分子生物学ppt课件 RNA的生物合成.ppt

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1、4-1 概述4-2 RNA聚合酶4-3 启动子4-4 终止子和终止因子4-5 RNA合成的调控4-6 转录后的加工,第四章 RNA的生物合成,4-1 概 述,在由DNARNA蛋白质的信息流中，RNA是中心环节。,RNA是已知的兼具遗传信息和催化两种功能的大分子。,一、DNA与RNA分子的异同点,（1）RNA核糖2位置有羟基，且以尿嘧啶代替胸腺嘧啶；,（2）大部分RNA分子是单链的，这些RNA往返折叠使RNA具有比DNA更多结构上的多样性，使RNA具有各种不同的生物功能。,二、DNA复制与RNA合成的异同点,相同点：,（1）除了某些病毒RNA基因组外，所有RNA分子都是以DNA为模板（模板使用）

2、。,（2）合成方向也是由53方向（极性）。,（3）合成的化学机制基本相同，根据碱基互补配对。,（4）都有起始、延伸、终止三个阶段。,不同点：,（1）转录不需要引物。,（2）转录一般只涉及一个短的DNA序列片段；,编码链（即非模板链、正链、有意义链），模板链（即负链、无意义链）,（3）转录是由RNA聚合酶催化，与DNA上的特异序列启动子结合并开始转录（复制是由DNA聚合酶开始，从复制起始点开始）。,（4）RNA合成不象DNA有校对机制(Proof reading)。,（5）转录时，DNA双螺旋一段短距离范围解螺旋形成转录泡(Bubble)，RNA在形成后不久被剥离模板。,Coding stran

3、d of DNA has the same sequence as mRNA.,Transcription is catalyzed by RNA polymerase,4-2 RNA聚合酶,一、RNA聚合酶催化反应,RNA聚合酶是转录过程中的关键酶，原核和真核生物的RNA聚合酶虽然都能催化RNA的合成，但在其分子组成、种类和生化特性上各有特色。,激活RNA聚合酶的活性需要DNA，它以双链DNA为模板时活性最强！,Transcription is catalyzed by RNA polymerase,二、原核生物的RNA聚合酶,加上亚基后则成为聚合酶全酶（holoenzyme）相对分子量为4

4、.65 105。,E.coli的RNA聚合酶由五种亚基组成、。,2亚基组成核心酶；,(一)组成：,亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合，催化磷酸二酯键形成。（亚基为碱性蛋白质，与酸性DNA之间可借静电引力相结合；亚基也可借疏水相互作用与DNA结合,它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性）,、：由和亚基组成了聚合酶的催化中心。,亚基：与核心酶的组装及启动子的识别有关，并参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用。,亚基：功能还不清楚。,(二)功能：,它是酶的别构效应物，使酶专一性识别模板上的启动子。,亚基：因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动区DNA序列的亲和力，其作

5、用是负责模板链的选择和转录的起始。,因子可使酶与底物结合常数提高103倍，时间可达数小时，还可以使酶与模板DNA上的非特异性位点的结合常数降低104倍，使酶底物复合无的半衰期小于1s。,E.coli中RNA聚合酶50bp/s（37）；每个E.coli：细胞中约7000个 酶分子；细菌的 m RNA、r RNA、t RNA、由同一种RNA聚合酶所转录。,在某些细菌细胞内含有能识别不同启动子的因子，以适应不同生长发育阶段的要求，调控不同基因转录的起始。,在E.coli中最常见的调控因子是70，而32 是与热休克启动子所控制的基因转录密切相关，54 则参与细胞的N代谢。,Sigma factor i

6、s the subunit of bacterial RNA polymerase needed for initiation;is the major influence on selection of binding sites(promoters).,（三）过程：,三、真核生物的RNA聚合酶,真核生物的基因组远比原核生物大，它们的RNA聚合酶也要复杂。真核生物的RNA聚合酶有三类，相对分子量都在5 105左右，通常有8-14个亚基，并含有Zn2+。,Alpha-amanitin(双环八肽)isolated from Amanita phalloides,（一）分类：,RNA聚合酶：对-鹅

7、膏蕈碱（-amanitine）不敏感；转录45s rRNA前体。,RNA聚合酶：可被低浓度-鹅膏蕈碱（10-9-10-8 mol/L）所抑制；转录所有编码蛋白质的基因和大多数核内小 RNA（snRNA）。,RNA聚合酶：只被高浓度-鹅膏蕈碱（10-5-10-4 mol/L）所抑制；转录小的RNA基因，tRNA、5S rRNA、U6 snRNA、scRNA。,（二）组成：,将提纯的酵母RNA聚合酶进行凝胶电泳可分出10条明显的条带。最大的3个亚基分别相当于细菌RNA聚合酶、的同源物，化学计量测定它们之间的比例为2：1：1，它们担负着RNA聚合酶的基本功能。,*真核生物RNA聚合酶中没有细菌因子的

8、对应物，因此必须借助各种转录因子才能选择和结合到启动子上。,转录过程与细菌不同的是真核生物RNA聚合酶自身不能识别和结合到启动子上，而需要在启动子上由转录因子和RNA聚合酶装配成活性转录复合物才能起始转录。,（三）过程：,真核生物的转录过程分为装配、起始、延伸和终止4个阶段，其间各种因子的作用比细菌的复杂得多。,4-3 启动子（promoter）,一、启动子的基本结构,启动子：是指RNA聚合酶识别，结合和开始转录的一段DNA序列。,转录单元（transcriotion unit）：是一段从启动子开始至终止子（terminator）结束的DNA序列。,转录起点：是指新生RNA链第一个核苷酸相对应

9、的DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。,Promoter is a region of DNA involved in binding of RNA polymerase to initiate transcription.,转录上游（upstream）：常指起点前面5末端的序列；(用-1，-2，-3表示)转录下游（downstream）：常指起点后面3末端的序列；(用+1，+2，+3表示),换句话讲，从转录起点沿RNA聚合酶运动方向称为下游，而反方向为上游，在描述碱基的位置时，一般用数字表示，起点为+1，下游方向依次为+2、+3，上游方向依次为-1、-2、-3,二、原核生物启动子的结构

10、特点,足迹分析法(footprint）,足迹分析法是pribnow 设计的一个实验与DNA测序技术相结合。是确定启动子的序列结构的方法。,所谓足迹法既是将DNA起始转录的限制片段分离出来。加RNA聚合酶使之结合。再用DNA酶部分水解。与酶结合的部位被保护而不水解，其余部位水解成长短不同的片段，经凝胶电泳即可测出酶所结合的部位。,大肠杆菌RNA聚合酶在转录起始阶段缩短覆盖DNA的长度,启动子共有序列的功能,上游区有两个共有序列：,Pribnow区：又称-10区（TATAAT），有助于DNA局部双链解开。,35序列：又称识别区（TTGACA），提供了RNA聚合酶识别信号。,启动子结构是不对称的，它

11、决定了转录的方向。,三、真核生物启动子,（一）分类：,1.RNA聚合酶的启动子：,核心启动子（-45+20）；上游控制元件（UCE，-180-107）,真核生物的启动子由转录因子识别，而不是RNA聚合酶所识别，多种转录因子和RNA聚合酶在起点上形成前起始复合物（preintiation complex）而促进转录。,2.RNA聚合酶的启动子：,5S rRNA 和tRNA以及胞质小RNA（scRNA）基因的启动子位于转录起点下游，即基因内部。,核内小RNA基因启动子在转录起点上游。,3.RNA聚合酶的启动子,class 启动子涉及众多编码蛋白质的基因表达控制。包括以下几类控制元件：,Goldbe

12、rg-Hegness,Inr:位于转录起始点的起始子（initiator,Inr），可用同式Py2ANPy5表示之。,TATA区:位于转录起始点上游-25-30bp处的共有序列TATAAA，也称为TATA区。,CAAT区:起始点上游-70-78bp处另一段共有序列GGCCAATCT，称为CAAT区。,GC区:起始点上游-80-110bp处含有GCCACACCC或GGGCGGG 序列，称为GC区。,增强子:起始点上游-100bp以上处含有72bp长的重复序列，称为增强子（enhancer）。,RNA聚合酶和转录因子在启动子上的装配,4-4 终止子和终止因子,一、基本概念,终止子（terminat

13、or）：模板DNA上存在终止转录的特殊信号,终止因子（termination factor）：协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质），称为终止因子。,通读（readthrough）：有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶得以越过终止子继续转录，称通读。,抗终止因子（antitermination factor）：这种引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。,Terminator is a sequence of DNA,represented at the end of the transcript,that causes RNA polymerase to terminate t

14、ranscription.,二、终止子的种类,所有原核生物的终止子在终止点之前均有一个回文结构，其产生的RNA可形成有茎、环构成的发夹结构。,（一）简单终止子（即不依赖于因子的终止子）,1.终止子上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡结构；,2.在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，所以转录产生的3端为寡聚U，可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。,终止子效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，,随着发卡结构（至少6bp）和寡聚U序列（至少4个U）长度的增加，终止效率逐步提高。,（二）依赖于因子的终止子,依赖于因子的终止子必需在因子存在时才发生终止

15、作用。,1.依赖于因子的终止子其回文结构中不富含GC区；,2.回文结构之后也无寡聚U序列.,依赖于因子的终止子在细菌染色体中少见，而在噬菌体中广泛存在。,三、终止因子,1因子：,它通过催化NTP的水解使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。,2.NusA蛋白,NusA蛋白是一种可以与RNA聚合酶结合的识别终止子的特殊辅助因子。（nus位点包括NusA NusB NusG等）,NusA因子可以提高终止效率，可能是由于它能促进RNA聚合酶在终止位置上的停顿。,NusA蛋白可以与RNA聚合酶的核心酶结合，形成2NusA复合物。,转录终止后，RNA聚合酶脱离模板，NusA又被因子所取代

16、。,四、抗终止,抗终止作用主要见于某些噬菌体的时序控制。,前早期基因,N 蛋白,晚早期基因,Q 蛋白,晚期基因表达,由于不同生理要求，在转录过程中有时即使遇到终止信号，仍然需要继续转录，即为抗终止作用。,（一）抗终止过程（通读）,（二）抗终止作用主要有两种方式：,1.破坏终止位点RNA的茎环结构,例如某些控制氨基酸的操纵子基因的转录受氨基酸浓度的高低控制。当浓度低时，破坏终止位点RNA的茎环结构，抗终止；当浓度正常时，mRNA形成正常的二级结构，其中包括末端的茎环结构，RNA正常转录。,2.依赖于蛋白质因子的抗终止作用,例如噬菌体中由N基因编码产生的N蛋白具有抗转录终止的作用。其功能的发挥依赖

17、于寄主所产生的NusA、NusB、S10等几种蛋白质。,NusA因子由N蛋白的研究而得名，其为酸性多肽，可以与N蛋白结合，也可与RNA聚合酶结合，改变其构象，使之对终止子不敏感。,可见NusA对RNA聚合酶的转录速度和终止都有肯定的作用，说明它在调解因子之间起中介作用。,五、真核生物的转录终止信号,RNA聚合酶的转录产物是在3末端切断，然后腺苷酸化，并无明显的终止作用。,RNA聚合酶、，转录末端有一段连续的U，但不足以成为终止信号。很可能是与U前后的富含G、C序列及polyT是真核生物RNA聚合酶的转录终止信号。,4-5 转录后的加工,一、原核生物中RNA转录后的加工,（post-transc

18、riptional processing）,在原核生物中，rRNA、tRNA（部分）组成混合操纵子，某些tRNA簇与编码蛋白质的基因组成操纵子它们形成的多顺反子转录物，经断裂形成rRNA和tRNA的前体，然后进一步加工成熟。,（一）原核生物中rRNA转录后的加工,RNase III,RNaseE,RNase III是一种负责RNA加工的核酸内切酶，它的识别部位RNA为特定的RNA双螺旋区，切割产生16S rRNA、23S rRNA前体。,5S rRNA在RNaseE作用下产生,原核生物rRNA含有多个甲基修饰成分，包括甲基碱基和甲基核糖,两端的多余附加序列需要进一步由核苷酸酶切除。,（二）原核

19、生物中tRNA转录后的加工,1.由核酸内切酶在tRNA两端切断：RNase P切5端，RNase F切3端。,（二）原核生物中tRNA转录后的加工,2.由核酸外切酶进一步进行修剪，从前体3端逐个切附加序列，直到tRNA 3 端。,3.在tRNA 3 端加上CCA-OH，此反应是由tRNA核苷酰转移酶催化进行，由CTP和ATP提供胞苷酸和腺苷酸。,4.核苷酸的修饰及异构化，包括甲基化和假尿嘧啶核苷。,tRNA+S-腺苷蛋氨酸（SAM）甲基-tRNA+S-腺苷高半光氨酸,RNase P是一种很特殊的酶，含有蛋白质和RNA两部分，在某些条件下，RNase P中的RNA（M1RNA）单独也能切断tRN

20、A前体的5端序列。,二 真核生物中RNA转录后的加工,hnRNA链长约是mRNA的45倍。),含有内含子序列的最初转录物，即mRNA前体，在核内加工过程中形成分子大小不等的中间物，被称为核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA）,(一)hnRNA的加工,1.hnRNA,对哺乳动物来说大约有25%的hnRNA经加工转变成mRNA。,.hnRNA的加工过程,（1）5端形成特殊的帽子结构（m7G5pppNmpNp_）,（2）3端的产生和多聚腺苷酸化,（3）mRNA的内部甲基化,（4）通过拼接出去内含子转录序列,（1）5端形成特殊的帽子结构（m7G5pppNmp

21、Np_）,pppN1pN2pRNA,ppN1pN2pRNA,+pi,ppN1pN2pRNA,+ppi,G5pppN1pN2pRNA,+GTP,G5pppN1pN2pRNA,+SAM,m7G5pppN1pN2pRNA,+S-腺苷高半光氨酸,m7G5pppN1pN2pRNA,+SAM,m7G5pppNmpN2p-RNA,+S-腺苷高半光氨酸,（2）3端的产生和多聚腺苷酸化,高等真核生物细胞和病毒mRNA在靠近3端都有一段保守序列AAUAAA，这一段序列为链的切断和多聚腺苷酸化提供了某种信号。,PolyA由多聚腺苷酸聚合酶所催化。,RNA为受体，ATP为供体，需要Mg2+或Mn2+及蛋白质参与作用。

22、,PolyA尾巴可能起到缓冲作用，防止核酸外切酶对hnRNA信息序列的降解作用。,（3）mRNA的内部甲基化,主要m6A（N6-甲基腺嘌呤），它可能对mRNA前体的加工起识别作用。,（4）通过拼接出去内含子转录序列,大多数真核基因为断裂基因，其转录产物需要拼接，去内含子序列，使编码区成为连续序列。,三、RNA的拼接（splicing）,（一）RNA拼接的4种方式（分子内）,类型I的自我拼接（group I self-splicing）,类型II的自我拼接（group II self-splicing）,hnRNA的拼接,tRNA的拼接,1.类型I的自我拼接（group I self-splic

23、ing）,1981年，Cech在研究四膜虫rRNA前体拼接过程中发现的。它可以自我催化完成。,此拼接只需1+、2+阳离子以及鸟苷酸（或鸟苷）存在即可自发进行，无需能量及蛋白酶的催化，实际是磷酸酯的转移反应。,类型I的自我拼接的内含子分布广泛，出现在线粒体、叶绿体编码的rRNA、tRNA、mRNA的基因中；低等真核生物的rRNA基因。,.类型II的自我拼接（group II self-splicing）,类型II内含子本身也具有催化功能，能够自我完成拼接。,经过两次转酯，内含子成为套索（lariat）结构被切除，两个外显子可以连接在一起。,转酯反应无需游离的鸟苷酸发动，而是由内含子靠3末端的腺苷

24、酸2-OH攻击5端磷酸基引发的。,类型II内含子只见于某些真菌线粒体和植物叶绿体中。,核mRNA的（hnRNA）拼接体的拼接（nuclear mRNA spliceosomal）,真核生物的mRNA初始转录物中发现的第三类内含子也是最大的一类的内含子。通过同样的套索机制进行剪接，剪接需要特殊的RNA-蛋白质复合物的作用。,GT-AG规则：这类内含子的左端（5端）均为GT，右端（3端）均为AG（对应于RNA为GU-AG）,拼接体（spliceosome）：在被拼接的RNA上，由上述5种U系列snRNA（U1、U2、U4、U5、U6）和约50种蛋白质所组成的复合物（5060S），呈有突起的椭球体。

25、,核内tRNA前体的酶促拼接,酵母tRNA前体的拼接需要ATP和一个内切核酸酶。,反应分为两步进行：,（1）由一个特殊的核酸内切酶断裂磷酸二酯键，切除插入序列，反应不需要ATP。,（2）由RNA连接酶催化使切开的tRNA两部分共价连接。反应需要ATP（植物、酵母类）。,生物体存在分子间的拼接，即反式拼接。,（二）反式拼接与选择拼接（trans-splicing and alternative-splicing）,1.反式拼接（trans-splicing）,如果一个分子具有5拼接点，另一个分子具有3拼接点，它们又靠得很近，就可以发生反式拼接（如锥虫的众多mRNA）。,一个基因的转录物在不同的发

26、育阶段，分化细胞和生理状态下，通过不同的拼接方式，可以得到不同的mRNA和翻译产物，称为选择性拼接。所产生的多种蛋白质即为同源体（isoform）。,2.选择拼接（alternative splicing）,现以降钙素的mRNA前体为例，说明选择拼接的机制。,（三）RNA拼接的生物学意义,1.RNA拼接是生物机体的进化历史形成的，是进化的结果。,3.从内含子的拼接方式和分布可以大致推测其起源时间。,2.RNA拼接是基因表达调控的重要环节。,4.拼接促进有益重组，对生物机体进化十分重要。,5.内含子和外显子是相对的，有些内含子可以编码序列，能够产生蛋白质或功能RNA，不能将内含子看成是无用序列，

27、因此，拼接过程是必要的。,四、RNA的编辑（RNA editing）,是mRNA的一种加工方式，它导致了DNA所编码的遗传信息的改变，这种改变mRNA编码序列的方式，叫RNA的编辑。,经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。,（一）定义,mRNA的顺序 GAU UGU AUA*,锥虫线粒体细胞色素氧化酶亚基II（coII）基因：与酵母或人的相应基因对比在一个-1的移码突变，然而酶的功能又是正常的。,DNA正链的顺序 GA G A A,对应的蛋白质序列 Asp Cys Ile,Benne等人的工作之后，又有一些试验陆续在多种生物中发现RNA的编辑，其中包括U的插入和删除，C、A和G的

28、插入，C被U取代或U被C取代，A转变为I等方式。,Apo B100（肝中）Apo B48（小肠中）（Mr 512000）（Mr 241000）,CAA,即Gln,哺乳动物的载脂蛋白B（Apolipoprotein B Apo B）,是同一基因产物,UAA,UAA（终止子）,编辑作用是沿着编辑前的mRNA35方向进行，RNA编辑所需的遗传信息来自于指导RNA（guide RNA,gRNA），或者来自被编辑RNA自身。,（二）插入U的机制,首先，从锥虫线粒体mRNA编辑和其他的例子可以看出，RNA编辑可以消除移码突变的危害。,（三）RNA编辑的生物学意义：,RNA编辑还和生物发育与分化有关，是基因

29、调控的一种重要方式。,.RNA编辑增加了基因产物的多样性，由同一基因转录物经编辑可以表达出多种同源体蛋白质。,4.RNA编辑还可以使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物进化。,RNA编辑还可能与学习和记忆有关。,五、RNA的再编码(recoding),定义：编码在mRNA上的遗传信息在某种情况下可以用不同的方式译码，即改变了原来编码的含义，称再编码。,校正tRNA:通常是一种变异的tRNA，它们或是反密码子环碱基发生改变，或是决定tRNA特异性即个性的碱基发生改变，从而改变了译码规则，故而使错误的译码信息受到矫正。,六、RNA生物功能的多样性,1RNA在遗传信息的翻译中起着决定性的作用（三种RNA）;,2.RNA具有重要的催化功能和其他持家功能；,3RNA转录后加工和修饰依赖于各类小RNA 和其他蛋白质复合物；,4RNA对基因表达和细胞功能具有重要的调节作用；,5RNA在生物进化中起重要的作用。,