四讲RNA生物合成课件.ppt

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1、第四讲 RNA的生物合成,RNA代谢,一、RNA合成的特征,二、原核生物RNA合成,三、真核生物RNA的合成,四、原核与真核生物mRNA的比较,目录,五、内含子的剪接、编辑、再编码及化学修饰,RNA代谢,除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都来自于DNA。基因组DNA通过一个被称为转录的过程把贮存在双链DNA分子中的遗传信息转换到与模板DNA链相互补的RNA单链上。,mRNA，编码了一个或多个蛋白质序列。tRNA，把mRNA上的遗传信息变为多肽中的氨基酸信息；rRNA，是合成蛋白质的工厂核糖体中的主要成份。,一、RNA合成的特征,1、RNA的前体是四种核糖核苷三磷酸（rNTP）：ATP、GT

2、P、CTP和UTP。2、RNA链的生长方向也是从53，核苷三磷酸加到新生链的3 端，同时除去一分子焦磷酸而生成磷酸二酯键。3、转录必需以一条DNA链作为模板，按照碱基互补原则进行转录，因此DNA中的A、G、C、T将被分别转录为U、C、G、A。有义链（或编码链）：与mRNA序列相同的那条DNA链。反义链（或模板链）：指根据碱基互补配对原则指导RNA合成的DNA链。4、RNA聚合酶与DNA聚合酶不同，RNA聚合酶能起始一条新链的合成，起始的核苷酸一般是嘌呤核苷三磷酸。5、转录有一定的起始、终止位点。,转录起始点及有关位置表示方法：,转录起始点是指mRNA开始转录的第一个碱基，此点通常用+1表示，由

3、此与转录方向相一致的下游序列的碱基位置用正值表示；与转录方向相反的上游序列的碱基位置用负值表示。,-30-20-10+1+10+20+30+40,上游 下游,1.RNApol的结构,表4-1 RNApol的结构,二、原核生物RNA合成,（一）原核生物RNA聚合酶（RNA polymerase),因子不仅增加聚合酶对启动子的亲和力，还降低了它对非专一位点的亲和力。,1.定义,启动子是一段位于结构基因5端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性。,启动子的位置，可在+1上游，也可在+1下游（个别）。,（二）启动子（promoter),2.Promot

4、er的结构,可被RNA全酶保护的区域-50+20。,同源性序列：-10 区、-35区 有同源性；强启动子更保守。,Pribnow box-10区，100个测定启动子中,T46 T41 T40 T43 G43 N T80 A95 T45 A60 A50 T96 G37 富含A/T。,-35 区，识别区,T82 T84 G78 A65 C54 A54,图4 6 一个典型的启动子含有三个部分，由在-35、-10 和起始原点的共有序列组成。,在原核生物中，35区与10区之间的距离大约是1619bp。下降突变：如果把Pribnow区从TATAAT变成AATAAT就会大大降低其结构基因的转录水平。上升突变

5、：即增加区共同序列的同一性。如：乳糖操纵子的启动子中，将其Pribnow区从TATGTT变成TATATT，就会提高启动子的效率。,图4 4 启动子的共有序列和RNA聚合酶的结合部位。,1 RNA合成的起始,（1）RNApol全酶识别。RNApol酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。聚合酶与启动子结合形成封闭复合物。此时，DNA仍处于双链状态。伴随着DNA构象上的重大变化，封闭复合物变为开放复合物。,（2）pppA或pppG起始。开放复合物与最初两个NTP相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后转变为包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三元复合物。第一个碱基通常为嘌呤。通过启动子

6、阶段（合成6-9个核苷酸）。,（3）因子脱落,（三）RNA的酶促合成,Figure 4 12 RNA polymerase passes through several steps prior to elongation.A closed binary complex is converted to an open form and then into a ternary complex.,图4 12 在延伸以前，RNA聚合酶要通过若干步。一个紧密的二聚体复合物被转变成一种开放形式，然后变成三聚体复合物。,RNA-DNA杂交区约12bp,RNApol解链的DNA的长度为17bp（1.6个螺旋）

7、,因子脱落后，NusA蛋白（防止转录终止的调节因子）与RNApol结合作用（不牢固）。,2 RNA链的延长,图4 16 RNA延伸的图解,3 RNA合成的终止 一旦RNA聚合酶启动了基因转录，它就会沿着模板53方向不停地移动，合成RNA链，直到遇到终止信号时才释放新生的RNA链，并与模板DNA脱离。研究RNA链终止时遇到最常见的问题是3端核苷酸的定位，因为活细胞内部根据终止信号正确终止的RNA与一个经过剪接的RNA在3端没有两样，都是-OH基团。模板DNA上都有终止转录的特殊信号-终止子，每个基因或操纵子都有一个启动子，一个终止子。在新生RNA中出现发卡式结构会导致RNA聚合酶的暂停，破坏RN

8、A-DNA杂合链5端的正常结构。寡聚U的存在使杂合链的3端部分出现不稳定的rUdA区域。,（1）依赖于因子的终止 因子是一个相对分子质量为2.0105的六聚体蛋白，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶，同时具有解螺旋酶的活性。有人认为，在RNA合成起始以后，因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着53 方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3-OH端后取代暂停在终止位点上的RNA聚合酶，它所具有的RNA-DNA解螺旋酶活性使转录产物RNA从模板DNA上释放，随后，转录复合体解体，完成转录过程。终止过程需要消耗能量。,Figure 4 19 A rho-dependent

9、 terminator has a sequence rich in C and poor in G preceding the actual site(s)of termination.,RNApol识别终止子，在转录此终止后合成速度减慢，从RNA5 移动至RNApol处，使RNA释放。（图4 19）,图4 19 依赖rho的一种终止子在终止作用的实际位点前方有一段富含C而极少含G的序列。,RNA聚合酶沿模板移动,因子依附在RNA的5端,因子沿RNA链运动，跟踪聚合酶,因子赶上在终止位点暂停的聚合酶,终止 三元复合体解体,聚合酶在终止位点暂停,（2）不依赖于 因子的终止 若终止点上游存在一个

10、富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构；在终止点前面有一段由4-8个A组成的序列，导致转录产物的3端为寡聚U。这两种结构特征的存在同样决定了转录的终止。在新生RNA中出现发卡式结构会导致RNA聚合酶的暂停，破坏RNA-DNA杂合链5端的正常结构。寡聚U的存在使杂合链的3端部分出现不稳定的rUdA区域。,图4 18 RNA合成时的发卡终止结构。,（3）抗终止,破坏终止位点RNA的茎环结构依赖于蛋白因子的转录抗终止 噬菌体中由N基因编码产生的N蛋白具有抗转录终止作用，但是其功能的发挥依赖于宿主所产生的NusA、NusB、S10、2.5104等几种蛋白质，这些蛋白质

11、结合到终止子附近的DNA位点是实现抗终止的必要条件（图3-21）。,DNA与RNA合成的不同点：从DNA合成反应的化学本质、极性和模板的使用这三方面来说，转录与复制是相同的。但是，也存在三个主要不同点：A 转录中不需要RNA引物；B转录反应一般只用一小段DNA做模板；C在转录区，一般都只有一条DNA链可以作为模板。,表4-3 真核生物RNA聚合酶,种类 存在 功能（合成产物）结构 对-鹅蕈碱敏感性,RNApol 核仁 5.8S、18S、28S rRNA 2个大亚 不敏感-基、4-8 个小亚基,RNApol 核质 mRNA 敏感+,RNA pol 核质 tRNA、5S rRNA、SnRNA 存在

12、物种特异性,线粒体叶绿体,RNApol(核基因编码）,三、真核生物RNA的合成,1.真核生物RNA聚合酶,真核生物的RNA聚合酶一般由816个亚基所组成，相对分子质量超过5x105。虽然不同生物3类RNA聚合酶的亚基种类和大小各异，但具有相似性。存在两个普遍遵循的原则：一、聚合酶有两个相对分子质量超过1x105的大亚基；二是同种生物3类聚合酶有共享小亚基的倾向。（见下表）,RNA聚合酶I RNA聚合酶II RNA聚合酶IIIRPA1 RPB1 RPC1RPA2 RPB2 RPC2RPC5 RPB3 RPC5RPC9 RPB11 RPC9RPC6 RPB6 RPB6其它9个亚基 其它7个亚基 其

13、它11个亚基,真核生物RNA聚合酶的亚基,2.真核生物启动子的主要部位,位于-25-35区，其共有序列为TATA A，TATA框主要决定转录的精确起始，RNA聚合酶同TATA框牢固结合之后才能开始转录。,（1）TATA框,（2）CAAT框,位于-70-80区，共有序列GG CAATCT。,（3）GC框,AT,AT,CT,位于-80-110区，共有序列GCCACACC或 GGGCGGG。,CAAT区和GC区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。,（4）增强子,（4）增强子,增强子是一类远程调控序列。,远距离效应 它们可调控的基因有相当远的距离，甚至相距10kb也能发挥作用。,无方向性

14、可处于被转录序列的上游，下游，甚至处于转录序列中。,顺势调节 只调节位于同一染色体上的靶基因。,具有组织特异性 增强子在行使功能时可具有组织特异性或给定细胞中特定的分化阶段发挥作用。,有相位性 其作用与DNA的构象有关。,无物种和基因特异性 可以连接到异源基因上发挥作用。,有的增强子可以对外部信号产生反应。,3.真核生物RNA的转录,（1）起始：转录因子（反式作用因子）。,（2）延伸：合成速度30 50 nt/s,速度不恒定。,（3）终止,对于真核生物转录的终止信号和机制了解很少。爪蟾5SRNA的3-末端为4个U，而这4个U的前后均为富含G/C的序列，在G/C序列中分布着寡聚T（4个以上）是所

15、有真核生物RNA聚合酶III的终止信号。,表3-4 真核生物RNA聚合酶II所形成的转录起始复合物,蛋白质 亚基数 亚基的相对分子量/103 功能,RNA聚合酶II 12 10220 催化RNA的生物合成,TBP 1 38 与启动子上的TATA区结合,TFIIA 3 12、19、35 使TBP及TFIIB启动子的结合比较稳定,TFIIB 1 35 与TBP相结合，吸引RNA聚合酶和,TFIID 12 15 250 与各种调控因子相互作用,TFIIE 2 34、57 吸引TFIIH，还有ATP酶及解链酶活性,TFIIF 2 30、74 结合RNA聚合酶II并在TFIIB帮助下阻,TFIIH 12

16、 35 89 在启动子区解开DNA双链，使RNA聚合,TFIIF到启动子上,止聚合酶与非特异性DNA序列相结合,酶II磷酸化，接纳核苷酸切除修复系统,RNA聚合酶II及转录因子在启动子上的装配,TBP（orTFIID and/orTFIIA）TFIIBTFIIF-RNA polymerase IITFIIETFIIH,转录的抑制,第一类：DNA模板功能抑制剂，通过与DNA结合而改变模板的功能。第二类：RNA聚合酶的抑制物，它们与RNA聚合酶结合而抑制其活力。,1.原核生物mRNA的特征,（1）原核生物mRNA的半衰期短。（2）许多原核生物mRNA可能以多顺反子的形式存在。后面几个顺反子的翻译起

17、始会受到其上游顺反子结构的调控（图3-14）（3）原核生物mRNA的5端无帽子结构，3 端没有或只有较短的polyA结构。,原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一个被称为SD序列的保守区，因为该序列与16S rRNA 3端反向互补，所以被认为在核糖体mRNA的结合过程中起作用。,四、原核与真核mRNA特征比较,帽子结构有三种,0类帽子：m7GpppX，真核单细胞生物，如；酵母。,1类帽子：m7GpppXm,真核普遍存在。,2类帽子：m7GpppXmpYm，10 15%的真核有此结构。,形成：帽子结构在剪切前已形成。,2.真核生物mRNA特征,（1）5 端存在 帽子结构,图4 25,

18、（2）绝大多数真核生物3端具有多聚A尾巴形式,mRNApoly(A)+示有poly;mRNApoly(A)-示无poly,polyA是在polyA合成酶作用下逐个凑加的。,AAUAAA为poly(A)附加的识别序列。,poly A的作用：（1）是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式，它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。（2）可用于cDNA的合成。,五、内含子的剪接、编辑、再编码及化学修饰,1.RNA中的内含子,内含子：在RNA原初转录本中被切除，而最终不表达的片段。,外显子：在RNA原初转录本中剪接中保留并连在一起最终表达的片段。,部分人类基因中内含子序列所占的比例分析,基因 长度/kb

19、 内含子数量 内含子所占比例胰岛素 1.4 2 67-球蛋白 1.4 2 69血清蛋白 18 13 89 胶原蛋白组分 31 117 71因子 186 25 95萎缩性肌强直因子 2400 78 99,RNA加工过程及其生理功能,2.mRNA前体中的内含子的保守序列,（1）GU-AG法则，Chambon法则多数细胞核mRNA前体中内含子的5边界序列为GU，3边界序列为AG。因此，GU表示供体衔接点的5端，AG代表接纳体衔接点的3端。这种宝石序列模式称为GU-AG法则，又称为Chambon法则。,（2）外显子与内含子交界处的序列，内含子内部的部分序列也可能参与内含子的剪接。,A/CAG GUPu

20、AGU A Py rich AG G,5,3,5剪接位点 分支点 3剪接位点,外显子 内含子 外显子,图 脊椎动物mRNA前体中常见的内含子剪接所必需的保守序列,许多发生分叉剪接的核mRNA内含子3端上游18-50个核苷酸处，存在一个序列Py80NPy87Pu75APy95，其中A为百分之百保守。,3.剪接体进行的mRNA的剪接 核内mRNA原始转录产物的剪辑方式可能是最常见的。在这一模式中，RNA的剪辑需要特异性RNA-protein-复合物small nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和small nuclear RNAs（snRNAs）。已经发现至少有5种

21、snRNAs-U1，U2，U4，U5，U6。,剪切位点特征：,b.无互补。,c.位于内含子和外显子交界处。,d.以GU开始，以AG告终。,剪接信号：,分支点序列。,5和 3剪切位点序列。,a.是保守序列，有共同的结构基元：5AGGUAAGU。,U1 snRNPU2 snRNP,U2,果蝇中与性别分化相关基因产物的特异性剪接过程,Sxl pre-mRNA,tra pre-mRNA,dsx pre-mRNA,核酶的发现,最早认为RNA的剪接由蛋白质（酶）进行。,实验1：材料，四膜虫,26S rRNA,分析：是否RNA前体中混有某种蛋白？,4.I类和II类内含子的剪接,实验2：用重组DNA制备RNA

22、前体,重组DNA,RNA前体,26S rRNA,结论：RNA具有自我剪接能力，称之为Ribozyme.,1986年获诺贝尔奖,I类内含子的剪切机制,剪接反应由2个转酯反应完成（四膜虫、细菌）。,a.第一个转酯反应由 一个游离的鸟苷或鸟苷酸介导，鸟苷或鸟苷酸3-OH 作为亲核基团攻击内含子5的磷酸二酯键，从上游切开RNA链。,b.上游外显子3-OH 攻击内含子3位核苷酸上的磷酸二酯键，使外显子1和外显子2联结。,c.释放内含子环。,Group I内含子切除体系,II类内含子的剪切机制,细胞内定位：存在于真核生物的线粒体和叶绿体rRNA基因中,特点：转酯反应无需游离鸟苷酸或鸟苷。过程：a.由内含子

23、本身的靠近3端的腺苷酸2 OH作为亲核基团攻击内含子5 端的磷酸二酯键，从上游切开RNA链后形成套索结构。b.再由上游外显子的自由3 OH作为亲核基团攻击内含子3 位核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子被完全切开。c.上下两个外显子通过磷酸二酯键相连。,Group II内含子切除体系,剪接体形成锤头状构象,已经发现有几类RNA的自我剪切类型。,四膜虫的rRNA剪接属类。,酵母A-2-OH 攻击属类。,无论哪一类，均要形成一定的催化构象，如已确定的锤头型构象。,4-28,4-29,剪切位点突变导致地中海贫血症（thalassemia),地中海贫血症起因于血红蛋白合成缺陷。,此类贫血症中有一类是异常剪接

24、引起。,mRNA前体中的内含子（intron)必须精确的剪切掉，剪切位置发生一个核苷酸的差异，即会导致阅读框（reading frame)的改变，从而合成非功能蛋白。,-珠蛋白的第一内含子发生突变，突变位点发生在正常3剪接位点上游，离位点20个N处。正常人是G，病人是A，即G A。从而导致产生了一个新的3剪接位点（原位点上游），新剪切位点剪切，使mRNA中密码子变化。在新剪切点后的第7个密码子是蛋白质合成的终止密码。结果是合成不正常的血红蛋白-亚基，导致贫血症。,核酶发现的意义,生命的最初形式可能是RNA，其兼有DNA和蛋白质的功能。在进化过程中 作为遗传模板的功能让位于DNA（RNA不稳定）

25、作为催化剂的功能让位于蛋白质。c.利用其机制，设计合成特异性切割病毒RNA或其它RNA的核酶，以便于治疗包括爱滋病、癌症在内的疾病。,核酶的类型：a.剪切型b.剪接型,2.RNA的编辑、再编码及化学修饰,（1）RNA的编辑,RNA的编辑是某些mRNA前体的一种加工方式，如插入、删除或取代一些核苷酸残基，导致DNA所编码的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。,类型,位点特异性脱氨基作用引导RNA指导的尿嘧啶插入或删除,哺乳动物载脂蛋白mRNA的编辑,CAA,UAA,肝中剪接的mRNA编码含4563个残基的蛋白质,肠中mRNA有密码子在第2153位密码子终止合成

26、,第2153位密码子编码Gln,CAA,哺乳动物中RNA编辑的实例,利什曼原虫属细胞色素b mRNA的编辑,AAAUAUAAUAGAA,A G G C,AAA UAUAA UAGAA,UUUAUGUUGUCUU,与指导RNA配对,U插入,释出mRNA,UUUAUGUUGUCUU,指导RNA,mRNA,mRNA,RNA编辑的生物学意义,（1）校正作用（2）调控翻译（3）扩充遗传信息,2.RNA的再编码,mRNA在某些情况下不是以固定的方式翻译，而是可以改变原来的编码信息，以不同的方式进行翻译，科学上把RNA编码和读码方式的改变称为RNA的再编码。,核糖体1/-1移位核糖体跳跃,3.RNA的化学修

27、饰,有些RNA，特别是rRNA和tRNA，还可能有特异性化学修饰。图3-31例如：人细胞内rRNA分子就存在106种甲基化和95种假尿嘧啶产物。,2.rRNA转录后的加工,真核生物有4种rRNA。,大亚基（60S）rRNA:28S(4700nt);5S(120nt);5.8S(160nt)。,小亚基（40S）rRNA：18S（1900nt)。,其中5.8S rRNA、18S rRNA、28 S rRNA 为一个转录单位，前体为45S RNA，其加工过程如图。,5S rRNA与tRNA在一个转录单位中。,4-30,转录后加工步骤：,切除成熟 tRNA 5、3序列：,5-：RNaseP。,3：核酸内切酶和外切酶。,3-末端CCA凑加：,tRNA核苷酸转移酶。,修饰：,甲基化：甲基转移酶。,氢化：DHU,转位：,3.tRNA转录后加工,4-31,