNA的基因片段测序或酶切、探针杂交获得16S rRNA序列信号，再与16S rRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。真核生物的18S rRNA序列分析技术与原核生物16S rRNA序列分析技术基本相同。（2）细胞化学组分特征分类法（3）利用计算机进行数值分类二、菌种的选育（改良）来源于自然界的微生物菌种，在长期的进化过程中，形成了一整套精密的代谢控制机制，微生物细胞内具有反馈抑制、阻遏等代谢调

43、控系统，不会过量生产超过其自身生长、代谢需要的酶或代谢产物。所以，从自然界分离得到的野生菌株，不论在产量上或质量上，均难适合工业化生产的要求。育种工作者的任务是设法在不损及微生物基本生命活动的前提下，采用物理、化学或生物学以及各种工程学方法，改变微生物的遗传结构，打破其原有的代谢控制机制，使之成为“浪费型”菌株。同时，按照人们的需要和设计安排，进行目的产物的过量生产，最终实现产业化的目的。菌种选育改良的具体目标包括：（1）提高目标产物的产量。生产效率和效益总是排在一切商业发酵过程目标的首位，提高目标产物的产量使是菌种改良的重要标准；（2）提高目标产物的纯度，减少副产物。在提高目标产物产量的同时

44、，减少色素等杂质含量以降低产物分离纯化过程的成本；（3）改良菌种性状，改善发酵过程，包括改变和扩大菌种所利用的原料范围、提高菌种生长速率、保持菌株生产性状稳定、提高斜面孢子产量、改善对氧的摄取条件并降低需氧量及能耗、增强耐不良环境的能力（如耐高温、耐酸碱、耐自身所积累的过量代谢产物）、改善细胞透性以提高产物的分泌能力等；（4）改变生物合成途径，以获得高产的新产品。目前，比较常用的育种手段很多，主要有以下几种方法：1、自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过程，叫做自然选育。菌种的自发突变往往存在两种可能性：一种是菌种衰退，生产性能下降；另一种是代谢更加旺

45、盛，生产性能提高。具有实践经验和善于观察的工作人员，就能利用自发突变而出现的菌种性状的变化，选育出优良菌种。例如，在谷氨酸发酵过程中，人们从被噬菌体污染的发酵液中分离出了抗噬菌体的菌种。又如，在抗生素发酵生产中，从某一批次高产的发酵液取样进行分离，往往能够得到较稳定的高产菌株。但自发突变的频率较低，出现优良性状的可能较小，需坚持相当长的时间才能收到效果。2、诱变育种诱变育种是指用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用。具有操作简便、速度快和收效大的优点。 其过程如下：1）出发菌株的选择工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株（parent s

46、train）。作为出发菌株，首先必须是纯种（单倍体），要排除异核体或异质体的影响；其次对诱变剂敏感且变异幅度广，这样可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大；第三具有优良的性状，如产量高、产孢子早而多、色素多或少、生长速度快等有利于合成发酵产物的特性。一般有三种：从自然界分离得到的野生型菌株；通过生产选育，即由自发突变经筛选获得的高产菌株，经过了生产的考验，效果最好；已经诱变过的菌株。2）制备菌悬液此步骤的目的是为了保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分接触，避免细胞团中变异菌株与非变异菌株混杂，出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。因此制备单细胞或单孢子状态并且均匀的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养（前培养），并要离心，洗涤，过滤。3）诱变处理该步骤关键是诱变剂的选择和诱变剂量的确定目前常用的诱变剂主要有紫外线(UV)、硫酸二乙酯、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG或MNNG)和亚硝基甲基脲(NMU)等。后两种因有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变