（生物化学教学ppt课件）第20章 重组dna技术.ppt

《（生物化学教学ppt课件）第20章 重组dna技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《（生物化学教学ppt课件）第20章 重组dna技术.ppt（77页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第二十章,重组DNA技术,Recombinant DNA technique,授课：生物化学与分子生物学 江黎明,第一节 重组DNA技术的基本过程Basic Process of Recombinant DNA Technology,2023年3月26日3时41分,2,学习要求：,掌握重组DNA技术与基因工程的概念、基本原理和基本步骤。,一、重组DNA技术相关概念,重组DNA技术(Recombinant DNA Technology)：,又称基因工程技术(genetic engineering)，是在体外将不同来源的特异基因或 DNA片段插入载体分子，构建成重组 DNA分子；并将它导入到合适的

2、受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，筛选出含有目的基因的转化子细胞；再进行扩增、获取大量同一DNA分子。,2023年3月26日3时41分,3,亦称DNA克隆(DNA cloning)，或基因克隆(gene cloning)。,克隆化(cloning)：获取这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。,重组DNA(recombinant DNA,)：又称嵌合DNA（chimera DNA），是采用克隆技术把来自不同生物的外源 DNA插入载体分子所形成的杂合DNA分子。,2023年3月26日3时41分,4,克隆(clone)：指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传上同一的DNA

3、分子、细胞或个体；,2023年3月26日3时41分,5,二、DNA重组技术基本程序,重组DNA技术的基本过程（续）,2023年3月26日3时41分,6,分,分离目的基因并进行必要的改造,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接目的基因与载体成重组载体,转,将重组载体转导入受体细胞,筛,筛选出含重组DNA的细胞等,二、DNA重组技术基本程序,2023年3月26日3时41分,7,2023年3月26日3时41分,8,Common Enzymes Used in Recombinant DNA Technology,第二节重组DNA技术中常用工具酶,学习要求：,掌握限制性内切酶的概念、性质和分类方法，熟悉

4、重组技术中的其他工具酶。,一、限制性核酸内切酶（restricton Endonuclease）,是一类能识别双链DNA中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶，又称为限制酶（restriction enzyme）。,基因工程的手术刀-“切”,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,2023年3月26日3时41分,9,主要是从原核生物中分离纯化而来。,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,（一）限制酶的命名：,一、限制性核酸内切酶,2023年3月

5、26日3时41分,10,和型限制酶通常是相对分子量较大的多亚基蛋白质复合物，同时具有内切酶和甲基化酶活性，反应过程中需有Mg2+和ATP参与。,、和型（基因工程技术中常用型）。,（二）限制酶的分类：,型限制酶通常以同源二聚体形式存在，只具有核酸内切酶活性而无甲基化酶活性，反应过程中只需有Mg2+参与而不需有ATP参与。,2023年3月26日3时41分,11,类酶识别序具有回文结构(palindrome)特点，即具有双重旋转对称结构的DNA反向重复双链序列。,（三）型限制酶的作用特点：,1.基本特性：大部分型限制酶都能识别由48个核苷酸组成的特定序列。,2023年3月26日3时41分,12,Ba

6、m H,Hind,平或钝末端（blunt end),粘性末端（sticky end),切口：平端切口、粘端切口,2023年3月26日3时41分,13,+,Bam H,+,Bst,2.同裂酶 来源不同但能识别相同序列，切割 DNA后产生相同的黏性末端的限制酶，又称同功异源酶。,2023年3月26日3时41分,14,Bam H,Bg l,+,+,3.同尾酶 识别序列不完全相同，但切割 DNA后，产生相同的黏性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为配伍未端(compatible end)。,2023年3月26日3时41分,15,4.可变酶 识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别

7、序列往往超过6个核苷酸。为型限制酶的特例。,如：Bstp GGTNACC CCANTGG,2023年3月26日3时41分,16,如：Bbl CGGN(N)4CCG;GCC(N)4NGGC,（四）限制酶的应用及影响因素,1.限制酶的应用 重组DNA技术、基因组DNA物理图谱绘制、基因组DNA同源性研究、切割基因组DNA或cDNA构建基因组文库或cDNA文库等。,2.影响限制酶作用的因素 DNA纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、时间及缓冲液体系等。,2023年3月26日3时41分,17,只能封闭DNA链上的缺口（nick）,而不能封闭裂口（gap）。,是一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸

8、二酯键的酶。,二、DNA连接酶(DNA ligase),基因工程的缝纫针-“接”,需要在一条DNA链的3末端具有游离的羟基、另一条DNA链的5末端有磷酸基团，而且反应过程需要由ATP提供能量。,2023年3月26日3时41分,18,（一）DNA连接酶的类型：,1.大肠埃希菌DNA连接酶,只能连接具有互补黏性末端的两个双链DNA分子底物。需要NAD+作为辅助因子。,2023年3月26日3时41分,19,2023年3月26日3时41分,20,2.T4 DNA连接酶,连接的底物可以是两个双链DNA分子的互补黏性末端或平末端。最早是从T4噬菌体感染的大肠埃希菌分离，易制备，应用广。,1.DNA连接酶应

9、用,（二）DNA连接酶的应用及影响因素：,催化两个具有黏性末端或平末端的DNA片段形成磷酸二酯键，形成新的重组DNA分子；接合由复制叉上不连续复制链上产生的缺口；缝合DNA损伤修复、遗传重组及DNA链剪接中缺口。,2023年3月26日3时41分,21,2.影响DNA连接酶作用的因素,对黏性末端的连接效率远高于对平末端的连接；,2023年3月26日3时41分,22,连接黏性末端的温度一般在415；,连接酶的用量，平末端连接用量高；,ATP浓度一般为0.011 mmol/L;,载体分子与插入片段的摩尔数比为1:101:3。,三、DNA聚合酶,能够催化以DNA或RNA为模板合成DNA的反应，把脱氧核

10、糖核苷酸连续地添加到双链DNA分子或引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。,（一）大肠埃希菌DNA聚合酶,（二）Klenow片段,具有53聚合酶，53 及35核酸外切酶活性。,具有53聚合酶，35核酸外切酶活性。,2023年3月26日3时41分,23,（三）Taq DNA聚合酶/Pfu DNA聚合酶,（四）反转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶。,Pfu DNA聚合酶是最常用的高保真DNA聚合酶之一。有35 核酸外切酶活性。,Taq DNA聚合酶是被发现的第一个耐热的、依赖DNA的DNA聚合酶，最佳反应温度为7075。有53聚合酶，53 核酸外切酶活性，但无35 核酸外切酶活性。对Mg2+浓

11、度非常敏感。,普遍使用的是来源于AMV(鸟类成髓细胞白血病病毒)及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)的反转录酶，具有53聚合酶活性。,2023年3月26日3时41分,24,（一）末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase）,四、其它修饰酶,是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3-OH末端上。,(1)底物是单链DNA或有3突出末端的双链 DNA。,2023年3月26日3时41分,25,(2)底物是3平端或3凹端的双链DNA。,用途：,（1）主要作用是在载体或目的基因 3末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末

12、端，便于DNA重组。,（2）DNA 3末端的同位素标记。,2023年3月26日3时41分,26,（二）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）,能特异地切除DNA和RNA上5-磷酸基团。,（三）多核苷酸激酶（polynuleotide kinase）,又称T4多核苷酸激酶，能催化ATP的-磷酸基团转移到DNA或RNA片段的5-OH末端。,2023年3月26日3时41分,27,重组DNA技术中常用的工具酶,第三节重组DNA技术中常用载体 Common Vectors in Recombinant DNA Technology,2023年3月26日3时41分,29,学习要求：,掌握质

13、粒载体的概念和特点，了解各载体的应用。,载体（vector）的概念,克隆载体(cloning vector),表达载体(expression vector),是在克隆载体的基础上，增添了与宿主细胞相适应的强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。,含有复制起始点oriC，可使插入的外源DNA序列被扩增或保存的载体。,指能携带外源DNA分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具。,2023年3月26日3时41分,30,含有复制起始点，具有自主复制的能力；,具有较高的遗传稳定性。,拷贝数较多，易与受体细胞的染色体DNA分开；,分子质量相对较小，以容纳较大的外源DNA；,具有一个以上的选择性

14、遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；,具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；,克隆载体应具备的基本条件：,2023年3月26日3时41分,31,重组DNA技术中常用载体：,一、质粒载体：最常用的目的基因克隆载体,粘粒载体：用于克隆大片段DNA(自习),M13噬菌体载体：用于Sanger双脱氧DNA测序(自习),二、噬菌体载体：构建基因组DNA或cDNA文库(自习),四、病毒载体：包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物病 毒用于在真核细胞中表达目的蛋白(自习),三、人工染色体载体：用于更大DNA片段的克隆(自习),2023年3月26日3时41分,32,一、质粒(plasmid)载体,质粒存在于细菌染色质

15、以外，具有自我复制能力的双链环状DNA。小的约23kb,大的数百kb。,严紧型质粒（stringent plaxmid）,松弛型质粒（relaxed plaxmid）,Ampr,ORI,Tetr,（一）pBR322质粒载体：一种克隆载体,ORI：,Ampr,Tetr：,两个抗性基因，用于筛选阳性克隆。,Pst I,BamH I：,两个酶切位点，用于插入目的基因,复制起始点，保证高拷贝自我复制。,2023年3月26日3时41分,34,（二）pUC质粒载体系列,Ori,分子量更小,拷贝数更高,2023年3月26日3时41分,35,（三）其它质粒载体,1.能在体外转录克隆基因的质粒载体,由pUC系列

16、质粒载体派生而来，带有来自噬菌体T7、SP6的启动子，为RNA聚合酶的附着提供了特异性识别位点。如pGEM-3Z/4Z.,2.穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）,是一类人工构建的，具有两种不同复制起始点和选择标记，可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。,2023年3月26日3时41分,36,（四）TA克隆载体,许多耐热的DNA聚合酶(如Taq、Tth等)扩增时，都在PCR产物3-末端加上了A碱基。,TA克隆载体是专为克隆PCR产物而设计的，在其MCS两侧的3-末端携带有未配对的T碱基的载体。,2023年3月26日3时41分,37,在连接酶的作用下可直接将PCR

17、产物克隆到TA载体中。,gt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆),EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建),可容纳7 kb以下的外源片段。有供外源基因片段插入的单一内切酶位点。,可容纳923kb的外源片段。有两个或两组内切酶位点，供外源基因片段插入替代。,（一）噬菌体载体,可插入的外源 DNA片段大，感染效率远高于质粒载体的转化效率。,2023年3月26日3时41分,38,二、噬菌体载体（自习）,三、人工染色体载体（自习）,酵母人工染色体载体，简称YAC载体，由酵母染色体、酵母2mDNA质粒的复制起始序列等元件衍生而成；可插入100kb2,000kb外源DNA片段，是人

18、类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。,细菌人工染色体载体，简称BAC载体，以细菌F因子为基础构建而成；可插入100kb300kb外源DNA片段，是人类基因组计划中序列分析采用的主要载体。,2023年3月26日3时41分,39,常用于构建载体的RNA病毒（整合型）：,逆转录病毒(retrovirus,RV)慢病毒(lentivirus):也属于RV家族,常用于构建载体的DNA病毒（游离型）：,腺病毒(adenovirus,Ad)腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)埃-巴二氏病毒(Epstein-B

19、arr virus,EBV)痘苗病毒(vaccinia virus),四、病毒载体（自习）,2023年3月26日3时41分,40,第四节目的基因的获得和体外重组Target DNA Acquirement&Recombinant In Vitro,2023年3月26日3时41分,41,学习要求：,熟悉目的基因的获取方法、重组DNA分子的构建。,（一）化学合成法,*已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,2023年3月26日3时41分,42,*避免使用稀缺密码子，及宿主细胞的密码偏好。,反转录,AAnA,TTnT 5,5,mRNA,反转录酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,核糖核酸酶H

20、,TTnT,3,DNA poly I,cDNA,核酸酶S1,双链cDNA,3,5,3,5,5,加热变性,加入特异性引物,DNA聚合酶,重复上述步骤,扩增出大量的产物,聚合酶链式反应,退火,延伸,（二）PCR或RTPCR,gDNA文库：g-文库,cDNA文库：c-文库,方法：,用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。,2023年3月26日3时41分,44,（三）从基因文库中筛选,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶，15C,二、目的基因的体外重组接,（一）黏性末端连接,1.同一限制酶切位点连,Eco R切割位点,Bg l切割位点,2.不

21、同限制酶切位点连,2023年3月26日3时41分,46,（二）平末端连接,2023年3月26日3时41分,47,Eco R,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,(三）人工接头(linker)连接,2023年3月26日3时41分,48,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶+dATP,末端转移酶+dTTP,（四）同聚物加尾连接,2023年3月26日3时41分,49,PCR扩增,+,连接,转化,蓝白筛选,Taq酶,(五）T-A克隆,2023年3月26日3时41分,50,2023年3月26日3时41分,51,Inpor

22、ting,Screening&Verification of Recombinant DNA,第五节重组DNA分子的导入和筛选鉴定,学习要求：,熟悉重组DNA分子引入宿主细胞、筛选以及一些常用的分子生物学技术检测。,一、重组DNA分子的导入 转,宿主细胞应具备的特征：,处于感受态,对载体无严格限制,限制酶和重组酶缺陷,不对外源DNA进行修饰,能表达重组体所提供表型特征,将体外构建的重组DNA分子导入用于复制、扩增和表达的原核或真核受体细胞。,2023年3月26日3时41分,52,（一）转化(transformation)指将质粒DNA或以质粒为载体构建的重组DNA导入细菌（原核细胞）的过程。如

23、大肠杆菌K12突变株经低渗CaCl2,0处理进入感受态。DH5,（二）转染(transfection)指将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的重组DNA 分子导入真核细胞的过程。,（三）感染(infection)指以噬菌体或病毒载体构建的重组DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体或病毒颗粒后，通过感染宿主细胞而将重组DNA注入细菌或真核细胞的过程。,2023年3月26日3时41分,53,1.磷酸钙介导的转染2.DEAE-葡聚糖介导的转染3.脂质体转染4.电穿孔转染5.显微注射,（二）转染(transfection),2023年3月26日3时41分,54,非转化细胞(不能生长）,1.根据载体的耐药性

24、标记筛选,（一）根据重组载体的遗传表型进行筛选,二、重组DNA分子的筛选与鉴定 筛,2023年3月26日3时41分,55,重组质粒,目的基因与pBR322经BamH I酶切后进行重组,2023年3月26日3时41分,56,2.根据载体的耐药性标记插入失活选择,A typical bacterial transformation experiment.,BamH I切割目标基因。,pUC质粒载体 插入了半乳糖苷酶N端肽片段的编码基因lac Z；产物肽也无活性，也不能分解培养基中的X-gal。,DH5a宿主菌染色体插入了半乳糖苷酶C端的肽片段的编码基因lacM15；产物肽无活性；不能分解培养基中的

25、X-gal。,有活性的半乳糖苷酶由肽和肽互补(互补)而成，可使培养基中的X-gal分解形成蓝色化合物而出现蓝色菌落。,2023年3月26日3时41分,58,5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal),3.根据-半乳糖苷酶显色反应筛选,2023年3月26日3时41分,59,-半乳糖苷酶（+）,白色,蓝白斑筛选：,蓝色菌落：阴性克隆;白色菌落：阳性克隆,2023年3月26日3时41分,60,蓝白斑筛选,标志补救,4.根据筛选插入的外源基因的性状进行筛选,2023年3月26日3时41分,61,-核酸外切酶,(二)限制性内切酶酶切电泳鉴定,(四)PCR,(三)核酸分子杂交法,是从基因文库中挑选含有

26、目的基因的阳性克隆的常用方法。,根据MCS两侧的保守序列设计引物，对提取的重组载体进行PCR扩增鉴定，并可直接进行测序。,2023年3月26日3时41分,62,(五)免疫化学检测法,利用特异性抗体与目的基因表达的蛋白质相互结合通过放射免疫、化学发光来筛选转化菌。,用插入点的限制酶酶切重组DNA，行琼脂糖凝胶电泳，观察目的基因和载体的泳带是否存在。,重组DNA技术操作的主要步骤,载体,目的基因(外源基因）,2023年3月26日3时41分,63,2023年3月26日3时41分,64,Exogenous Gene Expression,第六节,学习要求：,了解外源基因的表达。,外源基因的表达,表达体

27、系的建立包括技术和策略：,外源基因表达涉及目的基因的克隆、扩增，转录、翻译，蛋白质产物的加工修饰，以及分离、纯化等过程，需要在适合的表达系统中完成。,表达系统可根据受体细胞的不同分为原核表达系统和真核表达系统。,2023年3月26日3时41分,65,表达载体的构建；受体细胞的建立及表达载体的导入和表达；表达产物的分离、纯化等。,（一）对外源目的基因的要求,外源真核基因不能带有5端非编码区和内含子结 构，必须用cDNA或化学合成基因；,外源基因必须置于原核细胞的强启动子和SD序列 等元件控制下；,重组载体必须形成正确的开放阅读框架；,外源基因转录生成的mRNA必须相对稳定并能被有 效翻译，所表达

28、的蛋白质产物稳定且对宿主菌不 能有毒害作用。,2023年3月26日3时41分,66,一、外源基因在原核系统中的表达,-大肠杆菌（E.coli）表达体系最常用,（二）对原核表达载体的要求,在MCS的上下游分别加上强启动子和转录终止区，与插入的目的基因组成转录单位。,在MCS的上下游分别加入RBS、起始和终止密码，与插入的目的基因组成翻译模板。,含多克隆位点PCS，以利于外源基因插入。,2023年3月26日3时41分,67,是在克隆载体的基础上，加上可使插入基因在宿主细胞中表达所需的必要元件，如启动子、终止子、核糖体识别位点、起始密码和终止密码等。,2023年3月26日3时41分,68,DNA聚合

29、酶,RNA聚合酶,（三）外源基因在原核细胞中的表达方式,融合型表达蛋白：将外源目的基因与另一基因拼 接成融合基因，表达融合蛋白(fusion protein)。,非融合型表达:外源目的基因不与其他基因融合，直接从起始密码AUG开始在原核调控元件控制下 表达蛋白质。,分泌型表达：将外源目的基因与信号肽编码序列 拼接成融合基因的表达方式。,*包含体(inclusion body)：高效表达时蛋白质致密地集聚在细胞内形成的一种水不溶性结构。,2023年3月26日3时41分,69,优点:,2023年3月26日3时41分,70,（四）优缺点,培养简单、迅速、经济而又适合大规模生产。,只适于表达cDNA，

30、不适于真核基因组DNA；,真核蛋白常不能形成正确的折叠和修饰；,真核蛋白常以无生物活性的包含体形式存在；,难以实现大量分泌性蛋白的表达；,真核蛋白易被细菌蛋白酶降解；,原核细胞周质中常含有种类繁多的内毒素。,缺点:,（一）真核表达系统的优缺点,优点：,可表达克隆的cDNA或真核基因组DNA；,可进行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰，可形成正确的天然构象；,可将表达产物直接分泌至细胞培养基中。,缺点：,操作技术难、费时、费钱。,2023年3月26日3时41分,71,二、外源基因在真核细胞中的表达,真核表达系统是指在真核细胞中表达外源基因的体系。主要有酵母表达系统(毕赤酵母)、昆虫细胞(杆状病毒)、哺

31、乳动物系统和高等植物系统。,含有原核克隆载体的复制子、抗性筛选基因和 MCS等序列；,含有真核细胞的启动子、增强子、剪接信号、转录终止信号和PolyA化信号及遗传选择标记 等组件。,2023年3月26日3时41分,72,（三）外源基因导入和转染细胞的筛选,1.导入真核细胞的方法 病毒感染（天然方法）载体转染（化学或物理方法）,2.常用的筛选方法有 新霉素抗性选择系统 胸苷激酶基因HAT选择系统 二氢叶酸还原酶基因选择系统,2023年3月26日3时41分,73,（四）外源基因在真核细胞中的表达,瞬时表达（不与宿主染色体整合）瞬时表达宿主细胞常用来源于非洲绿猴肾CV-1细胞株的COS细胞；载体多为

32、DNA病毒构建的载体。,稳定表达（整合至宿主染色体中）稳定表达宿主细胞常用来源于中国仓鼠卵巢的CHO细胞；载体多为RNA病毒构建的载体。,2023年3月26日3时41分,74,2023年3月26日3时41分,75,第七节重组DNA技术的应用,Application of recombinant DNA technique,自习,学习要求：,了解重组DNA技术的应用。,重组DNA技术的主要应用,(1)克隆目的基因，研究疾病相关基因的结构与功能，分析疾病发病的分子机制；,(4)利用定点突变技术，研究蛋白质的结构与功能，或对蛋白质进行结构改造；,(5)开发基因工程药物与疫苗用于疾病治疗。,(2)利用转基因技术和基因剔除技术研究基因功能，建立转基因动物模型；,(3)建立基因鉴定、诊断与基因治疗的新方法；,重组DNA医药产品,