基础生化-2011第九章 DNA的生物合成课件.ppt

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1、第九章 DNA的生物合成,第一节 DNA的复制第二节 DNA的损伤修复第三节 反转录,第一节 DNA的复制（replication）,一、复制的一般特点,二、复制的方式半保留复制,四、参与复制的酶和蛋白质,三、DNA的复制起点和复制方式,五、复制的过程,六、DNA复制的忠实性,一、复制的一般特点,1.模板、前体、Mg2+。2.DNA的解链3.半保留复制4.需要引物5.链延伸的方向6.固定的起点（复制起始区有共有特征）7.复制的方向（双、单）8.半不连续复制,返回节,二、复制的方式半保留复制,P515,二、复制的方式半保留复制,1.半保留复制Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即

2、推测，DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。,P515,（2）1963年，Cairns用放射自显影法，3H-脱氧胸苷标记大肠杆菌DNA,在显微镜下首次观察到完整的正在复制的染色体DNA。,三、DNA的复制起点和复制方式,（一）DNA的复制起点,复制从特定的位点开始，这一位置叫复制原点。原核生物的DNA上一般只有一个复制原点，但在迅速生长时期，第一轮复制尚未完成，就在起点处启动第二轮复制；真核生物则有多个复制原点，可以同时启动复制过程。,1

3、.复制子(replicon)：基因组能独立进行复制的单位。,2.复制起点（origin）：,P516,3.复制方向：单向或双向浓度不同的3H-脱氧胸苷标记大肠杆菌DNA。,1.复制（大肠杆菌为代表）2.滚环复制3.D-环复制（取代环式）4.真核细胞的复制,（二）DNA的复制方式,P518,滚环复制(rolling circle replication)是一些简单低等生物或染色体以外的DNA复制的特殊形式。,返回节,滚环复制,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)和叶绿体DNA的复制形式。两条链复制起点分开,四、参与复制

4、的酶和蛋白质,（一）DNA聚合酶(依赖于DNA的DNA polymease),1.原核生物 DNA聚合酶,该酶的催化特点直接决定了DNA复制的基本特点。,P519,底物模板指导：加入核苷酸的种类由模板决定需要引物链：只能催化脱氧核苷酸加到已有核苷酸链的3-OH上。链的延伸方向：5 3产物的性质与模板相同,P520,DNA聚合酶的反应特点：,DNA polymerase 是主要的复制酶,E.Coli 三种DNA聚合酶比较,切去引物RNA，DNA修复,DNA修复,DNA复制,DNA聚合酶和是易错的DNA聚合酶（1999）,P522,大肠杆菌DNA聚合酶I的凹槽空间为多功能酶：有限水解后得到的大片段

5、Klenow具有35外切酶活性；聚合酶和35外切酶活性紧密结合；小片段有5 3外切酶活性；,DNA聚合酶I的35核酸外切,DNA复制过程受到双重核对：聚合酶的选择（错误率10-5）、35外切酶的校对（错误率5*10-7）。,53核酸外切,DNA polymerase III的亚基组成,核心酶,夹子装配器,滑动钳,是异二聚体，有两种形式：核心酶、全酶,P522,使DNA解开的双链可以同时进行复制。,E.coli DNA 聚合酶不对称二聚体,滑动钳,钳载复合物,核心酶,复杂的结构使其具有更高的忠实性、协同性和持续性。,可滑动的 夹持器亚基,催化亚基,35外切酶亚基,前导链 合成,后随链 合成,夹持

6、器装置,催化亚基,亚基保持核心酶 的二聚体结构,2.真核生物常见的DNA聚合酶 P531,其它 DNA聚合酶一般缺乏53核酸外切活性,（二）使DNA双螺旋解开的酶和蛋白质,1.解螺旋酶(helicase)（1）具有依赖DNA（单链）的NTPase活性，每解开一对碱基需要水解2分子ATP。（2）具有移位酶活性可沿被结合的DNA链单向移动。如大肠杆菌中的rep蛋白，方向为35；参与复制的DnaB蛋白 5 3。,2.单链结合蛋白(single-strand binding Protein，SSBP)：大肠杆菌SSB分子量75，6000，由4个相同亚基构成。作用：稳定单链DNA。SSB与解链后的DNA

7、单链结合，结合后的DNA分子僵硬，不易弯曲，有利于单链DNA分子的稳定，避免核酸酶进攻；同时降低了Tm值，进一步促进DNA的解链。,P526,3.拓扑异构酶通过催化DNA链断裂、旋转和重新连接改变DNA拓扑学性质。生物体内DNA通常处于负超螺旋状态，此时有利于解链。（1）类型酶作用：DNA一条链的断裂和连接，无能量消耗。举例:大肠杆菌拓扑异构酶可减少负超螺旋；对正超螺旋无作用（原核）（2）类型型酶作用：DNA两条链同时断裂和再连接，引入超螺旋时消耗ATP。举例：细菌的DNA旋转酶（拓扑异构酶）可引入负超螺旋（需ATP提供能量），有利于复制解链、及时消除复制叉前方的正超螺旋、分开复制结束后缠绕在

8、一起的两个子代DNA。,P525,合成RNA引物，又叫引物合成酶、引发酶。,它以单链DNA为模板，以ATP、GTP、CTP、UTP为原料，从53方向合成出RNA片段，即引物。,原核细胞是DNA聚合酶或RNaseH（水解与DNA杂交的RNA链）。真核细胞是RNaseH,（三）引物酶(primrase),（四）切除引物的酶,（五）DNA连接酶(DNA ligase),1.作用：缝合切口和片段催化双链DNA内相邻核苷酸的3-OH和5-Pi形成磷酸二酯键。不仅参与复制，也参与DNA修复和重组。2.连接反应需要能量：E.coli 和某些细菌中由NAD+提供；真核、病毒和噬菌体由ATP提供。,P523,端

9、粒是位于染色体末端的特殊结构，由很多成串的短重复序列组成。一条链富含G，互补链富含C。在决定细胞寿命中起重要作用。,（六）端粒酶（真核）,P532,线形复制时末端RNA引物的切除会导致链的缩短。,端粒酶是一种依赖于RNA的DNA聚合酶，RNA-蛋白质复合体。它以其RNA为模板,通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。维持染色体结构的完整。,爬行模式,返回节,P532,五、复制的过程（大肠杆菌为例）,（一）复制的起始,就目前所知，起始阶段是DNA复制中唯一可以受调节的阶段，复制过程的调控主要取决于复制启动的频率，而DNA延长的速度大体上是恒定的。,DNA的复制是由引发体识别并结合于复制原点而被启动

10、的，其机理比较复杂，目前还不十分明了。,P527,E.coli复制起始点oriC的结构（P527）,跨度为245bp，有3组串联重复序列和2对反向重复序列。,20-40个DnaA各自带1个ATP结合在4bp重复序列,在13bp序列上解链,DnaB/Dnac解开双螺旋形成复制叉,复制起始点、复制子与复制叉,复制原点处DNA双螺旋局部解链，形成“眼状”结构 复制眼,复制眼形成后，其两端的叉子状结构称为复制叉。,引发体引导引物酶到达复制叉位置合成引物。,含有解螺旋酶（DnaB蛋白）、DnaC蛋白（招募）、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。引物合成方向也是53方向。长度约为十几个到几十个

11、核苷酸不等。,参与复制起始的蛋白因子,名称,功能,DnaA蛋白 辨认起始点,解螺旋酶（DnaB，Rep）解开DNA双链,DnaC 协助解螺旋酶,引物酶（DnaG）催化RNA引物生成,SSB 稳定解开的单链,拓扑异构酶 理顺DNA链,P527,（二）复制的延伸,DNA聚合酶加入到引发体上，这种由DNA和多种蛋白质组装形成用于DNA复制的复合体称为复制体。,延伸需要形成复制体，同时进行前导链和后随链的合成。,1.复制体的形成,2.复制叉推进的方式,P529,一条链上DNA合成方向和复制叉移动方向相同，而在另一条模板上却是相反的。复制时两条链如何能够同时作为模板合成新链呢？,1968年日本人冈崎提出

12、半不连续复制模型,实验设计：用3H-脱氧胸苷标记噬菌体T4感染的大肠杆菌碱性密度梯度离心分离标记的DNA产物,结果：短时间首先出现较短的DNA（约1000nt），接着出现较大分子。DNA连接酶变异的温度敏感株则积累大量DNA片段,说明：DNA复制时先合成短片段，然后由连接酶连成大分子,若用DNA连接酶变异的温度敏感株进行实验？,前导链(leading strand),后随链(lagging strand),DNA的半不连续复制,前导链和后随链；半不连续复制；冈崎片段,引物酶在复制原点附近合成一段RNA引物；DNA聚合酶(原核细胞)在引物的3末端逐个添加脱氧核苷酸。随着复制叉的推进，亲代DNA双

13、螺旋不断被解开，先导链也不断延伸直到复制终点。,前导链的合成,后随链的合成,引物的合成：引物酶催化生成多个引物。,冈崎片段的合成：DNA聚合酶(原核细胞),冈崎片段的连结：DNA聚合酶一面以其DNA聚合活性在上游冈崎片段的3-OH末端添加脱氧核苷酸，一面以其53核酸外切活性切除引物，直至将引物全部切除。DNA连接酶将最后的缺口补好。,前导链和随后链合成的协调,后随链绕成突环，从而使冈崎片段的延伸方向与先导链的延伸方向一致，它们的3末端分别落在DNA聚合酶全酶的双活性部位。因此，随着聚合酶的移动，两条链同时延伸。,复制叉内前导链和后随链由同一个DNA聚合酶二聚体催化。,P529,DNA聚合酶催化

14、前导链和随从链同时合成,合成冈崎片段需要DNA聚合酶不断与模板脱开，然后在新位置上与模板结合，这是由夹子和夹子装配器完成的。,（三）复制的终止,复制的终止没有特殊的信号,原核生物中：其环状的DNA从单点开始双向复制，当两个复制叉在复制原点的对面处相遇并合并时，结束复制，形成两个环状DNA分子。,真核生物中：多个复制原点形成多个复制眼，复制叉的推进使复制眼增大，直至各个复制眼融合，复制终止，形成两个线状DNA分子。,P529,返回节,六、DNA复制的忠实性,差错率为10-9-10-10,四种dNTP浓度的平衡新合成的子链与母链之间碱基配对严格性DNA聚合酶对底物专一性DNA聚合酶的自我校对作用D

15、NA修复机制使用引物RNA,返回章,P524,一、DNA损伤的原因,第二节 DNA的损伤与修复,二、DNA损伤的类型,三、DNA 修复机制,四、DNA突变,一、DNA损伤的原因,（一）细胞内在因素,（二）外界环境因素,1.复制错误2.DNA结构的不稳定3.活性氧的破坏,1.化学诱变剂：,（1）碱基修饰剂亚硝酸（嘌呤或嘧啶脱氨）:A-T转变为I-C黄曲霉素（最强致癌物）,P538,亚硝酸盐使C脱氨变成U，经过复制就可使DNA上的G-C变成A-T碱基对。,（2）碱基类似物5-溴尿嘧啶（5-BU）是胸腺嘧啶类似物，能产生两种互变异构体，一种是酮式，一种是烯醇式。酮式可与A互补配对，烯醇式可与G互补配

16、对，因此，当5-BU掺入DNA复制时使AT转换为GC，会导致碱基转换突变。，,（3）嵌入染料一些扁平的稠环分子，如原黄素、溴化乙锭等，插入到DNA碱基对之间，使碱基对间的距离撑大约一倍，占据一个碱基对的位置，DNA复制时造成新合成的链插入或缺失，结果造成移码突变。,外环境中的射线：X-射线、紫外线等 高剂量的紫外辐射使DNA链上邻近的嘧啶核苷酸之间形成化学键，生成二聚体；此外还有脱嘌呤作用和脱氨基作用.,2.物理：紫外辐射和离子辐射,返回节,二、DNA损伤的类型,1.碱基丢失或脱落2.碱基转换（A、C的脱氨转变为 I、U）3.碱基修饰4.碱基交联（二聚体）5.碱基错配,（一）碱基损伤,（二）D

17、NA链损伤严重,1.链的断裂（放疗）2.DNA链的交联3.DNA与蛋白质的交联,三、DNA 修复机制,DNA修复是细胞对DNA受损伤后的一种反应它可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能。但修复有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能耐受DNA损伤继续生存；也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等）。在人类基因组中已经确认至少130个以上的基因参与DNA修复。,（一）错配修复 错配修复需要识别“新”、“旧”链，如果识别错误，则导致错配被固定。大肠杆菌的 Dam甲基化酶可使旧（母）链DNA的GATC序列中A的N6位甲基化。复制后DNA短期内保持半甲基

18、化的GATC序列，如发现错配则将未甲基化的核苷酸链切除，以甲基化链为模板修复合成即可。错配修复有缺陷会造成癌症等疾病。,P533,MutS识别、结合到错配部位,MutSL移动到GATC序列,MutL与MutS结合,MutH核酸内切酶与MutSL结合，并在未甲基化链GATC位点5端切开,核酸外切酶切除核酸链,DNA聚合酶III和DNA连接酶合成并连接新链。,（二）直接修复,1.光修复（光复活）由DNA光裂合酶（photolyase）催化。该酶需要光（400700 nm）才能激活，它能切除嘧啶二聚体之间的连键(C-C键)，从而修复由紫外照射而造成的损伤。,直接将受到损伤的部位转变为正常的部位，不切

19、除错误片段,P533,光修复,光修复酶(photolyase),UV,细菌、真菌、植物、很多脊椎动物有该酶，在植物中特别重要。胎盘类哺乳动物没有。,2.烷基化碱基的直接修复（了解）碱基的烷基化会改变碱基配对性质。如：O6-甲基鸟嘌呤的修复烷基转移酶，O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶最常见。该酶以“自杀”方式催化反应。以其活性中心的Cys残基作为甲基受体，但得到甲基就失活了。随后被选择性降解。以一个酶分子为代价修复一个损伤的碱基。稳定压倒一切,指在一系列酶的作用下，识别DNA分子的损伤部位并将其切除，并以完整的那一条链为模板修复合成并连接，使损伤的DNA恢复正常结构的过程。1.核苷酸切除修复（nucl

20、eotide excision repair,NER）2.碱基切除修复（base excision repair,BER）两种。两者的主要差别是：前者识别损伤对DNA双螺旋造成的扭曲，后者直接识别受损伤的碱基。,（三）切除修复（普遍）,P534,空缺由DNA-pol和连接酶合成并连接。,E.coli的切除修复机制,P535,结构变形,是细胞内最重要和有效的修复机制。,其过程是：切补切缝 由专一性核酸内切酶催化，在损伤处附近切断 由DNA聚合酶在断口处进行DNA合成 由5-核酸外切酶将损伤部位切掉 由连接酶将新合成的DNA链与原来的链连接,NER缺陷与癌症和遗传疾病,核苷酸切除修复缺陷与癌症的发

21、生有关。着色性干皮病是由于体内NER系统缺陷引起皮肤细胞对日光或紫外线特别敏感，其所形成的T-T二聚体因为缺乏能切除T-T二聚体的特异性核酸内切酶所致，以致在后续的复制中造成遗传信息改变，最终出现皮肤癌。,损伤并未消除，但被“稀释”了。,（四）重组修复,一种复制后修复。不管损伤，先复制,P536,(五)SOS修复（跨越合成）,1.SOS反应：染色体DNA受到严重损伤时细胞做出的应激反应。广泛存在于生物中，是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。2.SOS反应诱导的修复系统：避免差错的修复、易错修复,返回节,DNA聚合酶具有校对功能，在DNA损伤部位合成时，再次引入的核苷酸不能配对还会被切除，

22、因此会在原地打转，或脱落造成DNA合成中止。,3.易错修复的生理意义细胞在潜在致死性压力下，诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶和，它能在DNA的损伤部位进行复制，从而避免了死亡，但产生很高的变异率。,四、DNA突变,DNA分子上可遗传的结构变化通称为突变。,（一）点突变（置换）1.转换(transition)：同类碱基之间的置换2.颠换(tansversion)：异类碱基之间的置换,突变的结果：（1）决定同样的氨基酸：沉默突变（2）决定不同的氨基酸：错义突变或中性突变（3）突变为终止密码子或反之：无义突变或通读突变,P537,（二）移码突变（移框突变）,1.插入2.缺失,（三）隐性和显性突变,

23、非3的整倍数个核苷酸的插入或缺失,返回章,第三节 逆转录作用（RNA指导的DNA合成）,二、逆转录酶,三、病毒RNA的反转录过程,一、逆转录定义,定义:以RNA为模板,逆转录酶催化按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA的过程称为逆转录(reverse transcription,RT)。,反转录现象不仅在反转录病毒中发现，也存在于细菌、古细菌和真核生物中（HIV、乙肝（BV）、真核细胞端粒酶）,P589,一、逆转录,实验发现：Temin 发现放线菌素D（抑制以DNA为模板的反应）抑制致癌RNA病毒的复制，但不一致普通RNA病毒的复制。Temin 1964年提出前病毒学说1970年Temin和Bal

24、timore同时分别从(鸡)劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出反转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有反转录酶。获1975年诺贝尔奖。,二、逆转录酶,1.逆转录酶的发现,（1）逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性：RNA指导的DNA聚合酶活性 DNA指导的DNA聚合酶活性 RNase H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿5 3和3 5两个方向起核酸外切酶的作用。,（2）逆转录酶也和DNA聚合酶一样,沿53 方向合成DNA,并要求引物（可以是寡聚脱氧核糖核苷酸或寡聚核糖核苷酸）。但没有3 5外切酶活性缺乏校对能力（抗药性）。,2.逆转录酶的特点,3.反转录

25、酶发现的理论和实践意义：促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前反转录酶已经成为研究这些学科的有力工具。,TTTT,poly A tail,CCC,3,5,3,GGG,整合入细胞基因组,逆转录活性,RNaseH活性,RNA:DNA杂合链,RNA模板,cDNA,双链DNA（前病毒）,DNA pol活性,三、病毒RNA的反转录过程（10步）（以前病毒形式整合到宿主细胞DNA中，从而使细胞恶性转化）,P592,cDNA（complementary DNA,cDNA）:利用反转录酶可合成出与任何RNA模板（mRNA，tRNA或rRNA）的碱基序列互补的DNA互补DNA,名词解释半保留复制 半不连续复制 反转录 互补DNA问答题1.原核生物DNA复制所需的酶及因子的作用2.半保留复制的实验证据有哪些？3.DNA损伤修复的方式有哪些？,