[农业]常见疫病实验室检测方法.doc

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1、常见疫病实验室检测方法 目录常见疫病实验室检测方法1目录1常见ELISA操作方法2亚洲 1 型口蹄疫抗体液相阻断 ELISA 检测试剂盒2猪瘟抗原检测试剂盒5口蹄疫结构蛋白检测方法（ 3ABC-I-ELISA）11犬细小病毒抗体酶免测定试剂盒说明书13犬瘟热病毒抗体酶免测定试剂盒说明书15常见PCR操作方法17猪伪狂犬病毒PCR诊断试剂剂盒17猪圆环病毒PCR诊断试剂盒20常见RT-PCR操作方法23口蹄疫病毒分子检测诊断试剂盒23H5亚型禽流感病毒RT-PCR检测试剂盒说明书(20次)25新城疫病毒RT-PCR 检测试剂盒27猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒30凝集、血凝实验操作方法33弓形虫

2、间接血凝试验(lHA)试剂使用说明书33伪狂犬病乳胶凝集试验试剂盒34猪细小病毒病乳胶凝集试验LAT诊断试剂盒使用说明书35猪传染性萎缩性鼻炎乳胶凝集试验LAT操作程序36猪瘟正向间接血凝试验试剂使用说明书及实验操作程序37高致病性禽流感血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验程序40琼脂扩散试验42鸡马立克氏病42禽流感琼脂凝胶免疫扩散试验44荧光抗体检测46猪瘟荧光抗体试验操作程序46对狂犬病疑似动物脑组织的直接免疫荧光(dFA)检测47血清学诊断检测常用试剂配方49禽流感HA和HI试验用溶液的配制49补充实验52猪流感病毒H1亚型Hl试验抗原与阴、阳性血清说明书52猪流感病毒RT-PCR检测5

3、5猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒猪繁殖与呼吸综合症（Nsp2 15941680变异株）RT-PCR检测实验57布鲁氏菌病试管凝集试验抗原与阴、阳性血清60常见ELISA操作方法亚洲 1 型口蹄疫抗体液相阻断 ELISA 检测试剂盒一 试剂盒内含物.说明书 亚洲 1 型口蹄疫阳性对照血清( 己稀释浓度为 1:8).96 孔 ELISA 板 亚洲 1 型口蹄疫阴性对照血清.液体稀释槽 3% 双氧水.U 型96孔抗原抗体反应板 25PBST洗涤液(稀释时准确量取).封板膜 豚鼠抗血清稀释液.灭活亚洲型口蹄疾病毒抗原 (用冰决包裹 ) 终止液.亚洲型口蹄疫病毒兔抗血清 包被缓冲液(碳酸盐)胶囊.亚洲型

4、口蹄疫病毒豚鼠抗血清 底物 (柠檬酸 -磷酸盐)缓冲液片剂.兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物 OPD 片剂二 器材准备 ( 需用户自备 )1.移液器:5-50l移液器、0.210l移液器、50200l移液器、50300l 12道移液器各一把。2.移液枪尖 (若干)。3.抗原抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)5块,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。注:抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴30秒,晾干,待用。4.超纯水 , 无离子水或蒸馏水。三、试剂准备(需用户完成)1.包被缓冲液(PH9.6)将本试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心

5、打开,将胶囊内粉末倒入100ml无离子水中溶解即可。4存放,1月内有效。2. 洗涤液(PBST)将本试剂盒配备的 25 倍浓缩 PBST 液(可能有结晶形成,用时微热溶化)用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。(如果PH降低,务必用NaOH调至7.4)3.底物溶液取1片柠檬酸磷酸盐片剂(本试剂盒配备)溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL溶液, 再加1片邻苯二胺(OPD)片剂,充分溶解,分装（5mL/ 瓶或 10Ml瓶 ), 避光之-2O保存。 用前避光溶化 ,临时每1mL上述溶液加 10L 本试剂盒配备的 3% 的双氧水(H202) 。务必加双氧水!四、操作步骤 1.用包被缓冲液稀释亚洲

6、1 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度(1:1000), 在 ELISA 板上每孔加 50l, 振荡 , 封板或置湿盒内，室温过夜。2. 抗原抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。图 1 96 孔酶标板检测 10 份样品布局图S1 1:8S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:161：641:81:321：1281:641：2561:1281：5121:2561:10241:5121:20481:l0241:4096图 1 为抗体滴度测定 (定量) 检测 10 份样品布局图;图 2 为抗体滴度测定( 定量 )检测 2

7、0 份样品布局图。图 2 96 孔酶标板检测 20 份样品布局图S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S111:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以图 1 为例 , 在 U 型血凝板上按 50 l/孔量用 PBST 将待检 血清从1:4开始做2倍连续稀释至 1:512。同时,按图示稀释阴阳性对照血清 , 然后每孔加入 50 l 用 PBST 稀释到使用浓度的亚洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4,即1份病毒抗原、加

8、3份PBST), 病毒抗原对照孔加100l。振荡混匀,封板,4过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。3.用洗涤液 (1PBST) 洗 ELISA板5 次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50l封板,37温育1小时。4.同上洗板5次, 甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度 (1:1000), 每孔加50l,封板,37温育1小时。5.同上洗板 5 次 , 甩干。用 lPBST 稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度 (1:500), 每孔加 50 l 封板 ,37 温育 1 小时。6. 同上洗

9、板5次,每孔加50l底物溶液 (务必加双氧水),37温育15分钟。每孔再加50l终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值(OD492nm值)。五 结果判定1. 试验认可标准每块板设 4 孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50l/孔,病毒抗原对照OD492nm 值应在1.50.5范围内。 阳性对照抗体效价应在1:10241滴度以内,阴性对照血清抗体效价应1:8。2.病毒抗原对照平均OD492nm 值50%计算(临界值)抗原对照是4孔,弃去最高和最低OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再

10、除以2,即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD492nm值。3.结果判定以病毒抗原对照平均OD492nm 值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均OD492nm值为1.2,则其50%为0.60。若某一待检血清在1:128时OD492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为 1:128 。若临界值处于两个滴度之间 ,如处于1：64与1：128之间，则抗体滴度取中间值为1:9O。定性检测中 , 两个重复孔只要有 一孔为阳

11、性孔 , 则抗体滴度判 定为 1:128, 两孔均为阳性孔 , 则判定 为抗体滴度1:128 。ELISA抗体效价1:128,判定为亚洲 1 型口蹄疫抗体阳性。 ELISA抗体效价与保护力的关系:牛、羊:抗体效价1:128,99% 保护；效价1:16, 不保护；效价在1:22-90之间,50%保护。猪瘟抗原检测试剂盒Classical Swine Fever Virus Antigen Test kit(CSFVAg)概 述猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)都是瘟病毒科黄病毒属的成员。猪瘟病毒自从成为一种重要的病原体以来，给养猪业造成了巨大的经济损失，并引

12、起猪的严重死亡。感染高致病力猪瘟病毒后，猪在出现临床症状前会排出大量的病毒。耐过急性或亚急性感染的动物会产生抗体并且不再散毒。低致病力温和病毒会造成猪的隐性感染，病猪将会持续或间歇排出病毒直至死亡。怀孕母猪与猪瘟病毒接触后可能通过胎盘感染胎儿。先天性感染可能导致流产，木乃伊胎儿，死产和/或弱仔及畸形胎儿。先天性感染低毒力病毒的结果是产出持续性感染的仔猪，仔猪出现免疫耐受，不表现任何症状向外排毒。猪也有可能感染BVDV或BDV。尽管这些感染通常呈温和经过并且是自限性的，但将它们同猪瘟病毒有效区分是很重要的。原 理本ELISA检测试剂盒是用来检测外周血白细胞、全血、细胞培养物以及组织样本中的猪瘟病

13、毒抗原。采用双抗体夹心ELISA，将CSFV单克隆抗血清包被微量反应板，可与样品中的CSEV抗原结合。猪瘟病毒的特异性单克隆抗体形成了夹心的上层。形成的单克隆抗体+样品+单克隆抗体夹心可以用辣根过氧化物酶标记物检测。加入与辣根过氧化物酶反应的底物，在酶的作用下形成有色产物。通过酶标仪测定其吸光度。可以用450nm单波长或450nm与620m双波长测定各孔吸光度。试 剂本试剂盒采用96孔板，可以一次检测92个样品(每个样品1孔，每个对照2孔)或46个样品(每个样品2孔，每个对照2孔)；或分6次使用，每次用2个板条，设2个对照，测定6个样品(每个样品2孔)。为了检测结果的准确性，最好每个样本都设重

14、复。试 剂 数 量1、多克隆羊抗血清包被板条 8孔12条(96孔)2、10倍浓缩样品稀释液(10x) 55ml足以配制550mL直接使用的1x稀释液3、10倍浓缩洗涤液(10x) 125ml足以配制1、25L直接使用的洗涤液工作浓度(1x)4、CSFV单克隆抗体，含防腐剂 4ml5、阳性对照，含有防腐剂 1.5ml6、阴性对照，含有防腐剂 1.5ml7、100倍浓缩辣根过氧化物酶标记物(100x)，辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG，含有防腐剂 200l8、酶标抗体稀释液 15ml9、底物液，TMB/H2O2溶液 12ml10、终止液，1M HCI(小心，强酸) 12ml注意事项1、仔细阅读并遵守操

15、作说明；2、试剂盒试剂于27冷藏保存。建议将浓缩的洗涤液(10x)保存在1825室温，以免形成结晶。3、所有试剂在使用前必须恢复至室温。4、未使用的包被板应该密封保存在配备的塑料袋中，于27冷藏保存。5、不要将不同批次的说明书以及试剂盒成分混合使用。6、注意防止真菌或细菌污染试剂盒成分。处理试剂时要小心。7、不要用超过保质期的检测试剂盒。8、进行样品或试剂操作时严禁吃东西、喝水或吸烟。9、每个样品都用单独的吸头。10、每一批次的试剂必须用其配备的阴阳对照。11、配制试剂时只能用超纯水。12、不要用嘴吸取液体。13、底物溶液和浓缩的样本稀释液对眼睛、呼吸系统和皮肤有剌激性，避免与皮肤和眼睛接触。

16、14、终止液为1MHCl，HCI为强酸并且能造成灼伤，小心处理。15、本试剂盒只能用于体外诊断。兽医专用。试剂配制1、包被的反应板、猪瘟病毒特异性单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、底物溶液、终止液为现用试剂。2、洗涤液10倍浓缩洗涤液必须用超纯水或双蒸水进行10倍(1：10)稀释，稀释的洗涤液于27冷藏保存，但不能超过3天；或冰冻保存，至少可以保存一年。例如：配制500ml稀释的洗涤液，将450ml超纯水或双蒸水加到50ml浓缩液中，混匀。注意：如果浓缩液有结晶，在使用前必须溶解。可将瓶子放在温水中30分钟以上。3、样品稀释液10倍浓缩样品稀释液必须用超纯水或双蒸水进行10倍(110)稀释，但如

17、果检测全血样品时，将适量的10倍浓缩液与等体积的超纯水混合，制成5倍浓缩液(5X)即可。将制备的稀释液于27冷藏保存，但不能超过3天；或者冰冻保存，可以保存一年以上。4、辣根过氧化物酶标记物(100x)100倍(100X)浓缩标记物在使用前必须用标记物稀释液进行1100倍稀释。如果只使用部分试剂，只要用稀释液按100倍(1100)稀释足够本次使用的标记物浓缩液(旋涡振荡混勾)即可。稀释后的标记物溶液只能保存24小时。例如：10ml的辣根过氧化物酶标记物工作液，只需取100l浓缩标记物(100X)加到10ml标记物稀释液中，在旋涡振荡器上混匀即可。自备器材1、精密移液器，51至100012、一次

18、性移液吸头。3、双蒸水或超纯水。4、洗瓶或自动洗板机。5、湿盒或封板胶带。6、离心机，2000xg。7、酶标仪。8、离心管和小试管。9、微量离心机，10，000xg。10、旋涡振荡器。11、剪刀和摄子。12、0.17MNH4CI溶液，制备白细胞用。样品制备注意：制备好的样品或组织可以在27保存7天，或-20冷冻保存6个月以上。但这些样品在应用前应该再次以1，500xg离心10分钟或10，000xg离心25分钟。外周血白细胞a) 取10ml肝素或EDTA抗凝血样品，1，500xg离心1520分钟。b) 用移液器小心吸出血沉棕黄层，加入500l样品稀释液(1X)，在旋涡振荡器上混匀，室温下放置1小

19、时，其间不时用旋涡器混合。然后直接进行步骤f操作；c) 假如样品的棕黄层压积细胞体积非常少，那么就用整个细胞团(包括红细胞)。将细胞加进10ml的离心管，并加入5ml预冷(27，下同)的0.17MNH4CI(氯化铵)混匀，静置10分钟。d) 用冷(27)超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1，500xg离心5分钟。e) 弃去上清，向细胞团中加入500l样品稀释液(1x)，用洁净的吸头悬起细胞，在旋涡振荡器上混匀，室温放置1小时。期间不时用旋涡器混合。f) 1，500xg离心5分钟，取上清液按操作步骤进行检测。g) 注意：处理好的样品可以在27冷藏保存7天，或-20冷冻保存6个月，但在使

20、用前必须再次离心。外周血自细胞(简化方法)a) 取0.52ml肝素或EDTA抗凝血与等体积冷(2-8)0.17M NH4CI加入离心管混合。室温放置10分钟。b) 1，500xg离心10分钟(或10，000xg离心23分钟)，弃掉上清。c) 用冷(27)超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1，500xg离心5分钟。d) 弃去上清，向细胞团中加入500l样本稀释液(1x)。旋涡振荡充分混匀，室温放置1小时。期间不时用旋涡器混合。取75l按照操作步骤进行检测。全血(肝素或EDTA抗凝)a) 取25l 10倍浓缩样品稀释液(10X)和475l全血加入微量离心管，在旋涡振荡器上混匀。b) 室温

21、下温育1小时，期间不时用旋涡器混合。此样品可以直接按照“操作步骤”进行检测。或：直接将75l全血加入酶标板孔中，再加入10l 5倍浓缩样品稀释液(5X)。晃动酶标板/板条，使样品混合均匀。再按照“操作步骤”进行检测。细胞培养物a) 移去细胞培养液，收集培养瓶中的细胞加入到离心管中。b) 2，500xg离心5分钟，弃去上清。c) 向细胞团中加入500l样品稀释液(1x)。旋涡振荡充分混匀，室温放置1小时。期间不时用旋涡器混合。取此样品75l按照“操作步骤”进行检测。组织最好用新鲜的组织。如果有必要，组织可以在处理前于28冷藏保存1个月。每只动物检测12种组织，最好选取扁桃体、脾、肠、肠系膜淋巴结

22、或肺。a)取12g组织用剪刀剪成小碎块(25mm大小)。b) 将组织碎块加入10ml离心管，加入5ml样品稀释液(1x)，旋涡振荡混匀，室温下放置12小时，期间不时用旋涡器混合。c) 1，500xg离心10分钟，取75l上清液按照“操作步骤”进行检测。操作步骤注意：所有试剂在使用前应该恢复至室温1825；使用前试剂应在室温条件下至少放置1小时。1、每孔加入25lCSFV特异性单克隆抗体。此步骤可以用多道加样器(812道)操作。2、在相应孔中分别加入75l阳性对照、阴性对照，各加2孔。注意更换吸头。3、在其余孔中分别加入75l制备好的样品，注意更换吸头。轻轻拍打酶标板，使样品混合均匀。4、置湿盒

23、中或用胶条密封后室温(1825)温育过夜。也可以放置室温温育4个小时，但是这可降低检测灵敏度。5、甩掉孔中液体，用洗涤液(1X)洗涤5次，每次洗涤都要将孔注满。将孔中的所有液体倒空，用力拍打酶标板，以使所有液体拍出。或者，每孔加入洗涤液250300l用自动洗板机洗涤5次。注意：洗涤酶标板要仔细细心。6、每孔加入100l稀释好的辣根过氧化物酶标记物，在湿盒或密封后置室温温育1小时。7、重复操作步骤5；每孔加入100l底物液，在暗处室温温育10分钟。第1孔加入底物液开始计时。8、每孔加入100l终止液终止反应。加入终止液的顺序与上述加入底物的顺序一致。9、在酶标仪上测量样品与对照孔在450m处的吸

24、光值，或测量在450nm和620nm双波长的吸光值(空气调零)。10、计算每个样品和阳性对照孔的矫正吸光值的平均值(参见“计算方法”)。计算方法首先计算样品和对照孔的OD平均值，在判定结果之前，所有样品和阳性对照孔的OD平均值必须进行矫正，矫正的OD值等于样本或阳性对照值减去阴性对照值。矫正OD=样本OD阴性对照OD注意：北京爱德士元亨生物科技有限公司奋进行平均值相UN值计算并提供数据汇总的仪器和软件系统(xChek)试验有效性判定阳性对照OD平均值应该大于0.500，阴性对照OD平均值应小于0.150，试验结果方能有效。否则，应仔细检查实验操作并进行重测。如果阴性对照的吸收值始终很高，将阴性

25、对照液在微量离心机中10，000xg离心35分钟，重新检测。结果判定被检样品的矫正吸光值大于或等于0.30，则为阳性：被检样品的矫正吸光值小于0.20，则为阴性；被检样品的矫正吸光值大于0.20，小于0.30，则为可疑。建议根据外周血白细胞处理方案或细胞培养物处理方案进行全血样品的处理和检测。口蹄疫结构蛋白检测方法（ 3ABC-I-ELISA）简介口蹄疫(FMD)是一种高度接触性传染病，传播迅速，可形成世界性大流行，对养殖业和国际畜产品贸易具有严重的负面影响。控制和消灭FMD策略包括疫苗免疫和屠宰可疑畜群。在采用疫苗的国家，大多数动物血清口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白和病毒感染相关抗原(VIA

26、A，即3D)抗体均为阳性，因此，一些基于结构蛋白和VIAA的诊断方法很难确定口问疫病毒感染与否。只有将感染动物和隐性带毒动物与疫苗免疫动物加以区分才能为FMD的控制和消灭提供科学的依据。日前的疫苗生产工艺，在病毒纯化过程中去除绝大部分非结构蛋白，因此灭活疫苗免疫动物体内没有病毒非结构蛋白3ABC抗体产生，而自然感染动物体内既有结构蛋白抗体，也有非结构蛋向3ABC抗体。因此检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体的ELISA方法不但可以检测隐性感染动物，而且可以区分感染动物和免疫动物。口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒(FMD3ABC-I-ELlSA)对感染牛的检出率很高，敏感性在99%以上。对免疫牛

27、的特异性在96%以上。用途FMD3ABC-I-ELISA试剂盒检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体。该试剂盒不受血清型影响，适用于活畜进出口调运、疫区净化检疫和群体无症状感染评价，区分感染和免疫动物。原理FMD3ABC-I-ELISA试剂盒采用间接ELISA模式。用3ABC基因表达蛋白（Ag）包被ELISA板，洗板封闭。检测时，加入待检血清样品，如果血清样品中有3ABC抗体，与ELISA板上3ABC蛋白结合，形成抗原-抗体复合物，再与酶标二抗结合，加入底物后，就会出现颜色反应。如果待检样品为阴性，就不能形成抗原-抗体复合物，酶标二抗不会结合，因此就不显色。注意事项1冰冻血清样品应充分融化，且应混

28、和均匀。2血清稀释液和底物应平衡至室温应用。底物A在4为结晶状态，需要在室温或37水浴化开后应用。3最好在血清稀释板上稀释血清，以减小操作误差。4应使用相同的加样器加样，以保证加样量的准确，减小试验误差。5多道微量移液器所用的吸头应为同一规格和型号，避免加样误差。6应使用自动或手动连续洗板系统洗板。7加样先后次序应该一致，保证作用时间一样。8底物作用时间到后，如果颜色较浅，可适当延长作用时间。9本试剂盒只能检测一种动物的血清样本，应分别订购检测牛、猪或羊血清的试剂盒，以测定不同动物来源的血清。试剂准备l.洗涤液(PBST)将试剂盒配备的25倍浓缩PBST用无离子水或蒸馏水做l:25倍稀释即可。

29、操作步骤1. 待检血清样品和阳性、阴性对照血清用血清稀释液1:2l倍稀释(120L血清稀释液加血清6L)，每孔加入lOOL，阴、阳性对照血清平行加两孔，用封口膜封口，37结合30分钟。2. 取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤5次，最后一次拍干。3. 用血清稀释液按l:lOO比例稀释酶标二抗，每孔加入100L，用封口膜封口，37结合30分钟。4. 取掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤5次，最后一次拍干。5. 将底物A按1:50比例(体积比)稀释于底物B中(lmL底物B中加入2OL底物A)，吹打混匀，每孔加入lOOL，封口膜封口，37避光作用1015分钟。6. 每孔加入.100L终止液。7. 轻轻摇振混

30、匀，测定波长450nm吸光值(OD450nm值)。8. 阳性对照平均OD值应大于0.6；阴性对照平均OD值应小于0.2。9. 结果计算:样品效价为:(OD样品-OD阴性)(OD阳性-OD阴性)。结果判定若效价0.3为阳性。可疑和阳性样品应进行复测，复测为可疑或者阳性时，应判为阳性。犬细小病毒抗体酶免测定试剂盒说明书原理：本试剂盒采用间接ELISA方法检测犬血清中犬细小病毒IgG抗体。在聚苯乙烯微孔酶标板上,包被纯化的犬细小病毒抗原。待检血清中的CPV抗体与包被抗原特异结合,再与HRP标记的兔抗犬IgG 抗体结合,形成抗原抗体酶标抗体复合物,加TMB底物作用显色,在酶标仪上测定OD值判定结果。试

31、剂盒的组成(96头份):1. CPV抗原反应板 12*8孔2. 20倍浓缩洗液 30ml*1瓶3、样品稀释液 15mI*1瓶4、CPV阴性对照 300L*1支5、CPV阳性对照 300L*1支6、50倍CPV酶结合物液 300L*l支7、酶结合物稀释液 15ml*1瓶8、底物液A 8ml*1瓶9.底物液B 8ml*1瓶10、终止液 8ml*1瓶11、封板膜 2张12、自封袋 1个13、说明书 1张试剂准备:1.将20倍浓缩洗液用蒸馏水稀释20倍后备用(30ml浓缩洗液+570ml蒸馏水)。2.将50倍CPV酶结合物液用酶结合物稀释液稀释50倍后备用(300u1 50倍CPV酶结合物液+15m1

32、酶结合物稀释液),轻振混匀,当日用完。操作步骤:1.待检血清在板孔外用稀释后的洗涤液作l:16倍预稀释(150uL洗涤液+10uL待检血清)备用。阴、阳性对照不稀释。2.记下稀释样品的对应编号,每次试验设阳性对照、阴性对照、各2孔。3.试剂盒平衡至室温,在反应板各孔中加入100uL样品稀释液。再分别在相应孔中加入经预稀释的待检血清1OuL,然后在对照孔中分别加入10uL阴、阳性对照。充分混匀后,贴上封板膜,置37温育20分钟。4.小心揭掉封板膜,弃去各孔中液体、拍干。每孔加满洗涤液,静置约30秒,如此重复洗涤5次,最后一遍拍干。5.每孔加入经过稀释的酶结合物液100uL,贴上封板膜,置37温育

33、20分钟。6.操作同步骤5。7.每孔加入底物液A 50uL,再加入底物液B 50uL,轻拍混匀,置37避光显色10分钟。8.每孔加入终止液50uL,轻轻振荡,置酶标仪450nm波长处测定OD值。要求:1.阳性对照OD值有效范围:0.60。2.阴性对照OD值有效范围:0.10(阴性对照若有一孔大于0.10应舍弃,如果两孔OD值都大于0.10,应重复试验)。结果判定:1.临界值(Cut Off值)的计算:Cut Off值=(阳性对照OD平均值一阴性对照OD平均值)0.1+阴性对照OD平均值2.待检样本OD值临界值(Cut Off值)即判为CPV抗体具有保护效价:小于临界值(Cut Off值)即判为

34、CPV抗体未达到保护效价。注意事项:1.试剂盒从冷藏环境中取出时应置室温平衡后再打开密封袋,未用完的微孔反应板条用自封袋加干燥剂保存。2.各步加液均应使用加液器并经常校对其准确性,以减少实验误差。3.洗涤时各孔均需加满洗涤液,防止因洗涤不充分造成非特异性显色。4.封板膜只限一次使用,以避免交叉污染。5.结果判定必须以酶标仪读数为准,且终止反应后应在10分钟以内测定其OD值。6.所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。7.不同批次试剂不能混用。8.请严格按说明书操作。犬瘟热病毒抗体酶免测定试剂盒说明书原理本试剂盒采用间接ELISA方法检测犬血清中犬瘟热病毒IgG抗体。在聚苯乙烯微孔酶标板上

35、,包被纯化的犬瘟热病毒抗原。待检血清中的CDV抗体与包被抗原特异结合,再与HRP标记的兔抗犬IgG抗体结合,形成抗原抗体酶标抗体复合物,加TMB底物作用显色,在酶标仪上测定OD值判定结果。试剂盒的组成(96头份):1、CDV抗原反应板 12*8孔2、20倍浓缩洗液 30ml*1瓶3、样品稀释液 15mI*1瓶4、CDV阴性对照 300L*1支5、CDVF阳性对照 300L*1支6、50倍CDV酶结合物液 300L*l支7、酶结合物稀释液 15ml*1瓶8、底物液A 8ml*1瓶9.底物液B 8ml*1瓶10、终止液 8ml*1瓶11、封板膜 2张12、自封袋 1个13、说明书 1张试剂准备:1

36、.将20倍浓缩洗液用蒸馏水稀释20倍后备用(30ml浓缩洗液+570ml蒸馏水)。2.将50倍CDV酶结合物液用酶结合物稀释液稀释50倍后备用(300u1 50倍CDV酶结合物液+15m1酶结合物稀释液),轻振混匀,当日用完。操作步骤:1.待检血清在板孔外用稀释后的洗涤液作l:16倍预稀释(150uL洗涤液+10uL待检血清)备用。阴、阳性对照不稀释。2.记下稀释样品的对应编号,每次试验设阳性对照、阴性对照、各2孔。3.试剂盒平衡至室温,在反应板各孔中加入100uL样品稀释液。再分别在相应孔中加入经预稀释的待检血清1OuL,然后在对照孔中分别加入10uL阴、阳性对照。充分混匀后,贴上封板膜,置

37、37温育20分钟。4.小心揭掉封板膜,弃去各孔中液体、拍干。每孔加满洗涤液,静置约30秒,如此重复洗涤5次,最后一遍拍干。5.每孔加入经过稀释的酶结合物液100uL,贴上封板膜,置37温育20分钟。6.操作同步骤5。7.每孔加入底物液A 50uL,再加入底物液B 50uL,轻拍混匀,置37避光显色10分钟。8.每孔加入终止液50uL,轻轻振荡,置酶标仪450nm波长处测定OD值。要求:1.阳性对照OD值有效范围:0.60。2.阴性对照OD值有效范围:0.10(阴性对照若有一孔大于0.10应舍弃,如果两孔OD值都大于0.10,应重复试验)。结果判定:1.临界值(Cut Off值)的计算:Cut

38、Off值=(阳性对照OD平均值一阴性对照OD平均值)0.1+阴性对照OD平均值2.待检样本OD值临界值(Cut Off值)即判为CDV抗体具有保护效价:小于临界值(Cut Off值)即判为CDV抗体未达到保护效价。注意事项:1.试剂盒从冷藏环境中取出时应置室温平衡后再打开密封袋,未用完的微孔反应板条用自封袋加干燥剂保存。2.各步加液均应使用加液器并经常校对其准确性,以减少实验误差。3.洗涤时各孔均需加满洗涤液,防止因洗涤不充分造成非特异性显色。4.封板膜只限一次使用,以避免交叉污染。5.结果判定必须以酶标仪读数为准,且终止反应后应在10分钟以内测定其OD值。6.所有样品、洗涤液和各种废弃物都应

39、按传染物处理。7.不同批次试剂不能混用。8.请严格按说明书操作。保存28储存，有效期6个月常见PCR操作方法猪伪狂犬病毒PCR诊断试剂剂盒用途猪伪狂犬病毒(PRV)聚合酶链反应(PCR)试验用于检测猪血清和组织中的PRV,适用于PRV的检测、诊断和流行病学调查。原理提取病料DNA作为模板,高温使模板的一条双链DNA变性后形成两条单链,低温使引物与互补的模板形成双链,中温时,在TaqDNA聚合酶作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,沿模板合成一条新链。每个循环包括:高温变性、低温退火、适温延伸三个过程。每一次循环使扩增的DNA片段拷贝数放大一倍。经过35次循环,使扩增的DNA片段放大了数

40、百万倍。将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到DNA片段的扩增带。试剂1.试剂组成名称数量阳性对照350LA：消化液12mlB：蛋白酶K110LC：酚/氯仿/异戊醇混合液7mlD：异丙醇6mlE：75%乙醇12mlF：灭菌去离子水650LJ：RT-PCR反应液200LK：TaqDNA聚合酶25LL:矿物油300LM:50倍TAE电泳缓冲液(50倍稀释后使用)20mlN：溴化乙锭溶液100LO：上样缓冲液50L2.试剂贮藏条件:阳性对照、B、E、J、K液(塑料袋内)于一20保存,其它试剂4保存。器材试剂盒内配有0.2mL薄壁PCR管15个。其它需要自备的物品1.仪器:分

41、析天平、台式冷冻高速离心机、真空干燥器、制冰机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮或-70冰箱、微波炉、组织研磨器、-20冰箱、可调移液器。2.耗材:眼科剪、眼科镊、称量纸、2OmL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头、灭菌双蒸水。使用注意事项1.所有接触PRV病料的物品均应合理处理,以免PRV污染实验室。2.PCR整个试验分PCR反应液配制区配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区模板提取区扩增区电泳区。严禁器材和试剂倒流。3所有试剂应在规定的温度储存,使用时拿到室温下,使用后立即放回。4N液具有致癌性

42、,小心操作。使用A液之前将其室温溶解为澄清透明。5.注意防止试剂盒组分受污染使用前将红盖管5000rpm离心15s,使液体全部沉于管底。6.不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的成分不要混用。7.严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。8.本试剂盒为10头份CSFVRTPCR诊断试剂盒,应在3次以内用完。样品制备1样品采集:病死或扑杀的动物取有明显病变脏器的病变部与健康部交界处组织:待检活动物,用注射器取血5mL,4保存,送实验室检测。2样品处理:每份样品分别处理。2.l组织样品处理:称取待检病料0.lg置组织研磨器中剪碎并研磨,加入1mLA液继续研磨。取己研磨好的待检病料上清100ul加入1.5mL灭菌离心管中,再加入500ulA液和10ulB液,混匀后,置55水浴中过夜。2.2全血样品处理:待血凝后取血清放于离心管中,8000rpm离心5m