第十五章rna生物合成课件.ppt

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1、第十五章 RNA生物合成（转录）RNA Biosynthesis(Transcription),王伟章 博士/副教授生物化学与分子生物学系wei-,主 要 内 容,第一节、转录第二节、转录后的加工第三节、基因转录调控,转录,转录：生物体以DNA为模板、NTP为原料，在RNA聚合酶催化下合成单链RNA的过程。,RNA,DNA,DNA复制,转录的体系,底物(substrate):ATP,GTP,CTP,UTP；模板(template):DNA单链；聚合酶(polymerase):依赖DNA的RNA聚合酶；RNA的延长只可沿53方向进行；其他辅助因子:转录因子（真核生物），延长因子（真核生物）。,一

2、、转录的模板,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t c a t g t a c a g 5,编码链,模板链,模板链与编码链,DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作有意义链或Watson链。与模板链进行碱基配对的另一股DNA单链称为编码链(coding strand)，也称为反义链或Crick链。,二、RNA聚合酶,RNA聚合酶（RNA polymerase,RNA pol）：催化DNA转录合成RNA的酶，也称DNA指导的RNA聚合酶（DNA dependent RNA polymerase）。,二、RNA聚合酶,

3、1.原核生物RNA聚合酶（只有一种）,原核RNA聚合酶结构示意图,核心酶(core enzyme),全酶(holoenzyme),（转录起始阶段）,（转录延长阶段）,二、RNA聚合酶,2.真核生物RNA聚合酶,二、RNA聚合酶,3.RNA的复制 以RNA为模板，NTP为原料，在RNA复制酶的作用下合成新的RNA称为RNA复制。RNA复制酶又称为RNA指导的RNA聚合酶（RDRP）。,RNA复制,RNA复制酶,RNA复制酶,三、启动子,启动子（promoter）：指的是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段特定DNA序列，位于转录单位5端上游区。,1原核生物启动子 原核生物启动子区域有3个功能部

4、位：起始转录部位转录第一个核苷酸的碱基对（+1）、RNA聚合酶识别位点(-35)和结合位点（-10），其中后两项为启动子的核心区域。,三、启动子,3,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,RNA-pol结合位点(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,RNA-pol辨认位点(Sextama box),5,RNA聚合酶保护区,结构基因,5,3,原核生物启动子结构,三、启动子,2真核生物启动子 真核生物有三种RNA聚合酶，每一种都有自己的启动子类型：RNA聚合酶I只转录rRNA，只有一种启动子类型；RNA聚合酶

5、II转录mRNA，其启动子结构最为复杂；RNA聚合酶III负责转录tRNA和5S rRNA，其启动子位于转录的DNA序列之内，故称下游启动子。,三、启动子,2真核生物启动子 真核生物RNA聚合酶II的启动子是多部位结构，主要有四个部位：帽子位点（cap site）：转录起始位点（+1）；TATA框:序列为TATA（A/T）A（A/T），决定了转录的起始点的选择；CAAT框:其一致的序列为GG（C/T）CAATCT，控制转录起始的频率；增强子（enhancer）：核心序列TGG（A/T）（A/T）（A/T），能使和它连锁的基因转录频率明显增加。,真核生物启动子结构,TATA box（-25）,C

6、AAT box（-75）,结构基因,-CAAT-TATA-,转录起始点（+1）,启动子,转录方向,四、转录过程（原核）,（一）转录起始：1.RNA聚合酶通过识别位点并初步结合启动子；2.移动定位并牢固结合在结合位点上；3.在起始位点上建立一个开链式启动子复合物。,转录起始过程,闭链式二元复合物,开链式二元复合物,转录起始复合物RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3,四、转录过程（原核）,（二）转录延长1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,转录

7、延长示意图,编码链,模板链,核心酶,转录方向,转录延长（全貌）,转录方向,四、转录过程（原核）,（三）转录终止 终止子：提供转录停止信号的DNA序列。RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。原核生物有两种转录终止方式：依赖Rho(r)因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止,四、转录过程（原核）,（三）转录终止1.依赖r因子的转录终止模式,ATP,因子具有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。,四、转录过程（原核）,（三）转录终止2.非依赖r因子的转录终止模式在转录后期，转录生成的RNA产物可形成特殊的“发夹（hairpin）”结构使RN

8、A聚合酶变构，丧失其RNA聚合酶活性，导致转录终止。,非依赖r因子的转录终止模式,反向重复序列,反向重复序列,使RNA聚合酶变构，转录停顿使转录复合物趋于解离，RNA产物释放,RNA-pol,RNA-pol,原核生物转录过程总结,1,2,3,4,5,6,7,五、转录过程（真核）,真核生物的转录过程也可以分为起始、延伸和终止三个阶段。真核生物转录起始需要各种转录因子（TF）与顺式作用元件相互结合，同时蛋白质因子之间也要相互识别、结合。能直接、间接辨认和结合真核生物基因顺式作用元件的蛋白质，统称为反式作用因子，直接或间接结合RNA聚合酶的反式作用因子，则称为转录因子。,参与RNA-pol转录的TF

9、,*相应于RNA-pol I、II、III的转录因子，分别称为TF I、TF II、TF III。,真核转录起始（动画）,真核转录延长（动画）,真核转录终止（动画）,主 要 内 容,第一节、转录第二节、转录后的加工第三节、基因转录调控,基因转录的直接产物初级转录产物（primary transcripts），必须经过转录后加工（post-transcriptional processing），才会转变为有功能的RNA，即成熟RNA分子。一系列的加工修饰包括：RNA链的裂解5端与3端的切除特殊结构的形成剪接（splicing）碱基修饰和糖苷键改变,一、原核生物mRNA的加工,mRNA通常没有转录

10、后的加工过程。rRNA需经剪切和修饰加工。剪切：将初级转录产物剪成16S、23S和5S三个片段修饰：核糖2-羟基的甲基化tRNA的加工方式也是剪切和修饰。剪切：切除多余的核苷酸序列修饰：甲基化和3-端加CCA,二、真核生物mRNA的加工,真核生物的大多数基因都被插入序列（intervening sequence）即内含子（intron）所分隔而成为间断基因（interrupted gene）即外显子（exon）。内含子是真核细胞基因中的非编码序列，而外显子是指真核细胞基因中的编码序列。转录后需通过剪接反应去除非编码区（内含子）使编码区（外显子）成为连续序列。,转录产物为hnRNA的真核基因结构

11、示意图,转录,hnRNA,加工,mRNA,二、真核生物mRNA的加工,由hnRNA转变成mRNA的加工修饰过程包括：（1）5端形成特殊的帽子结构；（2）在链的3端切断一段序列并加上多聚腺苷酸（poly A）尾巴；（3）通过剪接除去由内含子转录来的序列。,帽子结构示意图,“帽子”结构,“帽子”结构N7甲基鸟苷酸（m7GpppX）,“帽子”结构,帽子结构的生成过程,5 pppGp,5 GpppGp,pppG,ppi,鸟苷酸转移酶,5 m7GpppGp,甲基转移酶,SAM,5 ppGp,磷酸酶,Pi,真核生物3多聚腺苷酸生成过程,加帽和加尾的意义,加帽可以使mRNA免遭核酸酶的攻击；也能与帽结合蛋白

12、质复合体(cap-binding complex of protein)结合，并参与mRNA和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。加尾可以维持mRNA作为翻译模板的活性，以及增加mRNA本身的稳定性。,RNA剪接,mRNA的前体（hnRNA）经过剪接体（spliceosome）加工处理，去除内含子，并将相邻外显子连接起来，形成有功能mRAN(成熟mRNA)，这一过程称为RNA剪接（RNA splicing）。,hnRNA,mRNA,剪接过程,hnRNA,中间产物,成熟mRNA,降解,第一次转酯反应,第二次转酯反应,剪接体的生成,剪接体（spliceosome）：是由细胞核小分子核糖核蛋白颗粒（

13、snRNP）与hnRNA结合，使内含子形成套索并拉近上、下游外显子距离的复合体。,hnRNA,蛋白,snRNA【U1、U2、U4、U5、U6】,snRNP,剪接体（spliceosome）,成熟mRNA,剪接体组分,套索,切下的内含子,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,hnRNA,剪接、剪切及首尾修饰,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因,RNA剪接（动画）,大鼠降钙素基因的可变剪接,甲状腺,大脑,真核mRNA转录后加工（动画）,三、tRNA和rRNA加工,（一）tRNA转录后的加工1.剪切与剪接,RNase,三、tRNA和rRNA加工,（一）tRNA转录后的加工2.添加：添加3氨基酸臂-CCA,

14、tRNA核苷酸转移酶、连接酶,三、tRNA和rRNA加工,（一）tRNA转录后的加工3.修饰,甲基化：GmG 还原：U DHU 脱氨:A I 转位:U,稀有碱基结构示意图,三、tRNA和rRNA加工,（二）rRNA转录后的加工1.甲基化：发生于45s rRNA2.剪切：,45S 41S,20S 18S,32S 28S5.8S,28S5.8S,（真核生物）,DNA,转录,真核rRNA的加工过程,甲基化,甲基化群,剪切,45S rRNA,成熟rRNA,复制与转录的异同点,相同点：需要DNA模板遵循碱基配对原则聚合反应形成磷酸二酯键合成方向为53,七、复制与转录的异同点,不同点：,主 要 内 容,第

15、一节、转录第二节、转录后的加工第三节、基因转录调控,一些基本概念,基因（gene）：负载特定遗传信息的DNA片段，可以编码单个具有生物功能的产物，如RNA和多肽链，其结构包括由DNA编码序列、非编码调节序列和内含子组成的DNA区域。基因表达（gene expression）：指基因通过转录和翻译而产生其蛋白质产物，或转录后直接产生其RNA产物（如tRNA、rRNA等）的过程。基因表达调控（Regulation of Gene Expression）：指在不同时期和不同条件下，基因表达的开或关以及基因表达速率均受到调节和控制。,一、原核细胞转录水平的调节操纵子学说,操纵子（operon）：由几个

16、功能相关的结构基因及其调控区组成一个基因表达单位。调控区由上游的启动子（promoter）和操纵区（operator）组成。操纵子有两种类型：一类是诱导操纵子，即诱导基因，这些基因能因环境中某些物质的出现而被活化。另一类是阻遏操纵子，即阻遏基因，一般情况下处于表达状态，但当其产物大量出现时即关闭。,（一）乳糖操纵子,1.乳糖操纵子的结构,（一）乳糖操纵子,2.乳糖操纵子受到了阻遏蛋白的负性调控,无乳糖存在时,（一）乳糖操纵子,2.乳糖操纵子受到了阻遏蛋白的负性调控,有乳糖存在时,3.分解物基因激活蛋白（CAP）的正性调节,有葡萄糖，cAMP浓度低，CAP未被激活，不能结合CAP位点,无葡萄糖，

17、cAMP浓度高，CAP被cAMP激活可结合CAP位点,（一）乳糖操纵子,CAPsite,CAP激活RNA聚合酶示意图,没有CAP结合CAP位点，RNA聚合酶仅具有低转录起始活性；但CAP结合CAP后，能显著提高RNA聚合酶的转录起始活性。,（一）乳糖操纵子,4.阻遏蛋白与CAP的协调调节当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对乳糖操纵子表达不起调控作用；当阻遏蛋白失活，基因开放时，无CAP的正性调控，乳糖操纵子仅处于低表达或不表达状态；当阻遏蛋白失活，基因开放时，CAP的正性调控使乳糖操纵子处于高表达状态。,乳糖操纵子协调表达示意图,低乳糖时,高乳糖时,葡萄糖低 cAMP浓度高,葡萄糖高cAMP浓度低,

18、【阻遏蛋白关闭基因】,【基因高表达】,【阻遏蛋白关闭基因】,【无CAP，基因低表达】,葡萄糖与乳糖对乳糖操纵子的调节作用,葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；葡萄糖对乳糖操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repression)。,乳糖操纵子,（二）色氨酸操纵子,色氨酸操纵子含有五个结构基因，E、D、C、B、A基因，它们所编码的酶类催化从分支酸合成色氨酸的一系列反应。其中E、D基因共同产生邻氨基苯甲酸合成酶，C基因产物是吲哚甘油磷酸合成酶，B、A基因共同产生色氨酸合成酶。,色氨酸操纵子,Trp 高时,Trp 低时,mRNA,O

19、,P,trpR,调节区,结构基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,辅阻遏蛋白（无活性）,辅阻遏蛋白（激活）,E,D,C,B,A,前导序列,二、真核细胞基因转录的调节,顺式作用元件（cis-acting element）：与相关基因同处一个DNA分子上，对基因转录起调控作用的一段DNA序列。反式作用因子（trans-acting factor）：与顺式作用元件进行特异性结合的蛋白质因子。转录因子（TF）就是最常见的一类反式作用因子。根据它们的结构特点分为三类：螺旋-转角-螺旋、亮氨酸拉链和锌指蛋白。,螺旋-转角-螺旋（HTH）,一个螺旋(羧基端)识别特异的顺式作用元件上的DNA序列，另一个螺旋(氨基

20、端)则结合在DNA上，调控基因的转录。,锌指结构（zine finger）,结构示意图,作用示意图,亮氨酸拉链（leucine zipper）,结构示意图,作用示意图,三、RNA聚合酶与起始复合物相互作用,真核基因表达调控的环状理论模型：转录因子可使DNA形成环状，将远处的顺式作用元件（增强子）拉到起始部位形成复合物，促进和调控基因表达。,顺式作用元件示意图,TATA盒（）,CAAT盒（）,GC盒（）,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,转录起始点,顺式作用元件,顺式作用元件：转录起始点上游具有转录调节功能的特异DNA序列。,转录方向,启动子,原核生物的基因结构,DNA,P：promoter；O：operator,转录,翻译,mRNA,蛋白,