医学生化第10章DNA的生物合成课件.ppt

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1、第三篇,基因信息的传递生化与分子生物学系蔡文秀,分子生物学的发展阶段,时间：从20世纪50年代开始主要特点：研究生物大分子的结构与功能。生物化学在这一阶段的发展，以及物理学、技术科学、微生物学、遗传学、细胞学等其他学科的渗透，产生了分子生物学，并成为生物化学的主体。分子生物学:是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘的一门重要的学科。,生命科学与诺贝尔奖,1910年：克赛尔：蛋白质、细胞及细胞核化学的研究分离出腺嘌呤，胸腺嘧啶、胸腺核苷酸和组氨酸。1959年：奥乔亚：发现细菌的RNA聚合酶，成功合成RNA，研究

2、并重建了将基因内的遗传信息通过翻译成蛋白质的过程；科恩伯格：发现了分子在细菌细胞及试管内的复制。1962年：沃森和克里克：双螺旋。1965年：雅各布和莫诺：操纵子学说；m分子。1969年：尼伦伯格：破译遗传密码；霍利：酵母丙氨酸的排列顺序，所有具备结构上的相似性；科拉纳：第一个合成了核酸分子，并且人工复制了酵母基因。1975年：苔民和巴尔的摩：逆转录酶。,1980年：桑格：序列的测定方法。1984年：科拉乌、梅尔斯坦和乔恩：单克隆抗体技术。1988年：麦克林托克：可移动的遗传因子。1989年，艾尔麦恩和克：核酶；毕肖和华默斯：原癌基因1993年：罗伯特和夏普：断裂基因；缪里斯：扩增仪；史密斯：

3、基因定点突变。1994年：吉尔曼和罗特皮尔：蛋白在细胞内信息传导中的作用1997年：普鲁西内尔：疯牛病的朊病毒。1999年：布洛贝尔：控制蛋白质在细胞内定位与传输的信号。,2000年：卡尔松、格林加德、坎德尔：脑细胞间的信号传递。2001年：哈特维尔、纳斯、亨特：细胞分裂的调控机制。2002年：布雷内、苏尔斯顿、霍维茨：基因调节在器官发育与细胞凋亡中的作用。2006年：费里和米洛：RNA干扰现象。2007年：卡佩奇、史密斯和伊文思：胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组年:伊丽莎白布莱克本、卡萝尔格雷德和杰克绍斯塔克:端粒和端粒酶是如何保护染色体,第10章,DNA的生物合成DNA Biosynthes

4、is(Replication),教学目的与要求,掌握：复制的基本规律；DNA复制的酶 学和拓扑学变化；原核生物的 DNA生物合成过程；逆转录酶和 逆转录过程。熟悉：真核生物的DNA生物合成过程；DNA损伤（突变）与修复。了解：逆转录研究的意义；滚环复制和D 环复制；,复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,本章主要内容：,复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化 复制的过程 逆转录和其他复制方式 DNA损伤（突变）与修复,复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication,第 一 节,（一）半保留复制(semi-c

5、onservative replication)（二）双向复制(bidirectional replication)（三）半不连续复制(semi-discontinuous replication)（四）高保真复制（high fidelity replication）,复制的基本规律,一、半保留复制是DNA复制的基本特征,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的

6、概念:,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,子链继承母链遗传信息的几种可能方式:,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验:,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部

7、遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义:,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,二、DNA复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,三、DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制,领头链(leadi

8、ng strand),随从链(lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leading strand)。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链(lagging strand)。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,四、复制的高保真性,DNA复制的精确度极高，误差率很低，以保证物种在维持遗传保守性的同时，还要通过变异不断进化。DNA复制的高度忠实性至少要依赖三种机制：1、遵守严格的碱基配对规律；2、DNA聚

9、合酶在复制延长中对碱基的选择功能；3、复制出错时，DNA聚合酶的即时校读功能。,复制的保真性和碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,DNA聚合酶的即时校读功能,DNA复制的酶学和拓扑学变化,第 二 节,The Enzymology and Topology of DNA Replication,参与DNA复制的物质:,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-po

10、l；模板(template):解开成单链的DNA母链；引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。,一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,聚合反应的特点:,DNA 新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5 3方向进行。,二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,活性：,1.53 的聚合活性2.核酸外切酶活性,3 5外切酶活性:,5 3外切酶活性:,?,能切除突变的 DNA片段。,

11、能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性:,（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型,DNA-pol DNA-pol DNA-pol,原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol（109kD）,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol I在活细胞内的功能,1）53聚合酶的活性：对复制和修复中出现的空隙进行填补。2）35外切酶活性：对复制中错误进行即时校读，保证复制的准确性。3）53外切酶活性：可

12、去除RNA引物和突变碱基。,DNA-pol（120kD）,53 聚合酶活性35外切酶活性DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。,DNA pol-,由10种亚基（）组成不对称异源二聚体。核心酶（）亚基：53 聚合酶活性 亚基：3 5外切酶活性和碱基选择功 能，是复制保真性所必需亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动复合物：促进全酶组装至模板及增强核心 酶活性,DNA-pol(250kD),DNA-pol 在活细胞内的功能,53聚合酶的活性：是在复制延长中真正

13、催化新链核苷酸聚合的酶。35外切酶活性：对复制中错误进行即时校读，保证复制的准确性。,E.Coli中的DNA聚合酶,（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,真核生物的DNA聚合酶,三、复制中的分子解链伴有DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,E.Coli

14、基因图,解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物的酶。单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链,复制过程正超螺旋的形成：,解链过程中正超螺旋的形成,既能水解、又能连接磷酸二酯键。,拓扑异构酶 拓扑异构酶,拓扑异构酶分类：,拓扑异构酶作用特点：,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛

15、状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制：,拓扑酶的作用方式：,四、DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶的作用：,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,功能：

16、,DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较,DNA生物合成过程The Process of DNA Replication,第 三 节,（一）复制起始：DNA解链形成引发体,需要解决两个问题：,1.DNA解开成单链，提供模板。,2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,E.coli复制起始点 oriC,1.DNA解链：主要由DnaA、B、C三种蛋白共同参与,DnaB、DnaC,DnaG（引物酶）,DnaA蛋白复合物,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2.引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC

17、蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶（DnaG蛋白）催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成：,领头链的子链沿着53方向可以连续地延长。,随从链的合成,复制过程简图,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口,随从链上不连续性片段的连接：,哺乳动物的细胞

18、周期,DNA合成(synthesis)期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)。,（一）真核生物复制的起始与原核基本相似,增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）,PCNA在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，即形

19、成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。,DNA-pol 和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通过PCNA的协同作用，逐步取代pol，在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol 催化合成。然后由PCNA协同，pol 置换pol，继续合成DNA子链。,（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,真核生物复制叉的延长：,染色体DNA呈线状，复制在末端

20、停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,端粒(telomere),指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。,端粒的功能：,维持染色体的稳定性维持DNA复制的完整性,端粒的结构特点：,由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。,TTTTGGGGTTTTGGGG,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human

21、telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),组成：,端粒酶结构示意图,蛋白质（绿色）与RNA（浅褐色）及DNA（紫色）联合在一起,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,端粒和端粒酶的生物学意义,端粒特别是端粒酶的活性与细胞的生长、繁殖、衰老凋亡以及肿瘤的发生密切相关。端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而逐渐变短至消失，可导致染色体稳定性下降，导致细胞衰老凋亡。体细胞几乎没有端粒酶活性，随多次细胞分裂端粒逐渐缩短，细胞失去增殖能力。而端粒酶活性较高的胚原细

22、胞，端粒长度未缩短。肿瘤细胞端粒酶重新获得活性，以维持端粒结构致使染色体稳定而成为永生细胞。肿瘤细胞的端粒比正常人同类细胞显著缩短。,卡萝尔格雷德,伊丽莎白布莱克,杰克绍斯塔克,年诺贝尔生理学或医学奖由3位美国科学家获得，他们发现了端粒和端粒酶是如何保护染色体。,逆转录Reverse Transcription,第四节,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),逆转录酶,一、逆转录病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录,RNA,DNA,（一）逆转录,在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。此过程与核酸合成与转录DN

23、ARNA过程遗传信息的流动方向相反RNADNA，故称为 逆转录（reverse transcription)。,（二）逆转录酶,能催化以单链RNA为模板合成双链DNA的反应的酶称为 逆转录酶（reverse transcriptase)。有三种酶的活性：RNA指导的DNA聚合酶，DNA指导的DNA聚合酶和RNase H活性。RNase H活性是指除去杂合分子中的RNA。它可以从53和35两个方向水解DNARNA。逆转录酶和其他DNA聚合酶一样，合成DNA的方向为53，并且不能从头合成DNA，也需要引物，是病毒本身的一种tRNA。,（三）逆转录过程,1以单链RNA的基因组为模板，在逆转录酶(RN

24、A指导的DNA聚合酶)的催化下，合成一条单链DNA；2产物与模板生成RNADNA杂化双链，杂化双链中的RNA被逆转录酶(RNase H)水解；3以新合成的单链DNA为模板，逆转录酶(DNA指导的DNA聚合酶)催化合成第二链的DNA。,逆转录病毒细胞内的逆转录现象:,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA:,cDNA complementary DNA,（一）逆转录合成双链DNA（二）整合和原病毒的形成（三）转录（四）翻译和包装,逆转录病毒的生活周期,外膜,

25、衣壳,RNA,RNA病毒形态结构示意图,逆转录酶,进入细胞并失去外膜,RNA,进入细胞并失去外膜,逆转录酶,RNA,DNA,RNA,进入细胞并失去外膜,RNA,DNA,RNA,DNA,DNA,进入细胞并失去外膜,逆转录合成DNA,RNA,DNA,RNA,DNA,DNA,进入细胞并失去外膜,DNA拷贝整合进入宿主染色体,整合酶,逆转录合成DNA,RNA,DNA,RNA,DNA,DNA,进入细胞并失去外膜,DNA拷贝整合进入宿主染色体,整合酶,细胞染色体 DNA,LTR,gag,pol,env,LTR,逆转录合成DNA,RNA,DNA,RNA,DNA,DNA,进入细胞并失去外膜,DNA拷贝整合进入

26、宿主染色体,整合酶,细胞染色体 DNA,LTR,gag,pol,LTR,逆转录合成DNA,原病毒DNA,env,RNA,DNA,RNA,DNA,DNA,转录,RNA拷贝,进入细胞并失去外膜,DNA拷贝整合进入宿主染色体,整合酶,逆转录合成DNA,RNA,DNA,RNA,DNA,DNA,RNA拷贝,翻译,衣壳蛋白+外膜蛋白+逆转录酶,组装出新的逆转录病毒颗粒,进入细胞并失去外膜,转录,DNA拷贝整合进入宿主染色体,整合酶,逆转录合成DNA,二、逆转录的发现发展了中心法则,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆

27、转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,DNA损伤（突变）与修复DNA Damage(Mutation)&Repair,第五节,DNA突变具体指个别dNMP残基以至片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为DNA损伤(DNA damage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,一、突变在生物界普遍存在,（一）突变是进化、分化的分子基础,从长远的生物史看，进化过程是突变的不断发生所造成的。大量的突变都是属于这种类型，只是目前还未能认识其发生的真正原因，因而名为自发突变或自然突变(spontaneous mutation)。,（二）只有基因型改变的突变形成D

28、NA的多态性,这种突变没有可察觉的表型改变，例如在简并密码子上第三位碱基的改变，蛋白质非功能区段上编码序列的改变等。这些现象也相当普遍。多态性(polymorphism)一词用来描述个体之间的基因型差别现象。,（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡 突变发生在对生命过程至关重要的基因上，可导致个体、细胞的死亡。（四）突变是某些疾病的发病基础有害的突变,二、多种化学或物理因素可诱发突变,大量的突变属于自发突变，发生频率只不过在10-9左右。但由于生物基因组庞大，细胞繁殖速度快，因此它的作用是不可低估的。实验室用来诱发突变，也是生活环境中导致突变的因素，主要有物理和化学因素。,物理因素：紫外线(

29、ultra violet,UV)、各种辐射,化学因素：,三、引起突变的分子改变类型有多种,错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement),DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。自发突变和不少化学诱变都能引起DNA上某一碱基的置换。点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸改变。,（一）错配可导致编码氨基酸的改变,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,镰形红细胞贫血病人,膀胱癌细胞c-ras H基因点突变，基因表达产物仅12号氨基酸的变异,（二）缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸排列

30、顺序发生改变,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。缺失或插入都可导致框移突变。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失引起框移突变：,（三）重组或重排常可引起遗传、肿瘤等疾病,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型：,DNA损伤（突变）可能造成两种结果：其一是导致复制或转录障碍（如胸腺嘧啶二聚体，DNA骨架中产生切口或断裂）；其二是导致复制后基因突变（如胞嘧啶

31、自发脱氨基转变为尿嘧啶），使DNA 序列发生永久性改变。所以，必须通过进化使细胞拥有灵敏的机制，以识别和修复这些损伤，否则细胞无法维持正常代谢。,四、DNA损伤的修复有多种类型,修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,错配修复(mismatch repair)直接修复(direct repair)光修复(light repairing)切除修复(excision repairing)重组修复(recombination repairing)SOS修复,修复的主要类型：,（一）直接修复系统利用酶简单地逆转DNA损伤,光修复酶(photolyase),U

32、V,（二）核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形,这是细胞内最重要和有效的修复方式。其过程包括去除损伤的DNA，填补空隙和连接。主要由DNA-pol和连接酶完成。,E.coli的切除修复机制,核苷酸切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的RNA聚合酶，即参与转录偶联修复(transcription-coupled repair)。转录偶联修复的意义在于，将修复酶集中于正在转录的DNA，使该区域的损伤尽快得以修复。,（三）重组修复,（四）SOS修复,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E.coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,