北医本科ppt课件《生物化学》第12章 dna的生物合成-zwg.ppt

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1、Chapter12,DNA Biosynthesis DNA生物合成朱卫国北京大学基础医学院生物化学与分子生物学系,复制叉,解链酶,Principal Points,(1)DNA Replication,(2)Reverse Transcription,(3)DNA Damage and Repair,遗传信息 DNA是遗传的主要物质 遗传信息：DNA分子中碱基的排列顺序 四种核苷酸：A、G、C、T,基因：DNA分子中的功能片段,Genethe fundamental unit of information in living system is the gene.A gene is defi

2、ned biochemicallyas a segment of DNA that encodes the information required to produce a functional biological products.,What is DNA replication?One strand is the complement of the others.The parent DNA as a template produce another paired strand.,遗传信息的传递,DNA,复制,RNA,转录,蛋白质,翻译,中心法则,Replication,Transcr

3、iption,Translation,Reverse Transcription,DNA的复制（以亲代DNA为模板合成子代DNA的过程）转录（以DNA为模板合成RNA的过程）逆转录（以RNA为模板合成DNA的过程）RNA的复制（以RNA为模板合成RNA的过程）翻译（以mRNA为模板合成蛋白质的过程）,几个概念的定义,人体体细胞23对染色体各有一半来自于父母,核酸DNA、RNA 提问：二者区别？碱基（A、G、C、TA、G、C、U）戊糖（脱氧核糖核糖）,DNA合成复制,体细胞染色体有丝分裂,前 期,DNA的生物合成,DNA的复制以DNA作为模板指导的DNA合成DNA的损伤与修复逆转录以RNA为模扳

4、指导DNA的合成,生物体内DNA的合成包括三个方面,复制方式半保留复制 两个子代DNA分子中有一条链来自亲代，另一条为新合成的链，这种复制方式叫半保留复制。保证了遗传性状的稳定性。,第一节 DNA的复制,DNA的复制的特点：半保留半不连续双向复制,1,2,保留了一半父代DNA成份,半保留复制,Matthew Meselson Franklin Stahl,Semi-Conservation DNA Replication,1957年,1957年 M.Meselson 和F.W.Stahl用大 肠杆菌为材料，在含15N和14N的NH4Cl中培养证实了半保留复制方式。,Replication be

5、gins at an origin and usually proceeds bidirectionally,DNA复制有其复制起始点并向两个方向进行,Visualization of bidirectional DNA replicationLabeling with tritium shows that both strands are replicated atthe same time(red and blue lines)(John Cairns),However,there are many origins in eukaryotic cells when DNA replicat

6、es.,5,3,3,5,O,O,O,O,O,replicon,The distance between two origin start site is called a replicon,复制叉（Replication Fork),DNA复制的半不连续复制,5,3,5,3,双螺旋的两条链是反向平行的。两条链都能作为膜板合成新的互补链。,误区：合成的方向一条是5-3另一条是3-5,DNA polymerase 的方向性DNA复制的半不连续性,DNA复制的过程,Process of DNA Replication,参与复制的酶类,DNA聚合酶引物酶DNA连接酶参与DNA解旋、解链的酶及因子,DN

7、A聚合酶,n1 dATP dAMPn2 dGTP+DNA DNA聚合酶 DNA-dGMP+2(n1+n2)PPin1 dTTP Mg2+dTMPn2 dCTP dCMP,模板,复制产物,dNTP,作用：以亲代DNA的一条链为模板，催化四种dNTP与模板碱基互补配对，合成新的DNA链。,特点：1.不能从头合成，必须有短核苷酸链做为引物。2.合成有方向,5端-3端（指新合成的链的方向）。3.种类多：原核生物：DNA聚合酶、；真核生物：DNA聚合酶、。,引物酶：催化RNA引物合成的酶。以复制起始部位的DNA链为模板，按照碱基互补配对的原则合成引物RNA。是一种特殊的RNA聚合酶。DNA连接酶：将一个

8、DNA片段上的3-OH与相邻片段5-p末端连接生成磷酸二酯键。参与DNA解旋、解链的酶及因子：松弛超螺旋结构（拓扑异构酶）；打开双链（解链酶）；使模板维持单链状态（DNA结合蛋白）,DNA复制的过程,1 复制的起始和引物RNA的合成（DNA合成的准备阶段）2 DNA片段的合成和延长3 RNA引物的水解4 完整DNA分子的形成,Initiating,Elogation and Termination,1 复制的起始和引物RNA的合成（DNA合成的准备阶段）,1）复制的起始点：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此 部位称复制起始点。原核细胞（1个），真核细胞（多个）,拓扑异构酶：松弛超螺旋，

9、以利复制叉的行进及DNA合成，合成后再引向超螺旋。解链酶：解开DNA双链，形成复制叉。单链结合蛋白（SSB）：结合于DNA单链模板，稳定DNA模板的作用。（又DNA结合蛋白，DBP）引物酶：以一小段DNA为模板，合成RNA引物。,2）参与这一阶段的酶：,复制开始,超螺旋DNA,拓扑酶,松弛,解链酶,解开双链,SSB,合成前准备：构象变化与解链,DNA解旋、解链，复制叉形成模式图,1.拓扑酶解开超螺旋。,拓扑酶,拓朴异构酶 Topoisomerase,拓朴现象指物体作弹性移动而又保持物体不变的性质。,拓朴异构酶I,拓朴异构酶II,使DNA超螺旋结构变为松散,DNA topoisomerase I

10、,DNA超螺旋结构,DNA松散结构,Topo I,Topoisomerase II(gyrase),Topo II,DNA 解链酶和Rep protein,单链结合蛋白,其它酶类,起点,解链酶解开双链,复制叉：亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动。,（1）解链酶在起点双向打开螺旋（拓扑异构酶作用后）,解链酶,3.DNA结合蛋白与单链结合并向前移动,DNA结合蛋白,提问：DNA结合蛋白的作用？,A,T,G,C,防止单链复合，防止新合成的DNA被降解,起点,A,T,C,C,A,T,T,小段RNA引物,RNA聚合酶,4.RNA聚合酶催化起点处通过碱基互补连接引物RNA链。,作用确定起始部位，引导复制

11、开始。,AU GC,（2）引物的合成,复制过程需要引物，由引物酶催化合成短链RNA分子,燃料是dNTP,方向是5-3,2 DNA链的合成和延长,1）模板 亲代DNA的两条链均可作为模板。2）原料 四种脱氧核糖核苷酸dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）。3）合成方向（复制叉的方向）：5 3。4）合成特点：半不连续合成,DNA合成和延长的酶类,DNA dependent ploymerases:DNA聚合酶I,II,III(原核生物）DNA聚合酶，和（真核生物）,DNA聚合酶I：由两个亚基组成：大亚基和小亚基聚合作用（大亚基Klenow Fragment)外切酶活性（大亚基）外切酶活

12、性（小亚基）,DNA聚合酶I反应较慢，因此其主要功能是切除引物，填补冈崎片段间的空隙以及损伤，而非合成,Proofreading-Pol I has two functions,In which it hydrlyzes mismatched base andRecruits a newly correct base on the strand.,Pol Is proofreading function,DNA-pol I is not the primary enzyme of replication,instead itperforms a host of clean-up functio

13、ns during replication,recombination and repair.,Large(Klenow fragment)fragment of DNA polymerase I.It remains the polymerizationand proofreading activities of the enzyme.The active site for addition of nucleotide is deep in the crevice at the far end of the bound DNA.The dark blue is the template.,D

14、NA聚合酶II,聚合作用外切酶活性通常是一种补充作用（当DNA聚合酶I，III无活性时）,DNA聚合酶III,原核生物DNA合成的主要酶。具有聚合作用，编辑和校对功能,聚合作用：对前导链及随从链均有聚合作用自引物的3-OH-沿5-3方向加入脱氧核苷酸并延长DNA链。,DNA聚合酶III,新链53延长（复制DNA）,引物3连接dXTP,随从链是由连接酶催化下将各个随从链DNA片段连接起来形成一条完整的DNA链,起点,？,？,父代DNA两链方向相反,必然无法连续复制,均以53方向形成前导链和滞后链,由冈崎片段连接成的新DNA链称滞后链。,与复制叉移动方向相同，可以一直复制到底的新DNA链称前导链。

15、,冈崎片段：不连续合成的小片段称为。原核细胞1000-2000 nt 真核细胞100-200 nt,前导链连续复制,滞后链不连续复制,DNA复制为53半不连续复制。,3 RNA引物的水解,1）DNA片段合成至一定长度后，链中的RNA引物即被核酸酶水解而切断。2）出现的缺口由DNA片段的继续延长而填补。,4 完整DNA分子的形成,1）随从链中相邻的两个DNA片段由连接酶连接，形成大分子DNA链，再与模板链形成 双螺旋DNA分子。2）连续合成的前导链也与相应的模板形成双螺旋结构。3）DNA复制后 DNA超螺旋装配成染色体,5,3,5,切除引物，补缺。,DNA聚合酶35核酸外切,连接酶连接缺口,切除

16、引物、切除配错dXTP,新链,4.DNA复制的终止,原核生物终止点-ter,一般速度相同，如有不同先到达的会在终止点等另外的复制结束，不会越界复制。,半保留复制结果半不连续复制过程,1 复制速度：是原核的1/10，但复制起始点多（replicon)。2 引物和冈崎片段小于原核，引物为10个核苷酸，冈崎片段100200 nt；原核引物十几几十个核苷酸，冈崎片段10002000 nt。引物切除的酶不同（真核：RNaseH1,Fen1,原核：Pol I）。3 复制需DNA聚合酶及多种因子参加，特性与大肠杆菌相似，共五种：DNA pol、在核内起主要作用 DNA pol 为线粒体复制酶。4 DNA复制

17、位于细胞周期的S期。,（二）真核生物复制的特点,Polymerases in eukaryotic cells,DNA-pol,MW(kDa)16.5 4 14 12.5 25.55-3 activity middle unknown high high high3-5 activity none none has has hasFunctions initiating proofread rep of mtDNA elongation repair,真核生物聚合酶,Telomerase 端粒酶,真核生物DNA合成时,随从链合成的片段去除引物后，由DNA Polymearse填补空隙，但最后的

18、DNA片段去除引物后末端空隙无法填充，这样DNA每合成一次，末端短一截。但是，端粒酶起确保完整性的DNA复制作用。但是，端区每复制一次其长度就短小一截，所以与衰老有一定关系。,Telomere 端区,线状DNA,四 DNA复制与细胞周期,细胞分裂周期：G1、S、G2、M期 G1期：DNA复制前期（为DNA复制做准备）S期：DNA合成期（DNA复制）G2期：细胞分裂前期（为细胞分裂做准备）M期：细胞分裂期G1期最长，M期最短；G0期：不处于分裂周期的细胞细胞核中DNA复制是细胞进行有丝分裂的前提。抗核苷酸代谢药物治疗肿瘤机理：抑制DNA复制，抑制肿瘤细胞分裂，达到治疗肿瘤的目的。,DNA的复制D

19、NA的损伤与修复逆转录,DNA的生物合成,损伤结构破坏、功能破坏提问：哪些因素会引起DNA损伤？基因突变是进化的的基础自发突变：1/10(polymorphism)环境污染物物理因素（紫外线、（电离、核）辐射）、化学诱变剂、病毒杂合等。,后果癌症、畸形、遗传病等等,第二节 DNA的损伤和修复,如经DNA修复后有缺陷，DNA就会发生突变发展成癌细胞,突变类型：点突变；缺失、插入和框移突变；重排；DNA多核苷酸链的断裂或交联。,突变意义：进化的分子基础；某些疾病发病的基础；致死性突变；人工诱变DNA，改造物种性状。,点突变(单个碱基的改变而DNA其他结构不改变）,2.缺失和插入 框移突变,G C

20、A G U A C A U G U C 丙 缬 组 缬 CG A G U A C A U G U C.谷 酪 蛋 丝,丢失或插入一个或几个核苷酸，使下游DNA的编码发生改变。,3.重排,缺失,复制,倒位,重排,4 DNA多核苷酸链的断裂或交联(二聚体形成）,DNA聚合酶的校对作用：修复类型：光修复、切除修复、重组修复、SOS修复等。修复的意义：生物体长期进化过程中获得的一种保护功能。保证了DNA复制的高度精确性。,DNA的修复,修复机制,1.光复活,T T,紫外线(260nm),T(胸腺嘧啶）二聚体,双键打开,未见人类有此酶,T-T二聚体,只有高等哺乳动物该功能退化掉了。例 对细菌紫外诱变或杀

21、灭时尽量保持暗环境。,光复活酶结合于损伤部位,2.切除修复,核酸酶,属于复制前的修复。,BER,base excision repair(碱基切除修复）NER,nucleotide excision repair（核苷切除修复）,3.重组修复,复制同时的修复,*,DNA聚合酶、连接酶补缺,提问：原损伤部位没有修复，对后代影响大吗？,在后代中只有一个个体含有该条DNA，后代越多，影响比例越小，等于消除影响。,损伤较大时，来不及修复就进行复制,4.SOS修复,SOS求救信号DNA损伤严重，复制受到抑制，前几种方法难以奏效时：,诱导校对能力差的DNA聚合酶形成，局部“乱配”,进化、变种、癌症、诱变育

22、种等等都是基于这一机理。,为了生存变。,分子受到严重损害，正常修复机制均被抑制,真核生物DNA损伤修复缺陷疾病,与DNA修复缺陷有关的疾病,大肠杆菌DNA聚合酶（3种）,3 5外切酶活性，去除错误碱基的校对作用。,53外切酶活性，去除RNA引物及修正错误碱基。,DNA Pol I 肽链上具有三个酶活性区,（1）pol：53的聚合作用，合成20个核苷酸即离开模板，填充空隙。,Pol I Pol II Pol III酶活性 5 3聚合作用+3 5外切酶活性+5 3外切酶活性+-+构成（亚基数）单体 单体 多亚基分子大小（x 103）109 90 900体外链延长速度（核苷酸/分）600 30 90

23、00分子数/细胞 400 10-20功能 修复合成 不详 复制 切除引物 填补空缺,大肠杆菌中DNA聚合酶,DNA的复制DNA的损伤与修复逆转录,DNA的生物合成,定义：以RNA为模板在反转录酶催化下，由dNTP聚合成DNA的作用。逆转录酶：以RNA为模板催化DNA合成的酶称，或反转录酶。又称RNA指导的DNA聚合酶（RNA directed DNA polymerase,RDDP）。,第三节 逆转录（RNA指导的DNA合成）,1970年，Termin and Baltomore发现以单链RNA为模版合成DNA的酶-反转录酶。1975年获Nobel Prize.,DNA-RNA杂交体,RNA水

24、解后，以DNA为模版再合成DNA双链。,DNA,RNA,RNA,DNA,某些病毒的生存方式。如 HIV病毒、致癌病毒,胞膜蛋白,双分子层,衣壳蛋白,RNA(病毒基因）,破坏免疫识别机制，引起免疫系统失效！,辅助T细胞-给病原体加识别标记的血液细胞,逆转录病毒DNA单链,单链病毒DNA复制互补链,异源重组,病毒RNA转录,免疫系统的敌我识别机制失效！,切割形成病毒蛋白,组合成新病毒并攻击下一个目标,指导形成病毒蛋白原链,治疗原理（鸡尾酒疗法）,阻止逆转录DNA阻止病毒蛋白原切割,简述中心法则内容简述参与DNA复制的酶和蛋白质因子，以及其在复制中的作用。比较真核和原核生物DNA复制异同点。何为逆转录？讨论RNA病毒致癌的分子过程。,思考题,