拟南芥硝酸调控基因突变体的图位克隆毕业论文.doc

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1、拟南芥硝酸调控基因突变体的图位克隆 摘要：随着农田生态系统中氮肥的过量施用对生态系统造成的污染日益加重，提高作物对氮素的利用效率、减少氮肥对生态系统的污染成为目前的一个研究热点，迫切需要加强对调控NO3-的基因及其分子机理的研究。本研究对硝酸调控基因突变体进行筛选，并利用图位克隆技术对突变基因进行克隆，完成突变基因的初步定位，为下一步精确定位打下基础，进而发现调控硝酸代谢的新基因，并研究其功能和分子机理，为作物的高氮效利用提供理论依据。关键词：拟南芥；硝酸调控基因突变体；突变体筛选；图位克隆Map-based cloning of the nitrate regulatory mutant g

2、enein Arabidopsis thaliana Abstract: The excessive application of nitrogenous fertilizer has exerted a severe threat on the ecosystem. Improving the nitrogen use efficiency of crops, reducing the pollution of nitrogen fertilizer on ecosystems has become a new hotspot of research globally, The urgent

3、 need is to strengthen the research of NO3-regulated genes and their molecular mechanism. This research is to verify one nitrate regulatory mutant and clone the corresponding gene. Further study including new genes function and molecular mechanism will be helpful to decipher the network of NO3- regu

4、lation pathway. This will provides more theoretical basis for breeding new varieties of crops with high nitrogen use efficiency.Key words: Arabidopsis thaliana; nitrate regulatory gene mutant; mutant screen; map-based cloning. 1 前言氮素是植物生长发育所需要的最主要的大量元素之一，对作物最终产量的贡献为40%-50%，是植物体内蛋白质、核酸、磷脂和某些生长激素的重要组分

5、之一1，通过对植物光合作用、内源激素、水分吸收利用、体内抗氧化系统的影响直接或间接左右着植物的生长发育2,因此施用氮肥可提高并保持作物的高产。氮素的缺乏一方面可导致植物生长缓慢,产量下降;另一方面可使粮食作物籽粒蛋白质含量下降,降低品质3。由于氮肥生产原料可直接来自大气,几乎不受限制,因此在过去的几十年里，在发达国家和一些发展中国家例如中国和印度，农业上的施氮量急剧增加4，使农业产量得到很大的提高。然而，施到土壤中的氮肥并没有全部被作物吸收利用，相当一部分流失到环境中，造成了极大的资源浪费。研究表明，全球的氮肥有效利用率从1960年的80%下降到2000年的30% 5；中国目前氮肥年施用量是2

6、500万吨，是世界平均水平的3倍，但是氮肥的利用效率却只有30%。同时，氮肥的过量施用也带来了严重的环境问题。未被吸收的氮素通过地表径流、淋洗、以及挥发等途径流失，导致了地表水源的富氧化作用、饮用水的硝酸盐污染和土壤酸性化6、7；硝态氮的反硝化和铵态氮的挥发都可使氮素通过气体形式损失,并对大气造成污染,一方面导致温室效应,另一方面对臭氧层也有破坏作用。这些问题日趋明显，亟待解决。提高氮肥利用率,减少浪费和污染,一是要通过改进氮肥品质和施肥技术，二是要提高植物对氮肥的吸收利用效率，而提高作物的氮素利用率是解决这些问题的关键。氮素利用率高的品种只需要较少的氮肥，就能获得并保持高产，从而可以降低施氮

7、量，这样既节省能源，又减少环境污染，并且降低农民的土地投入成本。因此，培育高氮效的作物新品种对于发展可持续农业、改善生态环境和保持人类健康都具有非常重要的意义。近些年来，世界上的一些发达国家（如美国、英国等）和国际著名的公司（如孟山都、杜邦等）均设立了专门的作物氮素利用研究机构，以加强这方面的基础研究和新品种选育。我国在提高小麦、玉米等作物的氮素利用率方面也做了大量工作。但迄今为止在高氮效新品种选育方面的进展尚十分有限8，主要原因在于控制植物氮素吸收利用的过程和分子机制还不清楚。因此，迫切需要加强对调控NO3-的基因及其分子机理的研究。植物能够吸收土壤中的NO3-、NH4+和有机氮，其中以NO

8、3-形式为主。在NRT1和NRT2家族的NO3-转运蛋白的作用下，NO3-被植物的根所吸收并转运到细胞内；进入细胞后，被NO3-还原酶（NIA）还原成NO2-，然后由NO2-还原酶（NiR）将NO2-转变成NH4+，最后NH4+被同化，形成各种氨基酸9-11。NO3-既具有营养的作用，又是一个信号分子。NO3-处理拟南芥会在几分钟内诱导NO3-代谢途径中基因（NRT2.1，NIA1，NiR）的表达12，其它一些与碳代谢和能量代谢有关的基因也受到诱导13。植物对NO3-的长期效应则表现在根的生长、根系结构、根与地上部的比率和发芽率等方面的变化14，15。关于植物对氮相应的调控基因及机理，前人通过

9、反向遗传学和系统分析的方法进行了研究16，17，已发现下面几个基因参与氮的调控，较早发现的是1个转录因子：ANR1，在最近几年又报道了NLA、AtCIPK8、AtCIPK23、microRNA167、LBD37/38/39和AtNLP7 18，Tsay实验室发现了植物的第一个NO3-感应基因NRT1.119。但长期以来，由于缺乏一个有效的正向遗传学方法，在调节NO3-的基因及机理方面的研究受到严重阻碍。世界上有多个实验室试图用受NO3-诱导的启动子构建NO3-突变体筛选系统，但鲜有能有效筛选出NO3-突变体的成功报道，主要原因在于调节NO3-的顺式元件和反式因子过多，难以找到有明显调控突变的单

10、一突变体。Crawford实验室经过多年的努力，发现了第一个NO3-的顺式元件，并将之与一个单一的增强子片段和YFP相连接，从而开发合成了一个响应NO3-的启动子。利用这一启动子，设计了一套筛选NO3-调控突变体的方法。通过该方法已经筛选出了2个拟南芥突变体，并将其成功地克隆出来，经进一步鉴定，这两个基因都参与NO3-的调控20，证明该系统能有效地筛选出NO3-调控突变体。该系统采用的NO3-顺式元件和增强子片段长度都较短（分别为180bp、131bp），而且只响应NO3-，不响应NH4+，所以选出转录因子上游基因突变体的机率比用pNRT2.1:LUC系统选出的机率更大，选出的NO3-调控突变

11、体类型会更多。图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了。目前，利用上述由NO3-顺式元件、增强子和YFP构建的NO3-调控突变体筛选系统开展的拟南芥突变体筛选工作，已经得到了2个新的突变体GD75和GD69，初步的测序结果表明这2个突

12、变体不是已知调控基因突变造成的。本实验利用图位克隆法对拟南芥NO3-调控突变体GD75的突变基因进行克隆：首先将以Col为背景的SS204-9经EMS诱变得到突变体，再将其与Col野生型回交两次（清除其它可能的突变）后得到突变体GD75（遗传分析表明该突变体是由隐性突变造成的），其NO3-调控基因（以A表示正常基因）经诱变发生了突变（以a表示突变基因），之后与Ler野生型（AA）杂交得到F1代（Aa）。F1代的两条同源染色体分别为携带突变基因a的Col染色体（Col-a）与携带正常基因A的Ler染色体（Ler-A），之后F1经自交得到F2代，在此过程中同源的染色体可发生交叉互换，但在Col的突

13、变位点附近发生交叉互换的几率较低。，所以F2代群体中含有AA、Aa、aa三种基因型，筛选出aa基因型进行初步定位（Rough mapping）。设计特异性引物，使其可同时扩增Col片段与Ler片段，但所扩的Col片段（150 bp）略长于Ler片段（130 bp）。当引物与突变基因连锁时，二者相距较近，所以只能扩出突变位点附近未发生交叉互换的Col片段；当引物与突变基因不连锁时，二者相距较远，所以能扩出发生交叉互换的Col-Ler片段。找到与突变基因连锁的引物，即完成初步定位（见图1-1）。在此基础上进一步设计引物进行精细定位（Fine mapping），不断缩小范围，最终将突变基因定位于较小

14、范围内，再通过测序得到其基因序列，通过与正常基因序列的比对找到突变碱基。图1-1 初步定位流程Fig.1-1 Process of rough mapping.2 实验材料与方法2.1 实验材料2.1.1 植物材料本实验所用植物材料为以拟南芥Col生态型为背景的SS204-9、GD75、以及GD75与Ler野生型杂交得到的F1代经自交得到的F2代。2.1.2 酶和试剂2.1.2.1 酶Taq DNA Polymerase （天根生物公司） 2.1.2.2 试剂异丙醇，ddH2O，70%乙醇溶液，75%乙醇溶液，2.6%次氯酸钠吐温水：5滴Tween-20，500 mL ddH2OKNO3培养基

15、：Compound Final concn Stock mL of stock / liter mediumKPi (pH6.0) 10 mM 1 M 10KNO3 2.5 mM 1 M 10MgSO4 2 mM 1 M 2CaCl2 1 mM 1 M 1FeNa2EDTA 0.1 mM 20 mM 2.5MN solution 1x 500x 2Sucrose 0.5%(w/v) 50%(w/v) 10 Agar 10 500x MN solution: Compound Final concn 500x Stock Per liter stock H3BO3 50 microM 25 mM

16、 1.55g MnSO4.H2O 12 microM 6 mM 1.01g ZnCl2 1 microM 0.5 mM 68mg CuSO4.5H2O 1 microM 0.5 mM 125mg Na2MoO4.2H2O 0.2 microM 0.1 mM 24mg FeNa2EDTA stock solution:0.744g Na2EDTA，0.556g FeSO4，100mL H2ONH4NO3营养液：Compound Final concn Stock mL of stock / liter mediumKPi (pH6.0) 10 mM 1 M 10NH4NO3 2.5 mM 1 M

17、 10MgSO4 2 mM 1 M 2CaCl2 1 mM 1 M 1FeNa2EDTA 0.1 mM 20 mM 2.5MN solution 1x 500x 2Sucrose 0.5%(w/v) 50%(w/v) 10 DNA extraction buffer：Compound Stock mL of stock / liter medium Tris-HCl(pH8.0) 1M 100mL EDTA(pH8.0) 0.5M 100mL NaCl 5M 100mL SDS 10% 125mL H2O 575mL 电泳母液20x：Compound mL of stock / liter m

18、edium Tris base 242gglacial acetic acid 57.1mLEDTA (0.5M) 100mL 电泳工作液,琼脂糖凝胶（2%）,Taq Reaction Buffer（10），dNTP（2.5 mol/L）2.1.3 仪器和设备Eppendorf移液器，台式离心机，漩涡振荡器，电子天平，超纯水仪，PCR仪，微波炉，真空抽气泵，酸度计，电泳仪，超净工作台，恒温摇床，凝胶成像仪，荧光电子显微镜，高压蒸汽灭菌锅。2.1.4 PCR引物PCR引物由生工生物工程（上海）公司合成。编号 名称 序列（5- 3） Col片段 Ler片段Chr.1 NGA63-1 ACCCAAG

19、TGATCGCCACC 111 89 NGA63-2 AACCAAGGCACAGAAGCG 2 F26F24F1 ACAAAGCATTTTGACTTCCT 187 160 F26F24R1 CCGAGGAATGAATTTATTTATGGTA 3 F1054F1 CATGCTATAGATAGAAACAACGTTCA 166 93 F1054R1 CACAACATATAACTCATGAAGAAGACG 4 NGA280-1 GGCTCCATAAAAAGTGCACC 105 90 NGA280-2 CTGATCTCACGGACAATAGTGA5 NGA111-1 TGTTTTTTAGGACAAATG

20、GCG 128 162 NGA111-2 CTCCAGTTGGAAGCTAAAGGG Chr.6 F15L11F1 AGAGGCTGATCGGTCTGAAA 158 115 F15L11R1 ACGGTACTGGGAGATTGTGG7 CLW3-1 GAAACTCAATGAAATCCACTT 230 200 CLW3-2 TGAACTTGTTGTGAGCTTTGA8 T9J22F1 TGGAAGCTTCTCTGGACACA 110 94 T9J22R1 AAAAATAAATCTTCGTTTGTTAGTTGA9 NGA168-1 GAGGACATGTATAGGAGCCTCG 151 135 NG

21、A168-2 TCGTCTACTGCACTGCCG Chr.10 NGA172-1 CATCCGAATGCCATTGTTC 162 136 NGA172-2 AGCTGCTTCCTTATAGCGTCC11 NGA162-1 CTCTGTCACTCTTTTCCTCTGG 107 89 NGA162-2 CATGCAATTTGCATCTGAGG12 MQP15F1 TTGGATCTTCACGTGTTTGG 131 116 MQP15R1 ATGGCGGTTGACTTGGATAG13 NGA6-1 ATGGAGAAGCTTACACTGATC 143 123 NGA6-2 TGGATTTCTTCCTC

22、TCTTCAC Chr.14 ClW5-1 GGTTAAAAATTAGGGTTACGA 164 144 ClW5-2 AGATTTACGTGGAAGCAAT15 ClW6-1 CTCGTAGTGCACTTTCAATCA 162 148ClW6-2 CACATGGTAGGGAAACAATA16 M4122F1 CACTTTCATCGGCAAGTGAC 195 174M4122R1 CCCATCTCCAAAAATCGAAA17 NGA1107-1 CGACGAATCGACAGAATTAGG 150 140 NGA1107-1 GCGAAAAAACAAAAAAATCCA Chr.18 MXM12F1

23、 GCCCATTTGAAACCAACACT 117 102MXM12R1 ACTTTGGGCCTCAGGTGTTA19 NGA151-1 CAGTCTAAAAGCGAGAGTATGATG 150 120NGA151-2 GTTTTGGGAAGTTTTGCTGG20 NGA139-1 GGTTTCGTTTCACTATCCAGG 174 132NGA139-2 AGAGCTACCAGATCCGATGG21 ClW9-1 CAGACGTATCAAATGACAAATG 165 145 ClW9-2 GACTACTGCTCAAACTATTCGG22 MBG8F2 AACAAAATCAAGTGCAAATC

24、CA 151 133 MBG8R2 AGCAACCAAAGAAGCCAAAA 2.2 实验方法2.2.1 植物材料预处理对植物种子材料（SS204-9、GD75、F2代）进行消毒处理，具体方法如下：（1）取适量种子于1.5 mL Eppendorf管中。（2）用移液器取1 mL 70%乙醇溶液于管中，上下颠倒轻轻混匀，充分接触乙醇溶液，静置处理5 min（注意勿使种子残留于管壁或管盖上以防影响处理效果），之后用移液器将乙醇轻轻吸出（勿吸出种子）。（3）用吐温水冲洗一遍。（4）用移液器取1 mL 2.6%次氯酸钠溶液于管中，上下颠倒混匀，静置处理10min。（5）用吐温水冲洗五遍。（6）置于4C

25、保存待用。2.2.2 荧光筛选2.2.2.1 配制培养基按配方配制KNO3培养基，于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌处理（121C，20 min），倒入培养皿中，具体方法如下：（1）将方形培养皿于超净工作台中铺好，开紫外灯灭菌15 min。（2）于灭菌锅中取出培养基，冲洗降温至60C左右。（3）关闭紫外灯，迅速将约40 mL培养基倒入培养皿中。（4）将培养基开盖静置约15 min，待其凝固。（5）用保鲜膜包裹，注明培养基种类、制备日期。（6）置于4C保存待用。2.2.2.2 种子的准备具体过程如下：（1）在超净工作台中，取已消毒处理的种子（SS204-9、GD75、F2代），用灭菌牙签沾取种子，轻轻点

26、播于培养基中（防止将培养基划破），每板播3行，每行约点播30粒左右。（2）在盖上进行标记，标明种子种类、点播日期。（3）用封口膜进行密封。2.2.2.3 种子的处理将铺好的种子置于4C避光保存2 d。2.2.2.4 种子的培养将种子移到组培室中长日照竖直培养5 d。2.2.2.5 筛选突变体类型植株当用硝酸处理对照SS204-9时，会激发YFP产生强烈荧光，而对突变体GD75进行同样处理时显微弱荧光，因此可根据荧光的强弱挑选出F2代中显微弱荧光的突变体类型植株。具体方法如下：（1）利用荧光显微镜观察SS204-9及GD75幼苗根部，确定荧光明暗标准。（2）利用荧光显微镜观察F2代幼苗根部，挑取

27、显微弱荧光的植株，剔除强烈荧光及不发光的个体，记录。（3）将所挑去幼苗放入1.5 mL Eppendorf管中，标号，液氮处理，放入-70C保存待用。2.2.3 根长筛选2.2.3.1 营养液的配制按配方配制NH4NO3营养液，用高压蒸汽灭菌锅处理（121C，20 min），4C保存待用。2.2.3.2 种子的准备用6孔培养板进行水培，具体方法如下：（1）在超净工作台中，取6孔板，标记，SS204-9、GD75各一孔，F2代四孔。（2）于每孔中加入1.5 mL NH4NO3营养液。（3）用灭菌牙签沾取种子，播入营养液中，其中SS204-9 30粒，GD75 30粒，F2代每孔30粒（见图2-1

28、）。（4）用封口膜进行密封。2.2.3.3 种子的处理将铺好的种子置于4C避光保存2 d。2.2.3.4 种子的培养将种子移到组培室中，在长日照条件下摇床培养（90转/min）5 d。2.2.3.5 筛选突变体类型植株突变体的NO3-调控基因发生突变，影响其对硝态氮的吸收利用，进而影响其根系的生长发育，因此其植株与野生型相比在相同培养环境中根系生长缓慢且短小，故可根据这一表型对突变体进行筛选。具体方法如下：（1）取出摇床培养4 d的6孔培养板于超净工作台中，取一玻璃圆皿，用镊子夹取SS204-9、GD75各若干株。（2）以所取SS204-9、GD75为标准从F2代幼苗中选取突变体，用直尺测量根

29、长，明显短于SS204-9、约与GD75相等的个体，无法确定的植株亦剔除，记录。（3）将所挑去幼苗放入1.5 mL Eppendorf管中，标号，液氮处理，放入-70C保存待用。F2F2WT（SS204-9）Mu(GD75)F2F2图2-1 水培示意图Fig.2-1 Schematic diagram of the hydroponics.2.2.4 双重筛选结合荧光筛选与根长筛选两种方法，进行两次筛选，确保筛选出的突变体的准确性。具体过程如下：（1）取出摇床培养4 d的6孔培养板于超净工作台中，取一玻璃圆皿，用镊子夹取SS204-9、GD75各若干株。（2）以所取SS204-9、GD75为标

30、准从F2代幼苗中选取突变体，用直尺测量根长，明显短于SS204-9、约与GD75相等的个体，无法确定的植株亦剔除，记录。（3）利用荧光显微镜观察SS204-9及GD75幼苗，确定荧光明暗标准。（4）利用荧光显微镜观察挑出的幼苗，挑取显微弱荧光的植株，剔除强烈荧光及不发光的个体，记录。（5）将所挑去幼苗放入1.5 mL Eppendorf管中，标号，液氮处理，放入-70C保存待用。2.2.5 突变体的图位克隆2.2.5.1 提取突变体基因组以筛选出的突变体幼苗为材料，提取其基因组DNA，具体方法如下：（1）取材于1.5 mL Eppendorf管中，标号，加液氮充分研磨。（2）加入500 mL

31、DNA extraction buffer/异丙醇（1:1）溶液，用振荡器迅速混匀。（3）室温静置5 min。（4）13000 rpm离心10 min。（5）用真空泵吸去废液，加入75%乙醇溶液。（6）13000rpm离心5 min。（7）用真空泵吸去废液，室温开盖静置至样品干燥。（8）加入适量ddH2O（按所得基因组DNA多少而定）。（9）用振荡器混匀，13000 rpm离心1 min。（10）4C保存待用。2.2.5.2 PCR扩增突变体基因组利用所设计的引物，以所提取的突变体基因组DNA为模板进行PCR扩增。按下表所示的配方混合扩增反应体系，然后进行反应。反应程序为94C预变性5分钟；循

32、环参数为94C 变性30秒，58C 退火30秒，72C 延伸45秒，运行50个循环；在72C后延伸3分钟，反应结束。取12 mL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。 模板 2.0 mL引物1 1.0 mL引物2 1.0mL Buffer（10） 2.0 mLdNTP（2.5 mol/L） 0.4 mLrTaq酶（2.5 U） 0.2 mLddH2O 13.4mL Total 20.0 mL 首先将所提取的突变体基因组DNA每个样品取2 mL混为突变体基因大样（F2Mix），同时混制等量Col/Ler（1:1）作为野生型对照，以这两种模板配以22对引物进行PCR扩增，之后进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶

33、成像初步筛选哪种引物具连锁可能（如图2-2）。 引物1 引物2 引物3 Marker F2WTWTDL2000WTF2F2图2-2 筛选引物加样示意图Fig.2-2 Schematic diagram of loading for primers screening.然后以各突变体基因组DNA样品及野生型Col/Ler（1:1）用所筛选引物再次进行扩增、电泳、成像，通过观察引物在各样品中连锁频率来验证该引物与突变体基因是否真正连锁，若连锁，即完成初步定位（Rough mapping）（如图2-3）。样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 野生型 Marker DL2000WTF2F2F2F2F

34、2图2-3 确定引物加样示意图Fig.2-3 Schematic diagram of loading for primers determining.3 结果与分析3.1 荧光筛选结果3.1.1突变体类型植株筛选结果在KNO3培养基中培养5 d的野生型与突变体在荧光电镜下表现出明显的荧光强弱区别（如图3-1）。通过荧光电镜对F2代进行筛选，选择出荧光微弱的个体，即突变体。筛选结果如下： 培养皿编号 亮 微亮 不亮 总数 突变体比例 理论比例 1 49 6 19 74 3/37 (8%) 3/16(19%) 2 24 7 17 48 7/48 (15%) 3 28 9 13 50 9/50 (

35、18%) 4 44 18 14 76 1/7 (14%) 5 35 14 19 68 7/34 (21%) 图3-1 荧光筛选标准A:Mu(GD75):荧光微弱；B:WT(SS204-9):荧光强烈Fig.3-1 Standard of the fluorescent screening.A:Mu(GD75):the weak fluorescence；B:WT(SS204-9): the strong fluorescence.3.1.2连锁引物筛选结果将筛选出的20个突变体样品提取基因组，混为FM（F2Mix），与野生型CL（Col：Ler=1:1）一起，利用设计的22对引物进行PCR扩增

36、、电泳成像，观察连锁情况。当FM与CL相比只存在Col带或Col带亮度明显强于Ler带时，说明该引物与突变位点具连锁可能。1-11号引物（如图3-2）：由电泳结果可见5号引物FM样中两条带明暗对比鲜明，又由引物表（见2.1.4）查得5号引物所扩增的Col带为128bp，Ler带为162bp，所以Col带强于Ler带，故5号引物具有连锁可能。图3-2 1-11号引物的PCR产物电泳图谱Fig.3-2 The 1st to 11th primer electrophoretogram of PCR products.12-22号引物（如图3-3）：由电泳结果可见12号引物FM样中两条带明暗对比鲜明

37、，又由引物表（见2.1.4）查得12号引物所扩增的Col带为131bp，Ler带为116bp，所以Col带强于Ler带，故12号引物具有连锁可能。图3-3 12-22号引物的PCR产物电泳图谱Fig.3-3 The 12th to 22th primer electrophoretogram of PCR products.3.1.3 连锁引物验证结果将筛选出的5号、12号引物分别与20个突变体基因组及2个野生型（Col、Ler）基因组进行PCR扩增、电泳成像，观察连锁情况。当F2样品中与Col、Ler相比只存在Col带或Col带占绝大多数时，说明该引物与突变位点确实具连锁可能。5号引物（如图

38、3-4）：由电泳结果可见5号引物所扩20个突变体中符合连锁条件的个数为12，该比例证明5号引物与突变基因无连锁，故排除5号引物可能性。图3-4 5号引物的PCR产物电泳图谱Fig.3-4 The 5th primer electrophoretogram of PCR products.12号引物（如图3-5）：由电泳结果可见12号引物所扩20个突变体中符合连锁条件的个数为11，该比例证明12号引物与突变基因无连锁，故排除12号引物可能性。图3-5 12号引物的PCR产物电泳图谱Fig.3-5 The 12th primer electrophoretogram of PCR products

39、.3.2 根长筛选结果3.2.1突变体类型植株筛选结果在NH4NO3培养基中培养5天的野生型与突变体的根长呈现明显区别（如图3-6、图3-7）。通过测量根长对F2代的筛选，选择根系较短的个体，即突变体。图3-6 根长筛选标准A:Mu(GD75):根系短小；B:WT(SS204-9):根系发达Fig.3-6 Standard of the roots length screening.A:Mu(GD75):the short root；B:WT(SS204-9): the long root.图3-7 平均根长比较Fig.3-7 comparison of average length of the roots.筛选结果如下： 植株 突变体个数 总数 突变体比例 理论比例 F2 22 120 22/1200.18 1/4(=0.25)