分子医学实验绪论课件.ppt

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1、实验室规则,（一）保持实验室安静，认真仔细地按实验指导进行实验。（二）穿戴好实验服。保持实验台的清洁整齐。（三）爱护仪器，谨慎使用。节约使用药品试剂，蒸馏水，自来水和电。（四）不得将高温、强酸强碱、有毒污垢物品抛洒在实验台上。,（五）公用物品用毕放回原处，不得私自占有。（六）取完试剂应将瓶盖盖好，切勿错盖，用毕放回原处。（七）加热、用电，使用剧毒腐蚀试剂应注意安全操作，避免事故。（八）废弃液体除指定有专门容器收集者外，应倒入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。动物尸体应放入指定的容器中。（九）实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时向指导教师反映取得帮助。（十）实验完毕，须

2、将试剂排列整齐，整理好公用物品，将仪器洗净收起。檫净实验台，请指导教师检查，允许后方可离开。,成绩评分标准 50%实验+50%理论考试实验课8次，实验报告，实验表现（包括迟到早退，着装规范，实验操作规范，实验室卫生值日等），8次实验总分最后按比例计入总成绩。实验报告存档，不需归还学生。理论考试内容来自于讲义及平时教学,第八次设计性实验课安排分组方案：4人一组（无法组队同学加入其它组）答辩ppt内容：实验目的，意义，原理，实验方法选择，预计结果及数据表现形式，实验难点及可能出现问题，可能出现的实验结果偏差及解释答辩安排：第五周将答辩ppt电子版本给老师，答辩日每组时间控制为20分钟演讲，10分钟

3、提问,设计性实验题目：1 免疫球蛋白IgG的分离纯化与鉴定。2 人血清白蛋白的提取纯化及分子量的测定。3 蛋清中溶菌酶的分离鉴定。4 小鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及酶动力学研究。5 如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？6 如何提取真核细胞中的线粒体基因组DNA？7 蛋白质的表达具有一定的组织特异性，请以实验小鼠胰腺和肝脏为材料设计实验检测羧肽酶A1酶原(procarboxypeptidase A1)和白蛋白(Albumin)并计算这两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。8 细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）在肝脏中有三种亚型，即细胞色素氧化酶1，2和3，请以实验小鼠肝脏为

4、材料设计实验检测这三种酶的表达并计算它们的表达量。,分子医学实验技术绪论,实验课程改革的基本思路 教学目标与课程安排,生物化学 应用化学的原理和方法，研究生命现象、生命的本质、生命活动及其规律的的学科。医学生物化学 研究人体的化学组成、代谢、营养、酶功能、遗传信息传递、生物分子的相互作用等以及疾病的分子机制。通过研究，不仅从分子水平阐明生命现象及疾病分子机制，同时也可以为疾病的诊断及治疗提供有效的措施。,医学分子生物学 从分子水平研究人体在正常和疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。它主要研究人体生物大分子包括蛋白质和核酸的结构、功能、相互作用及其与疾病发生、发展的关系。分子生物学的基础理论和

5、特有的研究技术体系是分子生物学学科的重要特色，在疾病诊断及治疗中具有重要的应用价值。,医学遗传学 应用遗传学的理论与方法研究遗传因素在疾病的发生、流行、诊断、预防、治疗和遗传咨询等的作用机制及其规律的遗传学分支学科。内容包括遗传的细胞和分子基础、人类染色体与染色体病、单基因遗传病、多基因遗传病、生化遗传病、线粒体基因病、肿瘤遗传、遗传病的诊断和产前诊断等以及染色体制备和基因检测实验指导等。,生物化学是分子生物学的基础，分子生物学是生物化学的延伸和发展，遗传学则是生物化学与分子生物学研究的临床学意义的直接体现，三门学科的关系可用下图予以概括：,医学生物化学、医学分子生物学、医学遗传学，在学科发展

6、上及实验技术上互相依赖的三门课程。,分子医学实验技术 最大限度达到知识系统化、实验方法学习与技术训练的合理化。同时为培养学生的创新精神及提高综合素质打下良好基础。根据本科实验教学的目的及特点，实验设计时充分考虑不同层次内容及时间的合理安排。,目的：培养学生掌握最基本的实验室技术与技能，包括提取生物大分子的方法、定量测定方法及提取效果的检测。,包括：动物组织中蛋白质的提取、常用蛋白质定量方法、蛋白质电泳的基本方法、动物组织DNA的提取、DNA测定方法、DNA电泳的基本方法、染色体标本制备技术、各种层析技术的原理及基本操作方法。,基本技能性实验及设置原则,目的：除了应用基本技能训练部分的实验技术，

7、本类别实验还将学习PCR技术、蛋白印迹技术、人类外周血染色体标本制备及核型分析等。同时密切结合临床问题，有针对性训练学生从事临床研究的思路及掌握自行设计实验的基本知识。,综合性实验及设置原则,包括：人类外周血染色体标本的制备及核型分析；DMD基因突变检测；综合实验设计。,现代医学研究新技术介绍,目的：现代医学的发展与多种新技术的发展与建立是密切相关的，由于本科实验教学能掌握的技术有限，因此设置了通过理论教学与视频观摩相结合的课程来了解蛋白质组学技术、基因芯片技术、基于序列捕获技术的二代测序技术及它们的临床应用。,第一层次：掌握基本实验技能 蛋白质、DNA提取方法及定量测定方法 电泳技术 层析技

8、术 PCR技术 染色体标本制备技术 蛋白印迹技术 第二层次：了解现代医学研究新技术 蛋白质组学技术 基因芯片技术 基于序列捕获技术的二代测序技术 第三层次：学习科研设计的基本思路,通过本实验课程教学达到目的：,实验操作、新技术介绍、视频观摩合理穿插安排，便于有效利用时间。,生物样本中蛋白质的提取和含量测定,SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量,基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术,层析技术（凝胶过滤，离子交换，薄层层析，HPLC）,真核生物基因组DNA提取、含量和纯度测定,人外周血染色体标本制备、DMD基因突变检测,染色体G分带和核型分析及遗传病基因突变分析,设计性实验项目,八周实验课的

9、内容安排,总体实验安排（8个 实验各有长短，个别实验可能会超时，但总时间大致不变）,实验报告,实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，按照下列顺序写出实验报告：实验报告首页：实验名称（The title of experiment）；姓名；学号；班级；组别；同组同学；带教教师；实验日期等。正文：原理（Principle）；操作步骤（Operational procedure）；实验结果（Results）：包括照片、原始数据、计算过程及图表等；讨论（Discussion）：对实验方法，实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。,动物细胞蛋白质的提取和含量测定,蛋白

10、质是生命现象的物质基础之一，是生物体最重要的组成部分。因此，对蛋白质的结构与功能研究，是生命科学的核心问题。要研究蛋白质的结构与功能，往往从细胞中提取蛋白质开始，而对蛋白质含量的测定则是蛋白质相关研究中的必备技术。,基本原理,动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料。采用匀浆法将其破碎，然后加入样品提取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分析。,蛋白质提取中最常见的问题是目的蛋白质发生变性和被蛋白酶降解。基本的防范措施是尽可能缩短提取时间和在尽可能低的温度下进行提取。,为了防止蛋白酶的破坏，可在提取液中加入蛋白酶抑制剂。例如加入苯甲

11、磺酰氟（PMSF）可以抑制丝氨酸蛋白酶和某些半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂，可抑制酸性蛋白酶；乙二胺四乙酸（EDTA）可抑制金属蛋白酶。,为了防止蛋白质的巯基发生氧化，可加入一定量的还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇。考虑到溶液中如存在重金属离子（如铝、铜、铁离子）可能会与蛋白质形成不溶复合物，可在溶液中加入一定浓度的EDTA。,目前蛋白质的含量测定常用的方法有定氮法、双缩尿法（Biuret法）、Folin酚试剂法（Lowry法）、考马斯亮蓝法（Bradford法）、BCA法和紫外吸收法。其中Bradford法和Lowry法灵敏度较高，比紫外吸收法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍。,上述

12、这些方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定，有可能得出几种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。,Lowry法：该法的原理主要是根据蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子结合形成复杂的络合物（类似双缩脲反应）。由于蛋白质中酪氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与Folin酚试剂形成蓝色复合物。上述呈色反应色泽深浅皆与蛋白质含量成正比。因此通过比色，参照已知含量的标准蛋白质的比色标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。,考马斯亮兰法：

13、考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物在595 nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。,紫外吸收法测定蛋白质浓度：蛋白质中普遍含有酪氨酸与色氨酸，由于这两种芳香族氨基酸分子中含有大键，它们在280 nm紫外光附近有光吸收。因而使蛋白质在上述紫外波长附近产生较强的光吸收，利用蛋白质的这一特性可对其进行含量测定。,操作步骤,1用颈椎脱臼法处死小鼠，切开腹腔，取下完整肝脏

14、，小心去掉胆囊（不要弄破），放入盛冷生理盐水的烧杯中漂洗干净。2取小鼠肝组织0.5 g，在滤纸上剪碎，放入玻璃匀浆管中。3按1：15的比例往玻璃匀浆管中加入匀浆缓冲液（即每份样品需加预冷的提取缓冲液7.3mL，蛋白酶抑制剂0.2 mL），手动匀浆。注意用力均匀，以免损坏匀浆管。4匀浆完成后，取两只1.5 mL eppendorf管，各加入1.2 mL匀浆液后，置入冷冻离心机中。5于4，13000 rpm离心20分钟后，小心取出上清液至1.5 mL eppendorf管中，上清液需低温保存，作为待测样品备用。,Lowry法,1取16 mm*150 mm试管16支，标明号码，放置在试管架，在16号

15、试管内分别加入标准牛血清白蛋白（使用时取贮液用双蒸水稀释至0.5 mg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，用双蒸水补足至每管总体积0.5 mL，在7、8号试管内分别加入待测样品25、50 L，并用双蒸水补足至0.5 mL（即将待测样品稀释20或10倍）。916号重复18号。,2各管加入2.5 mL新配制的碱性铜溶液，立即摇匀，在室温下放置10min。3各管加入0.5 mL Folin酚试剂应用液，边加入边立即充分混合（用震荡混合器），然后在室温下放置3060min（不要超过60min）。4将标准样品及待测样品在可见光光度计上在550 nm波长下比色。5根据已知含量的标准样

16、品测得的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。,考马斯亮兰法测定蛋白质浓度,1取16 mm*150 mm试管16支，标明号码，放置在试管架，在16号试管内分别加入标准牛血清白蛋白（使用时取贮液用双蒸水稀释至0.5 mg/mL）0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL，用双蒸水补足至每管总体积0.1 mL，在7、8号试管内分别加入稀释20、10倍的待测样品0.1 mL。916号重复18号。,2每管加入考马斯亮兰G250染料试剂3 mL,摇匀，室温静置3分钟。3分光光度计于波长595nm比色。4根据已知

17、含量的标准样品测得的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。,紫外吸收法测定蛋白质浓度,1取16 mm*150 mm试管16支，标明号码，放置在试管架，在16号试管内分别加入标准牛血清白蛋白（2 mg/mL）0、0.3、0.45、0.6、0.7 5、0.9 mL，用双蒸水补足至每管总体积3 mL，在7、8号试管内分别加入稀释100、50倍的待测样品3 mL。916号重复18号。,2以1号管为参比，用紫外分光光度计于波长280 nm处比色。3根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算小鼠肝提取液的蛋白质含量。,饭盒里的离心管和加样枪盒里的tip头均为无菌，不要用手取用，离心管需用镊子拿取。用完即刻盖上盖子，保持无菌。不同规格的移液器，使用不同的移液枪头。装上和取下时动作要轻。避免损坏。不同的量程范围的移液器有不同的最大和最小刻度，调节时不得超过其最大和最小刻度，否则，会造成移液器损坏。不同规格的移液器，吸取的量要在其可调范围内，否则会引起吸样量不准确。取液量都极为微小，吸样量要准确。每把移液器都有二档，吸取时，压至一档，打出时，压至二档。,