临本（查）第十四章 DNA的生物合成课件.ppt

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1、,我从哪里来？,次级卵母细胞完成第二次成熟分裂,雌、雄原核形成,雌、雄原核融合,受精卵形成,二细胞期 四细胞期 八细胞期桑椹胚 早期胚泡 晚期胚泡,滋养层,内细胞群,胚泡腔,植入,胚外体腔,子宫腔,丛密绒毛膜,平滑绒毛膜,壁蜕膜,包蜕膜,底蜕膜,脐带,羊膜腔,绒毛分部,2个月,胚体各期的外形特征,3个月,胚体各期的外形特征,4个月,胚体各期的外形特征,5个月,胚体各期的外形特征,6个月,胚体各期的外形特征,8个月,胚体各期的外形特征,遗传信息的传递,分子生物学,DNA RNA 蛋白质,遗传信息传递的中心法则,复制,转录,翻译,逆转录,DNA,是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的

2、形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。,DNA生物合成,第 十四 章,本章内容,第一节 DNA复制的基本特征（掌握）第二节 DNA复制的酶学和拓扑学变化（熟悉）第三节 原核生物DNA复制过程（掌握）第四节 真核生物DNA复制过程（掌握）第五节 逆转录和其他复制方式（了解）,DNA复制的基本特征,第一节,一、半保留复制二、双向复制三、半不连续复制,DNA复制的基本特征（掌握）,DNA复制时，亲代DNA双螺旋解开成为两

3、条单链，各自作模板，按照碱基配对规律合成一条与模板互补的新链，形成两个子代DNA，每一个子代DNA分子中都保留有一条来自亲代DNA的 链，这种DNA复制的方式称为 DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。,一、DNA以半保留方式进行复制,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,目

4、录,TCCATGACGGTGACC,子链继承母链遗传信息的几种可能方式:,全保留式 半保留式 混合式,DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson 和 F.Stahl 所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，将具有不同密度的DNA分离开。,（一）DNA半保留复制的实验证明,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,半保留复制的实验依据和意义,按半保留复制方

5、式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的，自然界还普遍存在变异现象。,（二）半保留复制的意义,二、DNA复制从起点向两个方向延伸,原核生物复制时，DNA从复制起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),DNA的双向复制示意图,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子

6、是独立完成复制的功能单位。,复制起始点与复制子示意图,DNA的双向复制,复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）,DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须是35。由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的聚合方向也是不同的。,三、DNA的半不连续复制,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,后随链,岗崎片段,半不连续复制,以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为前导链(leading strand)。以53方向的亲代DNA链为模板的

7、子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为后随链(lagging strand)。DNA复制时，前导链是连续的，而后随链是不连续的，这种模式称半不连续复制。,由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，后随链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由后随链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100200个核苷酸，相当于一个核小体DNA的大小。,1.底物：四种脱氧三磷酸核苷（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)2.模板：以DNA的解开两条链为模板链 3.引

8、物：一小段RNA(或DNA）为引物，提供3-OH作为新链延伸的起点。4.酶和蛋白因子：DNA聚合酶、解螺旋酶。,第二节 DNA复制的酶学和拓扑学变化,一、DNA聚合酶(DNA-pol；DDDP):,依赖DNA的DNA聚合酶。其催化反应的特点（1）反应需要有模板的指导；（2）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物:（3）反应需要有3-OH存在；（4）DNA链的合成方向为5 3；（5）新生DNA链与模板链之间遵循碱基互补原则；,DNA聚合酶的催化活性,1.53 的聚合活性2.3 5 核酸外切酶活性,DNA聚合酶的催化活性,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+ppi,Mg2+,DDDP,生物大分子合成

9、：底物、酶、能量、模板,53DNA聚合酶活性,3 5外切酶活性:,5 3外切酶活性:,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性:,（一）原核生物有3种DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol,功能：,DNA-pol(250kD),是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,功能：,DNA-pol（109kD）,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow

10、片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol（120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。,原核生物的DNA聚合酶,5,催化复制合成,应急修复,主要作用,多亚基不对称,二聚体,？,单肽链,组成,250,120,109,分子量,(,kD,),DNA,-,pol,III,DNA,-,pol,II,DNA,-,pol,I,3,参与校对、修复,多亚基不对称,二聚体,？,单肽链,组成,250,120,109,分子量,(,kD

11、,),DNA,-,pol,III,DNA,-,pol,II,DNA,-,pol,I,（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种:,2.在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种:,真核生物的DNA聚合酶,为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：1遵守严格的碱基配对规律；2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择10-5；3对复制过程中出现的错误及时进行校正10-10。,二、复制的保真性-有序而精确,（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型。与相

12、应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,3 5外切酶活性:,5 3外切酶活性:,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现外切酶活性。,(一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,三、复制中的解链伴有DNA分子拓扑学变化,解螺旋酶（DnaB)(helicase)，是将DNA双螺旋结构解除。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。,3,5,3,5,解螺

13、旋酶的作用,ori,单链DNA结合蛋白（single strand DNA-binding protein,SSB），是选择性结合并覆盖在单链DNA上的一类蛋白，以防止解开的DNA单链被酶水解及重新结合成双链。,单链DNA结合蛋白 稳定并保护DNA单链,单链结合蛋白（SSB),引物,引物酶,DNA复制过程中正超螺旋的形成,解链过程中正超螺旋的形成,（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态,人类拓扑异构酶的分子结构,能够松解DNA超螺旋结构的酶。,拓扑异构酶的作用特点：既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,DNA拓扑异构酶的作用机制,拓扑酶II的作用方式：,DNA连接酶

14、(DNA ligase)可连接DNA链的3-OH末端和相邻DNA链5-P末端,使二者生成3，5-磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口,DNA连接酶的连接作用,DNA连接酶催化的条件是：需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基；未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶的作用,DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催

15、化3,5-磷酸二酯键生成的比较,复 制 过 程 动 画,第三节 原核生物 DNA复制过程-起始、延长、终止,一、复制的起始：DNA解链形成引发体,准备工作：,1.DNA解开成单链，提供模板。,2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,1.复制有固定起始点,DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用ori(或o）表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。大肠杆菌染色体DNA以及真核生物的细胞器DNA为双链环状，只有一个复制原点，而真核生物染色体DNA是线性双链分子，含有许多复制起点。,（一）DNA的解链,E.coli复制起始点 oriC,复制有固定起始点,2.DNA解链需多种蛋白质

16、参与,3,5,3,5,解螺旋酶的作用,ori,单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。,3.解链过程中需要DNA拓扑异构酶由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。,（二）引物合成和引发体形成：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域（TTATCCACA)形成引发体；在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,引物酶(primase)本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短

17、链引物(primer)，以提供自由的3-OH，使子代DNA链能够开始聚合。,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,.引发体和引物,含有解旋酶DnaB、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,引物酶催化合成短链RNA引物分子,引物,引物酶,二、DNA链的延长,复制中DNA链的延长指在DNA聚合酶催化下，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中是DNA聚合酶。

18、,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA复制的延长过程,同一复制叉上前导链和后随链由相同的DNA-pol催化延长,前导链的合成过程,后随链的合成过程,DNA聚合酶催化前导链和后随链同时合成,复制过程简图,目 录,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,三、复制的终止,三、复制的终止,在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。,切除引物，填补空缺和连接

19、切口：,在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,连接冈崎片段：,后随链上不连续性片段的连接：,切除引物,填补空缺,连接切口,第四节 真核生物DNA生物合成过程,（一）DNA的复制速度慢、酶种类多（二）DNA复制过程涉及核小体分离与重新组装（三）多个复制子（四）DNA的复制发生在S期、冈崎片段短。（五）端粒复制 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋

20、白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)。,一、真核生物复制的起始：与原核生物基本相似,增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作

21、用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。,DNA-pol 和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通过增殖细胞核抗原（PCNA）的协同作用，逐步取代pol，在RNA引物的3-OH基础上连续合成前导链。后随链引物也由pol 催化合成。然后由PCNA协同，pol 置换pol，继续合成DNA子链。,二、真核生物复制的延长：发生DNA聚合酶/转换,3,5,5,3,前导链,3,5,3,5,亲代DNA,后随链,引物,核小体,三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。

22、复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。,线性DNA复制的末端,端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,端粒酶(telomerase),端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,端粒酶的分子结构,人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)人端粒

23、酶协同蛋白1(human telomerase associated protein 1,hTP1)人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),端粒酶的组成,端粒酶的爬行模型（动画演示）,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次,真核生物染色体DNA,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白(cyclin)，和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶(cy

24、clin dependent kinase，CDK)。,哺乳类动物的周期蛋白和CDK,哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDK的蛋白质，例如锚蛋白(ankynin)是CDK4的特异性抑制物，P21蛋白能抑制多种CDK。锚蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使细胞周期开放/关闭，因此被形容为细胞周期的检查点(check point)蛋白。,逆转录的定义：以RNA为模板合成双链DNA的过程。一、逆转录酶和逆转录逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶。RDDP逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性：催化三种反应：RNA指导的DNA合成RNA水解DNA指导的DNA合成,第五节逆转录和其他复制方式,ASV RNA,RN

25、A DNA(-),DNA(-),DNA(-)DNA(+),1.RNA指导DNA合成,2.RNA水解,3.DNA指导DNA合成,逆转录酶的作用,逆转录病毒与宿主细胞基因整合过程示意图,RNA病毒粒子,病毒RNA,RNA DNA 逆转录酶,DNA（前病毒）,和宿主细胞DNA整合,c-src,整合后的DNA进行复制,v-src,RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integra

26、tion)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。,二、逆转录的发现发展了中心法则,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,逆转录病毒（RNA病毒）的基因组,逆转录病毒：鸡肉瘤病毒（ASV）Rouse肉瘤病毒（RSV）小鼠白血病病毒（MuLV)人类T细胞白血病病毒（HTLV-I）爱滋病病毒（HIV）SARS,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列

27、互补的DNA链。,试管内合成cDNA:,cDNA complementary DNA,滚环复制(rolling circle replication),三、噬菌体DNA按滚环方式复制和线粒体DNA按D环方式复制,是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,滚环复制的过程,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,D-环复制时需合成引物。mtDNA为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制。复制中呈字母D形状而得名。D环复制的特点是复制起始点不在双链DNA同一位点，内、外环复制有时序差别。,本章小结,DNA复制的基本规律DNA复制的酶类DNA复制过程反转录,1.半保留复制2.双向复制3.有特定的起始点 4.半不连续复制5.复制的保真性（忠实性）,DNA聚合酶、解螺旋酶、DNA拓扑异构酶引物酶、DNA连接酶等,起始、延长、终止,思考题：,1DNA复制的保真性依赖什么机理？2原核生物DNA聚合酶有那几种？它们在DNA复制和损伤修复中起什么作用？3简述参加DNA复制过程的酶及蛋白质因子的作用。,谢谢,