微生物发酵床对猪舍大肠杆菌病原生物防治作用的研究.doc

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1、微生物发酵床对猪舍大肠杆菌病原生物防治作用的研究郑雪芳1，刘波1基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项-华南村镇塘坝地表饮用水安全保障适用技术研究与示范（No.2008ZX07425-002）；福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金（No.STIF-Y03）Supported by the National Key Technology Program for Water Body Pollution Control and Rectification（No.2008ZX07425-002） and the Financial Department of Fujian Go

2、vernment-Science；Technology Innovation Foundation of FAAS(No.STIF-Y03)作者简介：郑雪芳（1977），女，助理研究员,E-mail: zhengxuefang2003；*通讯作者（责任作者），E -mail：fzliuboBiography: ZHENG Xuefang(1977), female, assistant professor, E-mail: zhengxuefang2003; *Corresponding author, E -mail：fzliubo，蓝江林1，苏明星1，卢舒娴1，朱昌雄2，关雄3（1、福建省

3、农业科学院农业生物资源研究所，福州 350003；2、中国农业科学院环境与可可持续发展研究所，北京 100081；3、福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州350002）摘要：【目的】通过调查微生物发酵床养猪基质垫层大肠杆菌及其毒素基因的数量分布变化动态，分析微生物发酵床对猪舍大肠杆菌的生物防治作用。【方法】分离不同使用时间、不同层次基质垫层的大肠杆菌，利用PCR扩增特异性UdiA基因鉴定来检测大肠杆菌，并对大肠杆菌12种毒素基因进行多重PCR检测。构建大肠杆菌种群分布的动态模型，分析微生物发酵床对大肠杆菌病原的生防效果。【结果】从不同使用时间不同层次基质垫层分离鉴定出大肠杆菌

4、419株，并从这些菌株中检测出59株携带毒素基因大肠杆菌，毒素基因为8种。其中基质垫层的毒素基因阳性检出率最高在1个月，为22.47%，其次在7个月，为16.5%,检出率最低的在9个月，为4.23%大肠杆菌在微生物发酵床基质垫层种群数量时间变化规律为：随着使用时间的增加种群数量逐步减少；种群数量空间变化规律为：表层（第1层010cm） 和底层（第4层6070cm）分布量最大，第2层（2030cm）分布量最少。大肠杆菌毒素基因的分布规律与之类似。从构建的大肠杆菌种群分布动态模型可以看出，基质垫层第1层（y=169.67x-1.0137）和第3层（y=313.11x-2.1885）大肠杆菌种群数量

5、随使用时间呈指数线性方程分布；第2层（y=0.1006x3-2.3733x2+16.094x-22.454）和第4层（y=0.3159 x3+6.0913x2-35.634x+79.513）大肠杆菌种群数量随使用时间呈一元三次方程分布，基质垫层能明显抑制大肠杆菌的生长。基质垫层使用后期（第9个月）比使用初期（第1个月）大肠杆菌种群数量明显减少，降低幅度在67.45%96.53%，说明微生物发酵床对猪舍大肠杆菌能起到显著的生物防治作用。【结论】微生物发酵床能抑制大肠杆菌特别是携带毒素基因大肠杆菌的生长，且对大肠杆菌的生防效果随使用时间的延长而增加。关键词：微生物；发酵床养猪；生物防治；大肠杆菌；

6、毒素基因 Study on the biocontrol effects of microbial-fermentation bed on the pig pathogen Escherichia coli in the piggeryZHENG Xuefang1, LIU Bo1*, LAN Jianglin1,SHU Mingxing1, LU Shuxian1, ZHU Changxiong2, GUAN Xiong3(Agricultural Bio-Resources Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Science

7、s, Fujian Fuzhou 350003; 2. Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 3. Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Fujian Agriculture and Forestry University, Ministry of Education, Fuzhou 350002)Abstract

8、: 【Objective】 The present paper dealt with the distribution of Escherichia coli and its virulent genes in the stroma cushion of piggery to clear the biocontrol effects of microbial-fermentation bed on the pig pathogen E. coli.【Method】The bacterium, E. coli isolated from the different period in each

9、layer of the stroma cushion were analyzed by the method of eosin methylene blue (EMB) medium. Polymerase chain reaction (PCR) procedure was applied for identification of E. coli by amplifying UdiA gene DNA fragments of E. coli. MultiplexPCR was used to detect the virulence genes types of E. coli. A

10、simulation model of E. coli distribution was constructed to analyze the biocontrol effect in the microbial-fermentation bed.【Result】The result showed that 419 isolates were detected to be E. coli among 433 suspected isolates, of which 59 isolates carried the special virulent genes. A total of 8 type

11、s of virulent genes were found, including estB, estA, elt, faeG, fedA, aidAI, Stx2e and sepA. In the samples, E. coli in the one-month-used microbial-fermentation bed had the highest positive rate (22.47%), while that in the nine-months-used microbial-fermentation bed had the lowest positive rate (4

12、.23%). The distribution rule displayed that the population of E. coli in each layer decreased as the time increased. The less distribution of E. coli population was accrued in the layer 1, while the largest in the layer 4 as well as the least in the layer 2. The distribution rule of virulent genes f

13、or E. coli was the similar to the distribution rule of E.coli population. From the dymamic model of E. coli population, it could be seen that the E. coli populations in the layer 1 (y=169.67x-1.0137) and the layer 3 (y=313.11x-2.1885) were fitted to the exponential distributions, as E. coli populati

14、on in the layer 2 (y=0.1006x3- 2.3733x2+16.094x-22.454) and the layer 4 (y=0.3159 x3+6.0913x2-35.634x+79.513) were followed to simple cubic equation. The cushion stroma of piggery could inhibit the growth of E. coli and the amount of E. coli in the nine-months-used stroma cushion was much more less

15、than that in the one-month-used stroma cushion with decreases ranged from 67.45% to 96.53%, indicating that the microbial-fermentation bed could play an important role in biogicontrol of E.coli in the piggery.【Conclusion】The microbial-fermentation bed could restrain the growth of E.coli, especially

16、for the bacteria carried with the virulent genes. The longer the microbial-fermentation bed was used the more biocontrol effect was on the population of E.coli.Key Words: Microbe; Microbial-fermentation bed for raring pig; Biocontrol; Escherichia coli; Virulence gene【研究意义】生猪疫病一直是困扰养猪业的一道难题。许多研究13表明，

17、猪舍的不良环境是许多疾病的诱因，只有给猪提供舒适、干净的生活环境才能减少生猪疫病的发生，提高生猪的生产能力。微生物发酵床养猪是近年我国引进的一种新兴养猪模式，它给农户和养殖户带来可观经济效益的同时也减轻了对环境的污染，是一种无污染、无排放、无臭气的环保养猪技术46。应用微生物发酵床养猪技术，可彻底解决养猪对环境的污染，改善猪舍环境，减少生猪疫病。【前人研究进展】许多研究表明1,79，微生物发酵床的基质垫层能形成以有益微生物为优势菌群的生物保护屏障，阻止有害微生物的侵入，对致病菌的定殖产生抑制作用。有些专家1012则认为微生物发酵床通过微生物发酵，使垫料里层温度高达6070，杀灭或抑制细菌、病毒

18、繁殖，从而有利于生猪健康生长。刘振钦等13调查发现，微生物发酵床养猪与传统养猪相比，猪死亡率下降96% ，可能原因是微生物发酵床垫层形成的平衡稳定的微生态区系能抑制有害微生物的生长，有利于保持猪肠道健康，减少猪的肠道疾病。李荣林等14对发酵床养猪和常规养猪进行对比分析发现，发酵床养猪出现疾病的情况明显少于常规养猪，且发酵床养猪的各项肉质指标均优于常规养猪。许多研究已证明微生物发酵床养猪能够降低生猪疫病的发生，但微生物发酵床对猪舍大肠杆菌病原生物防治作用的相关研究未见报道。【本研究切入点】 为了阐明微生物发酵床基质垫层对猪肠道疾病的生防机理，笔者拟以大肠杆菌为靶标菌，调查大肠杆菌特别是致病性大肠

19、杆菌在基质垫层的分布动态，分析微生物发酵床对猪舍大肠杆菌病原的防治作用。首先，根据大肠杆菌普遍存在的UdiA基因15,16（-D-半乳糖苷酶基因）设计大肠杆菌的特异检测引物，用于微生物发酵床基质垫层大肠杆菌的检测。其次，采用多重PCR法对大肠杆菌携带的毒素基因进行检测和定型。最后，建立大肠杆菌在基质垫层分布的动态模型。【拟解决关键问题】本研究通过分析大肠杆菌及其毒素基因在不同使用时间、不同层次基质垫层分布的数量和类型，得出其分布规律，旨在为微生物发酵床规模化养猪场猪疫病爆发做出有效的预测预报，同时也为今后猪舍环境污染及防治提供临床依据。1 材料与方法1.1 材料培养基和试剂：大肠杆菌鉴别培养基

20、伊红美蓝（北京陆桥技术有限责任公司），DNA聚合酶（上海生工生物工程技术服务有限公司），100bp Marker（上海英骏生物技术有限公司）。参考菌株：标准菌株RO8c（estB+estA+elt+faeG）、B44a（fanA）、F107a（fedA）、PD20c（aidAI）、P16Ma（fasA）、AMR-47c（Stx2e)、JG280c（astA+paa+sepA）由加拿大农业部南方研究中心Edward Topp博士惠赠。1.2 方法1.2.1微生物发酵床大肠杆菌种群动态调查猪舍基质垫层取样于按零污染养猪标准操作规程进行垫层配比和相关管理的零污染养猪示范基地宁德新科农牧发展有限公司。

21、取样方法：选择饲养猪1个月、3个月、5个月、7个月和9个月的基质垫层，进行4层取样（第1层010cm ，第2层2030cm ，第3层4050cm ，第4层6070cm）。每层取样采用五点取样法，样本充分混合后取小样（10g），进行大肠杆菌的分离。1.2.2微生物发酵床大肠杆菌的分离与培养采用伊红美蓝鉴别培养基进行分离。每份样品分别称取10g，于90ml无菌水中进行稀释。按10-2、10-3、10-4梯度稀释样品，然后各取200L稀释液涂布于伊红美蓝鉴别培养基平板上，处理后倒置于30暗培养箱培养至长出单菌落。根据大肠杆菌在伊红美蓝鉴别培养基会形成黑色带金属光泽的菌落形态特征，挑出具有代表性的单菌

22、落，并计数、纯化、保存分离得到的菌株。1.2.3微生物发酵床大肠杆菌毒素基因检测DNA模板的制备：将分离到的疑似大肠杆菌菌株用LB平板培养基37纯培养24h，挑取单菌落，均匀悬浮于50L超纯水中；100 10min后，迅速冰浴5min，4 10000r/min离心1min，取上清于-20保存备用。引物设计：针对大肠杆菌的UdiA基因设计1对大肠杆菌特异检测引物。引物序列如下：UdiA:5-AAAACGGCAAGAAAAAGCAG-3；5-ACGCGTGGTTACAGTC TTGCG-3。针对大肠杆菌12种毒素基因（estB、estA、elt、faeG、fanA、fedA、aidAI、Stx2e

23、、astA、paa、fasA、sepA）设计12对毒素基因检测引物1720，引物序列见表1。由上海英骏生物技术有限公司合成。将12种毒素基因分为3组进行4重PCR反应。表1 12种毒素基因的引物分组和序列Table 1 Primers groups and sequences of 12 virulence genes PCR基因Gene碱基序列Primer sequence退火温度/Annealing()片段/bpFragment size(bp)阳性对照Positive control1estBFor-TGCCTATGCATCTACACAAT55113RO8c1Rev-CTCCAGCAGT

24、ACCATCTCTA1estAFor-CAACTGAATCACTTGACTCTT55158RO8c1Rev-AA ATA ACATCCAGCACAGG1eltFor-GGCGTTACTATCCTCTCTAT55272RO8c1Rev-TGGTCTCGGTCAGATATGT1faeGFor-GAATCTGTCCGAGAATATCA55499RO8c1Rev-GTTGGTACAGGTCTTAATGG2fanAFor-AATACTTGTTCAGGGAGAAA59230B44a2Rev-AACTTTGTGGTTAACTTCCT2fedAFor-TGGTAACGTATCAGCAACTA59313F107

25、a2Rev-ACTTACAGTGCTATTCGACG2aidA-1For-ACAGTATCATATGGAGCCA59585PD20c2Rev-TGTGCGCCAGAACTATTA2Stx2eFor-AATAGTATACGGACAGCGAT59733.AMR-47c2Rev-TCTGACATTCTGGTTGACGC3astAFor-TCGGATGCCATCAACACAGT62125JG280c3Rev-GTCGCGAGTGACGGCTTTGTAAG3paaFor-GGCCCGCATACAGCCTTG62282JG280c3Rev-TCTGGTCAGGTCGTCAATACTC3fasAFor-GT

26、A ACTCCACCGTTTGTATC62409P16Ma3Rev-AAGTTACTGCCAGTCTATGC3sepAFor-TAA AACCCGCCGCCTGAGTA62611JG280c3Rev-TGCCGGTGA ACAGGAGGTTT大肠杆菌的特异检测：总体系为25L，其中10PCR Buffer 2.5 L，10 mM dNTP 0.5L，10M引物1L，Taq酶1单位，DNA模板25 ng 。PCR反应程序：94 预变性3min；94变性1min，55 退火30 sec，72 延伸1min，重复35个循环；最后72延伸7 min。大肠杆菌毒素基因检测：采用多重PCR法进行大肠杆菌毒

27、素基因检测，分3组4重PCR，反应体系均为25 L，含Taq酶1U，10PCR Buffer 2.5 L ，10 mM dNTP 0.5L ，10M引物1L和DNA模板25 ng。3组反应的PCR程序，组I为预变性15 min（95 ）；变性1 min（95 ），退火1 min（55 ），延伸2 min（72 ），重复30个循环（每下一个循环退火时间加3 s）；最后延伸10 min（72 ）。组II为预变性15 min（95 ）；变性1 min（95 ），退火1 min（59 ），延伸2 min（72 ），重复30个循环（每下一个循环退火时间加3 s）；最后延伸10 min（72 ）。组III

28、：预变性15 min（94 ）；变性1 min（94 ），退火1 min（62 ），延伸1 min（72 ），重复35个循环；最后延伸10 min（72 ）。PCR产物的检测：取10 L PCR产物，点样于1.5%的琼脂糖凝胶中，以100 bp Marker作为标准分子量，120 V电压、1倍TAE缓冲液中电泳2 h，EB染色，采用凝胶成像系统观察结果。2 结果与分析2.1 大肠杆菌毒素基因检测2.1.1大肠杆菌的特异检测从不同使用时间、不同层次的基质垫层中分离的433株疑似大肠杆菌经大肠杆菌特异检测引物的鉴定结果如图1所示，这对引物在大肠杆菌菌株扩增出大小约150bp的条带，在清水对照和不是

29、大肠杆菌的菌株中没有扩增出相应的片段，说明这对引物对大肠杆菌是特异的，同时，也说明零污染养猪猪舍基质垫层有大肠杆菌的存在。分离的433株疑似大肠杆菌中检测出419株为阳性，阳性率为96.77%，分别在1个月基质垫层分离的94株疑似大肠杆菌中检测出89株阳性，3个月基质垫层分离的63株疑似大肠杆菌中检测出60株阳性菌株，5个月基质垫层分离的96株疑似大肠杆菌中经检测全部为阳性菌株，7个月基质垫层分离的106株疑似大肠杆菌中检测出103株阳性菌株，9个月基质垫层分离的74株疑似大肠杆菌中检测出71株阳性菌株。图1 大肠杆菌特异检测图谱注：111为大肠杆菌阳性检测；1215为大肠杆菌阴性检测；16为

30、阳性对照；17为阴性对照；M为分子量标准（3000bp、2000bp、1500bp、1200bp、1031bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp）Fig.1 Pattern of PCR specifically amplification with E.coliNote：lanes 111：Escherichia coli positive by PCR; Lanes 1215: Escherichia coli negative; Lane 16 is positive control; Lane 17 is neg

31、ative control; Lane M is DNA size marker2.1.2 大肠杆菌毒素基因的检测（1）大肠杆菌毒素基因检测：利用建立的多重PCR对419株经鉴定为大肠杆菌的菌株进行毒素基因检测，结果发现，样品中存在12种毒素基因中的8种毒素基因，分别是第1组毒素基因estB、estA、faeG、 elt，第2组毒素基因fedA、aidAI、Stx2e和第3组毒素基因sepA。扩增产物大小与阳性对照一致（图2）。图2 大肠杆菌毒素基因PCR检测图谱注：15为大肠杆菌毒素基因第1组检测结果，其中4为阳性对照RO8c，5为空白对照；611为大肠杆菌毒素基因第2组检测结果，其中9为阳

32、性对照PD20c，10为阳性对照AMR-47c，11为空白对照；1217为大肠杆菌毒素基因第3组检测结果，其中15为阳性对照P16Ma，16为阳性对照JG280c，17为空白对照；M为分子量标准（3000bp、2000bp、1500bp、1200bp、1031bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp）Fig.2 PCR electrophoretogram for detection of virulence genes of Escherichia ColiNote: 15 is the result of PCR de

33、tection of virulence genes of Escherichia Coli with primer group, and No.4 is positive control RO8c, No.5 is negative control; 611 is the result of PCR detection of virulence genes of Escherichia Coli with primer group, and No.9 is positive control PD20c, No.10 is negative control; 1217 is the resul

34、t of PCR detection of virulence genes of Escherichia Coli with primer group, and No.15 is positive control P16Ma, No.17 is negative control; M is DNA Marker(3000bp, 2000bp, 1500bp, 1200bp, 1031bp, 900bp, 800bp, 700bp, 600bp, 500bp, 400bp, 300bp, 200bp,100bp)（2）大肠杆菌毒素基因数量分布：结果见表2。从1个月基质垫层中分离到的89株大肠杆菌

35、中检测到20株含毒素基因，阳性检出率为22.47%，其中5株携带estB基因，2株携带elt 基因，6株携带faeG 基因，1株携带aidAI基因，2株携带sepA基因， 1株携带faeG +sepA 2种毒素基因的菌株，1株携带faeG +Stx2e 2种毒素基因，1株携带estB+faeG+elt 3种毒素基因，1株携带estB+estA+fedA 3种毒性因；3个月基质垫层分离到的60株大肠杆菌中检测出7株含毒素基因，阳性检出率为11.67%，基中1株携带estA 基因，4株携带faeG 基因，1株携带aidAI基因，1株携带estA+faeG 2种毒素基因；5个月基质垫层分离的96株大

36、肠杆菌中检测出13株含毒素基因，阳性检出率为13.54%；其中1株携带estA基因，1株携带faeG基因，2株携带fedA基因、2株携带Stx2e、2株携带aidAI基因，2株携带Stx2e+aidAI 2种毒素基因，3株携带fedA+Stx2e+aidAI 3种毒素基因；7个月基质垫层分离的103株大肠杆菌中检测出14株含毒素基因，阳性检出率为13.59%；其中1株携带estB毒素基因，4株携带faeG基因，2株携带elt基因，4株携带aidAI基因，1株携带elt+faeG 2种基因，1株携带estA+ faeG 2种基因，1株携带estB+estA+ faeG 3种毒素基因；9个月基质垫

37、层分离的71株大肠杆菌中检测出3株含有毒素基因，阳性检出率为4.23%。其中1株携带fedA基因、1株携带elt基因，1株携带Stx2e+aidAI 2种毒素基因。表2 不同使用时间基质垫层大肠杆菌毒素基因的检测结果Table 2 Result of Escherichia coli virulence genes detection from different using time stroma cushion使用时间Using time检测数量Amount of detection毒素基因类型Types of virulence gene毒素基因检出量Quantities of viru

38、lence genes毒素基因检出率Raitio of virulence genes（%）1个月基质垫层One month stroma cushion89estB55.62elt22.25faeG66.74aidAI11.12sepA22.25faeG +sepA 22.25faeG +Stx2e11.12estB+faeG+elt11.12estB+estA+fedA11.123个月基质垫层Three months stroma cushion60estA11.67faeG46.67aidAI11.67estA+faeG11.675个月基质垫层Five months stroma cus

39、hion96estA11.04faeG11.04fedA22.08Stx2e22.08aidAI22.08Stx2e+aidAI22.08fedA+Stx2e+aidAI33.137个月基质垫层Nine months stroma cushion103estB10.97faeG43.88elt21.89aidAI43.88elt+faeG10.97estA+ faeG10.97etB+estA+ faeG10.979个月基质垫层Nine months stroma cushion71fedA11.41elt11.41Stx2e+aidAI11.41（3）大肠杆菌毒素基因特征分布：从不同使用时间

40、、不同层次基质垫料分离的携带毒素基因的大肠杆菌菌株中分析，只携带单一的毒素基因菌株占74.14%，同时携带两种毒素基因的菌株占15.52%，同时携带3种毒素基因的菌株占10.34%。毒素基因aidA-1在不同使用时间的基垫料中均有分布，而毒素基因faeG和estA只在基质垫料使用的前期分布，在基质垫料使用的后期（9个月开始）并没分布。毒素基因faeG、estB和fedA在不同层次的基质垫料中均有分布，而毒素基因elt、estA、aidA-1、Stx2e和sepA只分布在基质垫料的第1、3、4层，在基质垫料的第2层没有分布。2.2微生物发酵床养猪垫层大肠杆菌种群毒素基因分布动态（1）大肠杆菌种群

41、毒素基因时间分布动态：不同使用时间的基质垫层大肠杆菌毒素基因类型和分布数量存在较大差异（表3）。1个月新鲜垫层分布的毒素基因种类和数量最多，毒素基因分布总量为2.08105 cfu/mLg；9个月基质垫层大肠杆菌毒素基因分布数量最低，毒素基因分布总量为5.0104 cfu/mLg。1个月新鲜垫层分布12种毒素基因中的8种毒素基因，分别是faeG、elt、estA、estB、fedA、aidA-1、Stx2e和sepA，其中sepA基因（耐药性因子）分布量最大，为7.0104 cfu/mLg，Stx2e基因（志贺氏毒素）分布量最低，为1.0103 cfu/mLg；3个月基质垫层分布3种毒素基因，

42、分别是faeG、estA和aidA-1；5个月基质垫层分布5种毒素基因，分别是faeG、estA、fedA、aidA-1和Stx2e，其中fedA基因（菌毛A亚单位基因）分布量最大，为5.9104 cfu/mLg，faeG基因（菌毛蛋白基因）分布量最低，为1.0103 cfu/mLg；7个月基质垫层分布6种毒素基因，分别是faeG、elt、estA、estB、fedA和aidA-1，其中faeG基因分布量最大，为1.0105 cfu/mLg，fedA基因分布量最低，为1.0103 cfu/mLg；9个月基质垫层分布4种毒素基因，分别是elt、fedA、aidA-1和Stx2e，fedA分布量为

43、2.0104 cfu/mLg，elt、aidA-1和Stx2e分布量为1.0104 cfu/mLg。随着垫料使用时间的延长，毒素基因在基质垫层中的分布渐少，说明基质垫层的使用能抑制以大肠杆菌为靶标菌的病原菌的生长。表3 大肠杆菌不同毒素基因类型时间分布特征（cfu/mLg）Table 3 Quantities of Escherichia coli virulence gene in the stroma cushion of non-pollution pigsty基质垫层使用时间Using time of stroma cushion毒素基因类型 Types of virulence ge

44、ne（103）faeGeltestAestBfedAaidA-1Stx2esepA1个月基质垫层 One month stroma cushion35.030.011.049.02.010.01.070.03个月基质垫层Three months stroma cushion71.00.040.00.00.040.00.00.05个月基质垫层Five months stroma cushion1.00.020.00.059.016.03.40.07个月基质垫层Nine months stroma cushion1.060.010.05.04.070.00.00.09个月基质垫层Nine mont

45、hs stroma cushion0.010.00.00.020.010.010.00.0（2）大肠杆菌种群毒素基因空间分布动态：大肠杆菌毒素基因在微生物发酵床基质垫层的空间分布动态如表4所示，各毒素基因基本上都是在第1层分布量最大，在第2层分布量最低。faeG、estB和fedA 3种毒素基因在基质垫层各层次均有分布；elt、Stx2e和sepA 3种毒素基因毒素基因分布规律相同，只分布在基质垫层的第1、3和4层，且第1层分布量最大，其次是第3层，第2层没有分布；estA毒素基因 和aidA-1毒素基因分布规律相同，都只分布在第1、3、4层，且第3层分布量最大，其次是第1层，第2层没有分布。

46、表4 大肠杆菌不同毒素基因类型在基质垫层空间分布特征（cfu/mLg）Table 3 Quantities of Escherichia coli virulence gene in the stroma cushion of non-pollution pigsty基质垫层使用时间Using time of stroma cushion毒素基因类型 Types of virulence gene（103）faeGeltestAestBfedAaidA-1Stx2esepALayer 1150.060.026.05.023.050.033.030.0Layer 230.00.00.02.033.00.00.00.0Layer 3100.030.045.027.017.070.011.020.0Layer 410.010.010.020.012.026.01.120.02.3微生物发酵床养猪垫层大肠杆菌种群空间分布动态不同使用时间、不同层次的