BD FACSCalibur中文操作手册DNA分析.doc

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1、第七章 DNA分析7.1 概述流式细胞仪分析大量细胞的细胞周期和DNA倍体已经成为一种日益重要的肿瘤研究方法，并已广泛应用于肿瘤基础和临床研究中，为肿瘤的诊断，疗效评价和预后预测提供了重要的参考指标。7.1.1 细胞周期正常人静止体细胞有46条染色体，相当于7.10-12 pg DNA/细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期（G0，G1，S，G2 ，M）的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化：在G1期，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体；进入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间；当DNA复制

2、结束成为4倍体时，细胞进入G2期，G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1，S，G2/M期。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M/%，了解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。正常细胞具有较恒定的DNA含量，而细胞癌变过程中结构和/或染色体的

3、异常是很常见的。这种变化在流式分析中以DNA倍体指数的形式表现出来，这一指数对于肿瘤的早期诊断，交界瘤、间叶组织肿瘤的良恶性判断提供了重要的辅助指标。应该注意的是，只有在染色体数目的变化带来的DNA含量差异可被检测时，才可能有DNA异倍体的检出。因此DNA含量的不异常不能除外恶性或染色体异常的存在。另外，正常细胞在衰老过程中的多倍体化以及肿瘤治疗后导致的DNA含量的增加、凋亡和坏死导致的DNA含量降低都是在分析DNA直方图时需要考虑的因素。7.1.2 DNA检测的常用术语Coefficient of Variation（CV）：变异系数。不同细胞群体DNA含量的细微差别可能有生物学上的重要意义

4、，因此DNA含量的流式分析中分辨率或精确度尤为关键。通常检测分辨率或精确度由G0/G1峰的CV来反映。 %CV=（SD/mean）x 100。影响CV的因素主要包括两方面：仪器因素（如液流、光路、机器调试等）和样本制备及染色过程对标本的人为影响。所谓优化DNA分析条件就是指最大程度地减少这两大因素带来的变异。（参考附录1）DNA index（DI）：DNA指数。DI指的是肿瘤样本G0/G1峰的平均道数与人正常二倍体G0/G1峰的平均道数之间的比值。DI为1 意味着二倍体（2c）。Ploidy：倍体。原指染色体数目。流式中用来描述总的DNA含量。二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常

5、。DI为1.9-2.1 的细胞为四倍体（CV为5%时）。在二倍体和四倍体区域之外的统称异倍体。DI值应随着仪器线性度的任何变化而进行纠正（详见后述）。7.1.3 影响流式DNA分析的因素分辨率（CV）DNA流式分析中的分辨率（或精确性）非常重要，因为细胞群体之间DNA含量的细微差别可能有显著的生物学意义。通常，分辨率由标准微球DNA分布中的G0/G1峰的变异系数来反映。%CV=（SD/Mean）X100仪器因素（如液流、光路调试和光学元件等）、样本制备和染色过程带来的人为因素都可能影响检测的精确性。评估真正的生物学意义上的DNA含量差别因而具有更重要的价值。如何最大限度地减少样本制备和仪器因素

6、带来的变异是DNA分析条件最佳化的根本所在。DNA直方图中峰的CV越低，质量越好，从图中可能获得的信息越多。新鲜标本的CV常比石蜡包埋的标本好。新鲜标本的CV常=3%，而石蜡包埋的标本CV则取决于组织病理实验室的具体操作方法，通常可得到=5%。当G1峰的CV=8%时，不再合适估计S期比例。线性度在DNA含量分析中，G2+M峰的道数值应该是G0/G1峰的两倍。G0/G1峰和G2+M峰的位置提供了比较其他峰位置的基准。若G2/M 与G1的比值不是1.95-2.05, 放大器的线性度则需要检查。必要时应进行适当的调节（通常是放大器的offset调节有误）。碎片较多的碎片会干扰S期的计算，也会妨碍分析

7、较小的亚二倍体峰。若较多碎片成为一个常规问题，应重新评估样本采集和制备过程。有时，大量的坏死或凋亡细胞也会带来过多碎片。细胞双粘体双粘体是指一起通过激光照射区而被错误地记录为一个细胞的两个细胞或颗粒。在DNA 分析中，两个具有2N DNA含量的细胞同时通过激光照射区，即被记录成一个4N的荧光信号，造成4N的细胞增多的假象。BD公司通过专利的双粘体辨别模式（Doublet Discrimination Module，DDM）来有效地区分单个细胞和聚集细胞，用设门来排除聚集细胞的干扰。大量的细胞聚集体是较差的样本制备的指征。应在样本制备时尽量避免。7.2DNA质量控制（DNA QC Particl

8、es）BD的DNA质量控制试剂盒为FACS系列和其他品牌的流式细胞仪提供了一种检测和评价仪器性能的方法，尤其适用于DNA检测时的质量控制要求。这个试剂盒包括4种试剂：试剂A是小鸡红细胞核（CEN），用于建立测试条件，例如PMT的电压和放大器的放大倍数，同时提供有关仪器线性度和分辨率的信息。CEN试剂经过特殊处理而成，包括单个核，双联体核，三联体核和更大的聚集体，用来检测仪器的线性度和分辨率。PI染色后，由于这些细胞核聚集程度的不同，在FL2-A或FL2-H的直方图中会出现至少4个峰，而前4个峰分别代表单个核，双联体核，三联体和四联体。若染色正常，仪器的线性度良好，则后三个峰所在道数的平均值与第

9、一个峰值的比值应接近于2，3，4。试剂B是小牛胸腺细胞核（CTN），它具有一个完整的细胞周期，因此不仅可以检查DDM或脉冲处理器是否工作正常，还可作为细胞周期统计分析的质控。CTN具有细胞周期的各个时期，大部分核处于G0/G1期，小部分处于S期和G2/M期。两个粘连起来的G0/G1期细胞核可以通过DDM与单个G2/M期细胞核区分开来，DDM的功能就是将双联体细胞核或其它聚集体与单个细胞核区分开来，以确保G2/M期的比值有意义。试剂C是2um的荧光微球，作为一种稳定的非生物标准品来确认仪器的CV。2um的荧光微球在FL1和FL2两个通道都可接受到光信号，因此它可脱离开染色和样本制备的过程来检测仪

10、器的性能，如果CEN和CTN的信号峰的CV值大于我们的建议值，最好做2um的微球来确定是生物样本的问题还是仪器本身的问题。试剂D是核酸染料PI。7.2.1 样本制备CEN轻轻摇匀后，吸取40ul CEN到1mL的PI中，混匀，室温避光放置10分钟，即可上机。CTN大力震荡试剂瓶，吸取40ul CTN到1mL PI中，混匀，室温避光放置10分钟即可上机检测。2-um微球大力震荡试剂，挤一滴微球到1mL 0.2um滤膜滤过的PBS中，混匀后即可上机。7.2.2 上机检测1) 双击DNA Experiment Document file这是一个3页的Document file，第一页包括一个散点图（

11、FL2-WFL2-A），两个直方图（FL2-A和FL2-W），两个直方图统计框，用来获取分析CEN；第二页包括一个散点图（FL2-WFL2-A），一个直方图（FL2-A）和一个直方图的统计框，用来获取分析CTN；第三页是个简单说明，指导您如何建立获取DNA的条件。需要指出的是，在DNA Experiment Document file中所有的图都是AcquisitionAnalasis模式的图，即获取一旦结束，自动进入分析模式。如果您找不到DNA Experiment Document file，可以在CellQuest中按照上面的描述自己建立。2) 在Acquire菜单下选择Connect

12、to Cytometer3) 在Cytometer菜单下选择Instrument Setting，下载合适的获取条件。路径为：HDBD ApplicationDNA QC4) 确定文件名及保存位置5) 上CEN管，保持低速跑样，注意观察FL2-A的直方图，调节FL2的电压，使得CEN单个细胞核的DNA峰位于2005的道数上；再看FL2-W的直方图，调节FL2-W放大器的倍数，使得CEN单个核峰也为与2005的道数上。6）收集10000个粒子，取下CEN管，放回蒸馏水。7） 调节FL2-A直方图中M1，M2的位置，使其刚好位于前两个峰，通过FL2-A直方图统计框中M1，M2的平均值来计算M2/M

13、1的比值，应在1.95-2.05之间；而M1的CV值应小于或等于3.00%。8） 同样条件收集10000个CTN细胞核，注意观察FL2-WFL2-A散点图，单个细胞核与双联体细胞核能否区分，以此来判断DDM是否工作正常。由于CTN有完整的细胞周期，因此对于不同批号的CTN，我们都附有各个时期的参考标准值，您可用ModFit来分析您获取的CTN，将得出的各个时期的比例与参考值做一比较，样本的制备，条件的设置和分析方法的不同，都可能带来结果的差异。9） 如果您得到的任何一个峰的CV值都超过了标准，我们建议您用2-um的微球来检测仪器的CV是否正常。在CellQuest中建立一个FL2-A的直方图（

14、AcquisitionAnalasis模式）及直方图的统计框，调节FL2的电压，使得单个微球的峰值在2005的位置，收集10000个微球，取下bead管，放上蒸馏水；将M1放在第一个峰上，检查CV是否小于或等于2.3%。10） DNA质控做完后，您可将仪器的设置及所用的图或统计框都保存起来，以便下一次使用。7.2.3 常见错误排除问题原因解决方法 计数率太低仪器堵塞；仪器没有调试好；样本过于稀释实施每日维护；参考仪器使用手册；准备新的样本无法设置PMT的电压和放大器的倍数CEN太多或太少；PI染料变质；CEN单个细胞核的门太宽重新制备CEN；更换PI染料；重复调节屏幕以获得一个新的门CV值增加

15、样本或PI 变质；流速设成HI；液流中有气泡制备新的样本；将流速改回LO；除去空气泡从FL2-W上看不到单个核与双联体的分界FL2-W太低；样本或PI变质重新调节FL2-W的放大倍数；制备新的CEN，CTN或更换PI染料7.3 用CellQuest 软件获取DNA 数据7.3.1样本制备l 样本收集和制备细胞悬液 从组织培养或体液中获得的细胞悬液也可用于DNA分析1. 将细胞悬液装入17100-mm的管中2. 室温300g离心5分钟3. 吸去上清夜，加入1ml缓冲液重悬细胞4. 室温300g离心5分钟5. 重复步骤3，46. 吸去上清夜，加入1ml缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度到1.0106细胞

16、/ml7. 染色，上机分析；或冷冻以待日后检测实体组织 （若是冰冻组织，先复温到室温）准备样本收集管，做好标记，每管加入1ml柠檬酸盐缓冲液1. 对于小于0.5cm的样本：将肿瘤组织样本放入透析袋中，折叠两次或以上，折叠时注意侧线平行，然后将四角折叠用针头或不锈钢大头针固定于聚苯乙烯泡沫塑料盒中。这时肿瘤组织已固定封闭，可以进行抽吸了。2. 对于大于0.5cm的样本：将肿瘤组织直接黏附于聚苯乙烯泡沫塑料盒中即可。细针穿刺技术在病理学家的指导下选择适用于细针穿刺的肿瘤组织，对于每一种不同的组织请用新的注射器和针头以免交叉污染。若样本不立即处理，请冰冻保存。1. 将注射器安装在支持物上，并连上25

17、-gauge1.5-inch的针头。2. 将针尖插入到肿瘤组织中，安置好后，将注射器的活塞轻轻向后拉形成一段真空。对于大的组织，应尽可能多地使针头穿过组织的不同部位，以保证能收集到不同种类的细胞；而对于小的组织块，应尽可能多地吸取样本。3. 当针头中（不是注射器筒）可看到有物质出现时，抽出针头。4. 小心地将细胞注入1ml缓冲液中，清洗针头，尽可能多的回收细胞。清洗时注意缓冲液不要吸入到针筒中。5. 针头中残余足够多的细胞悬液（大约2滴）可用于制作细胞切片，若样本量允许，还可制作组织病理切片。6. 重复步骤2-4，计数细胞，使得柠檬酸缓冲液中的细胞浓度达到1.0106细胞/ml，以保证足够制备

18、测试管和对照管样本。冷冻技术若样本不是立即进行染色分析，请将细胞悬液转移到耐低温的聚丙烯管中，用带螺纹的盖子盖紧，在干冰和99%酒精的混合物中迅速冷冻，保存于-80中。下次分析时，将样本取出，37水浴解冻，注意不要让样本直接接触37。l DNA 试剂盒组成：试剂A（10ml）含有胰蛋白酶，四氢氯化精胺去污剂，可用于分离实体组织片段，消化细胞膜及细胞骨架。试剂B（8ml）含有胰蛋白酶抑制剂，RNA酶，柠檬酸盐缓冲液，四氢氯化精胺。用于抑制胰蛋白酶的作用并消化RNA。试剂C（8ml）含有PI染液，四氢氯化精胺，柠檬酸盐缓冲液。PI作用时的最终浓度至少有125ug/ml。缓冲液（3瓶，50ml/vi

19、al）含有柠檬酸钠，DMSO用于收集和（或）冷冻细胞悬液l 染色过程1 染色时要求样本的细胞浓度为5.0105，同时应制备一管待测样本和外周单个核细胞（PBMC）的混合管作为对照管，肿瘤细胞和PBMCs的比率至少是2：1；2室温离心细胞悬液，400g，5分钟，除去上清夜；3每一管加入250ul A液，轻轻混匀，不要震荡，室温静置10分钟；4每一管加入200ul B液，轻轻混匀，不要震荡，室温静置10分钟；5每一管加入200ul C液，轻轻混匀，不要震荡，低温（2-8）避光静置10分钟；6用50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞；7低温避光放置以待上机检测。建议在加入C液后3小时内上机，上

20、机前轻轻混匀细胞悬液。对照用于对照的细胞是已知DNA含量的细胞（例如外周血单个核细胞），它为测试样本的DNA指数提供了一个参照。对照细胞应在染色前加入到待测样本中，并与待测样本染色步骤完全一样。732用CellQuest 软件上机获取数据做样本的倍体性和细胞周期分析时，建议做三管平行分析管：一管二倍体标准品，一管未知样本与二倍体标准品的混合样本，以及一管未知样本。对于肿瘤样本来说，理想的二倍体标准品是与其组织类型相同的正常组织。另一个二倍体标准品是外周血单个核细胞（PBMCs）。在下面的练习里，要求您使用PBMC作为二倍体标准品，检测一个细胞系，进行实验的获取工作。使用PI进行细胞染色，用FL

21、2-A直方图做DNA含量分析。同免疫表型分析一样，在做DNA样本数据获取之前，先要做仪器获取条件的优化，并执行获取前的步骤。仪器获取条件的优化保证了流式细胞仪获取条件适合于待测样本。做优化的第一步，使用DNA QC文件夹里的PBMC Experiment Document文件，在FL2-A直方图中，将PBMC细胞群设定在200道的位置。建议收取DNA指数在0.1C-6C范围内的细胞，因此，将二倍体标准细胞设定在200道的位置，可以满足此要求。另外，您需要建立一个点图，以确定FL2-W的设定达到最佳条件。实际上，您应该保证样本中的所有细胞的每一个参数都可以被合理地检测到。最后，您可以开始获取样本

22、数据，并将文件自动保存到磁盘上。实验室练习：DNA获取条件的优化以及数据的获取此练习中，假设您已经完成了练习1（DNA QC实验），此时，FACStation处于连机状态，并已加载了仪器获取条件。1. 打开PBMC Experiment Document文件。此文件位于DNA QC文件夹中。一页大小的文件包括一个FL2-A直方图，及直方图的统计结果。2. 画一个FL2-W vs FL2-A acquisition-analysis点图。将统计框拖到直方图下方，在直方图右侧画点图。3. 从Acquire菜单上选择Parameter Discription（参数描述）命令。屏幕上显示Paramet

23、er Discription对话窗口。4. 在Parameter Discription对话窗口中点击Folder（文件夹）。屏幕上显示地址对话框。保存文件到您指定的文件夹中。5. 点击Select 文件夹名称命令。Parameter Discription对话窗口被激活。6. 在Parameter Discription对话窗口中点击File（文件）。屏幕上显示File Name Editor（文件名编辑器）窗口。确定File Name Prefix（文件名前缀）设定为Custom Prefix（自定义前缀）、File Count（文件计数）设定为1。7. 根据要求，在第一行Custom P

24、refix栏内输入文件名前缀。8. 点击OK。9. 关闭Parameter Discription对话窗口。10. 确定Acquisition Control窗口中的Setup选项已选择打勾。11. 将流式细胞仪的液流速度置于LO的位置，仪器设定在RUN模式，将PBMC样本放在加样针处，支撑臂处于合位。12. 点击Acquire（获取）。此时，您可以检查上样情况，如有必要，可以调整获取条件。13. 在Cytometer菜单下选择Detectors/Amps，打开Detectors/Amps窗口。14. 调整FL2 PMT电压，使PBMC细胞群位于道数2005的位置。检查直方图统计框中的Mean

25、值，帮助调整细胞群在直方图中的位置。如有需要，可以随时点击Pause（暂停）和Restart（重新开始），更新显示屏幕。15. 将PBMC样本从上样针处移下，换上含有未知样本与PBMC的混合样本。16. 检查FL2-W vs FL2-A点图，改变FL2 PMT电压，调整待测细胞在图中的位置。17. 在Acquisition Control窗口中，先点击Pause，然后再点击Abort（放弃）。18. 将混合样本从上样针处移下，换上含有PBMC样本。19. 在Acquisition Control窗口中，去除Setup选择。现在，您可以准备获取实验管的细胞数据了。20. 点击Acquire（获取

26、）。PBMC管的数据文件将按照前面的输入路径，自动保存到规定的文件夹下面。注意PBMC实验的平均荧光强度（Mean）和CV。PBMC或其它二倍体标准品是染色过程的质控品，应每天检查它的CV，确保有较好的精密度，并可以用来评估试剂的一致性。21. 获取完PBMC管后，获取PBMC与肿瘤细胞的混合管，最后再获取肿瘤细胞管。获取时注意不要改动获取条件。22. 获取条件单独保存为一个文件。733质量控制为了得到可信的结果，BD建议您用DNA QC Particle来设置PMT的电压，检测仪器的分辨率，线性度以及双联体识别器的工作情况，具体内容请参考DNA QC Particle说明书。BD建议您每测一

27、个样本都相应地制备一个对照。在做DNA分析的获取时，为了得到较低的CV值，建议您使用低速跑样，获取速率至少为60个细胞/秒。更换样本时，让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沉积到流动室中。直方图必须用专门的分析软件来分析。BD建议您每一个样本至少获取20000个细胞数，若样本中含有一些小的细胞群体，则需要更多的细胞数。734常见错误 问题原因 解决方法二倍体G0/G1峰位置突然改变或缓慢漂移液流系统中有气泡或阻塞物；鞘液和样本液的弹性不一致；PI染色不够；PI孵育的时间不够冲洗管路，清除气泡检查鞘液的质量检查细胞核的浓度并调整增加孵

28、育时间在荧光的直方图中碎片过多原先的样本坏死较多；细胞裂解不完全；鞘液中颗粒太多肉眼检查组织是否坏死太多；检查悬液是否裂解不彻底；清洗系统，更换鞘液或鞘液滤器峰宽；CV值增大流速太高；液流中有气泡；样本中有过多的坏死细胞使用低速跑样；检查液流中有无气泡；检查是否有坏死细胞的存在，重新准备样本荧光强度的减弱带来的峰的漂移太多细胞；DNA染色不饱和；进样针中残留有漂白剂调整细胞核的浓度到合适的状态；选择合适的PI的浓度和体积，重新制备样本；确保漂白剂冲洗后，在用蒸馏水彻底清洗细胞数很少或没有样本管不合适上样；样本中没有细胞核；进样针堵了；流动室中有碎片更换样本管或检查样本管有无裂缝；用显微镜检查样

29、本中有无细胞核；反冲清洗进样针；将流式细胞仪从RUN切换到STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沉积到流动室中。74 用ModFit 软件分析DNA数据ModFit 是由美国Verity Software House公司设计，专门用于流式细胞术中进行细胞周期分析的软件。它通过对DNA含量直方图进行曲线拟合，能快速计算出各种倍体细胞的含量、细胞周期各时相及亚二倍体细胞所占的比例、DNA指数、G0/G1期峰的变异系数等。此外，2.0版本还增加了“同步化分析”和“增殖分析”的功能，可分别进行同步化细胞和增殖细胞的研究。7.4.1运用ModFit 进行自动分析F 从苹果菜单下进入ModFit

30、 F 在工具栏中点击File，选定所要分析的数据文件，单击OpenF 打开Edit菜单，分别对Debris，Aggregates和Fit Apoptosis Peak进行定义，以便软件根据样本的具体情况选择合适的分析模式用ModFit 进行任何分析之前，都必须定义所要分析的样本的类型，软件本身不能得出任何关于样本的资料，比如说，是新鲜样本，冻存组织还是石蜡切片？有无聚集体？有无凋亡等。F 在工具栏中单击Auto键软件开始自动分析样本，寻找峰的位置，确定倍体，选择合适的分析模式，进行非线性的最小二乘法分析，最后显示结果，而所有这些分析过程仅须几秒钟的时间。F 通过点击工具栏中的Diags键，我们

31、可以检验这次分析的合理性，评估的标准是根据DNA Consensus Conference所提出的来确定的。 可使用自动分析的样本通常比较典型，因此复杂的样本不适合用自动分析。7.4.2运用ModFit 进行手动分析如ModFit 在自动分析过程中无法正确确定峰值的位置或样本的倍型，或者你希望自己选择分析的模式，那么你可以用手动分析来实现。F 在工具栏中点击File，选定所要分析的数据文件，单击OpenF 选择用于DNA分析的参数：FL2-AF 设门。软件最多允许同时设两个门，点击Gate 1或2前的小方框，然后单击Define the Gate，选择合适的X轴和Y轴，将门移动到所要分析的细胞

32、群上，单击OKF 单击工具栏中的Mod键或选择Analysis菜单中的Choose Model在这个对话窗口中需要你来描述你所得到的样本的信息，比如说，样本的类型，有无异倍体等。每一个有关的资料都会影响到最终分析模式的选择。 选择碎片拟合的模式：新鲜/冻存，石蜡切片，没有碎片（不进行碎片分析）； 选择倍型：异倍体，二倍体，四倍体； 若有异倍体，则须确定是一个还是两个异倍体； 选择细胞聚集体分析模式：有聚集体，没有聚集体，或自动检测（软件自行判断有无需要拟合聚集体）； 选择是否拟合二倍体的S期：如异倍体的G0/G1期峰与二倍体G0/G1期峰明显分开,我们对每一个细胞周期的S期都能够进行拟合，则选

33、择Fit Diploid S；如异倍体的G0/G1期峰与二倍体G0/G1期峰靠得非常近，则选择No Diploid S； 选择能否看得见明显的G2/M期峰：Visible G2/M，Indistinct G2/M（软件将自动把G2/M期峰的位置固定在两倍于G0/G1期峰的位置； 选择是否拟合凋亡：Fit Apoptosis，No Apoptosis； 选择有无标准参照物：No Standards，One Standard，Two Standards； 根据这些资料，软件选择分析的模式并将其显示在对话窗的下部； 单击OK确认并关掉对话窗。F 软件打开分析模式，确认每个峰所在的位置，并将Range

34、放置于不同的峰上如若软件对于各个峰的确认不太正确，你需要移动Range，将其放在正确的位置：将E1 Range放置在碎片峰的起始；确认D1 Range是否在二倍体的G0/G1期峰上，这个Range不一定将整个峰都包括在内，只要在峰的中心位置即可；移动A1 Range将其放置在异倍体G0/G1峰的中心位置；移动D2 Range将其放置于二倍体G2/M期峰的中心位置或是两倍于G0/G1期峰的位置；移动A2 Range将其放置两倍于异倍体G0/G1峰的道数，即异倍体G2/M期的位置；若T1 Range出现，你可以不去移动它的位置，它只是用来激活软件分析聚集体的功能；最后，需要将E2 Range放在这

35、个直方图的最右边，用来识别碎片的终止位置；这样，各个Range都各就各位了，可以开始进行分析了。 单击工具栏中的Fit键，软件开始以最小二乘法来拟合曲线，并进行统计。若这个软件还没有被实验室其他人设置过，那么当你进行分析时，将会出现一个关于S期评估的询问窗口，提供了3个选项：马上设置S期的临界值；以后再提醒我设置S期的临界值；不需要激活S期评估这项功能。若你需要这项评估，你必须输入你们实验室获得的具有统计意义的各种组织的二倍体或者异倍体的S期的临界值，如没有，则不必激活这项功能。 分析完毕后，你需要检查一下分析图，以确保分析模式很好地拟合你的样本，如果不是，最好确定你的分析模式选择是否恰当，以

36、及Range的放置是否正确。此外，还可以点击工具栏中的Diags键来得到关于当前分析结果的一系列评估指标：1) %CV，指的是G0/G1期峰的CV值，最好8%，对于实体组织来说，这个标准比较难达到，但应该尽可能达到，CV值过大，不仅直接影响到S期所占比率的计算，还会给倍体的分析带来困难，因为有可能会掩藏了一个不正常的峰2) Cell#，指的是用于拟合分析的细胞数，不能少于10000个3) RCS，是一个统计学上的指标，用来反应你所选择的这个模式与你的标本的拟合程度，0.9-3.0为比较好的一个范围，而3.0-5.0为可以接受，小于0.8或是大于5.0，都被视为不可接受4) %B.A.D，指的是

37、背景中的碎片和聚集体所占的比率，需小于20%5) 软件还用不同的颜色来代表这些指标的好坏，绿色代表好，黄色代表还可以，红色代表很差或不正常6) 若你激活了S期评估这项功能，软件在Diags中还会相应地进行二倍体，异倍体和总的S期的错误分析，分别计算它们的标准偏差。 单击工具栏中的Report，设置报告的形式你可在报告中随意添加图形，箭头，或是各种不同字体，不同颜色，不同大小的文字，为了节省时间，你还可将设置好的报告以模版的形式保存起来，以后每一次进入ModFIT，就可以先打开报告，在模版的基础上进行分析了。7.4.3 运用ModFIT进行同步化分析2.0版本的ModFIT 软件增加了分析细胞系

38、的同步化程度的功能。 打开Analysis菜单，点击Sync Wizard键，选择Create or edit model这时出现一个对话窗，引导你根据你的样本的特殊性选择不同的分析模式。 首先你要选择的是：重新建立一个同步化分析模式还是修改原有的模式；然后打开所要分析的样本的原始数据； 点击工具栏中的G0-G1键，确定G0/G1期峰的位置，以及标准偏差；软件还允许你锁定峰的位置或是在一定范围内自动调节； 点击工具栏中的G2M键，确定G2/M期峰的位置，或是G2/G1的比值； 点击工具栏中的S-Phase键，选择用于拟合分析S期的图形的形状、数目及图形与图形之间的间隔； 点击Other键，选择

39、是否需要分析碎片和聚集体； 点击Report键，选择报告的内容，例如是否报告所有部分的百分比，是否需要平均值，是否需要G0G1峰的%CV，是否需要关于统计学方面的一些结果等等。7.4.4 运用ModFIT 进行增殖分析ModFIT 2.0可对用跟踪染料染色的细胞系进行增殖状况的研究。 进入ModFIT 软件，点击工具栏中的File键，选择将要分析的数据文件； 选择FL2-H作为DNA分析的参量； 打开Analysis菜单，点击Proliferation Wizard键，选择Create or edit model这时出现一个对话窗，引导你根据你的样本的特殊性选择不同的分析模式。 首先你要选择的是：重新建立一个同步化分析模式还是修改原有的模式； 点击工具栏中的Parent键，确定代表亲代群体的峰的位置； 点击Generations，选择所要分析的子代的数目，样本获取的细胞数，以及子代和子代之间的间隔； 点击Other，选择是否需要分析背景噪音及不对称的细胞分裂； 点击对话窗中的Analysis，软件自动开始分析，并给出结果。结果中包括亲代所占的百分比和平均荧光道数，各个子代所占的百分比和平均荧光道数，增殖指数，非增殖部分的比率，分裂错误指数，子代之间的间隔，背景噪音占的比率，用于分析的细胞数及RCS值等等。