龟鹿补肾丸主要成分检验方法的研究.doc

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1、本科毕业论文(设计)龟鹿补肾丸主要成分检验方法的研究二级学院医药化工学院专 业化学工程与工艺（精细化工方向）班 级2009级（2）班学生姓名学 号指导教师2013年5月诚 信 声 明我声明，所呈交的毕业论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。毕业论文（设计）作者（签名）： 年 月 日龟鹿补肾丸主要成分的检验方法的研究摘要：本文研究了龟鹿补肾丸的主要成分的定性定量检验的方法。采

2、用显微镜进行观察，同时采用TLC法对龟鹿补肾丸进行定性鉴别；使用HPLC法测定该制剂中淫羊藿苷的含量。结果：薄层色谱法用0.5NaOH溶液制备的硅胶G板，以甲苯乙酸乙酯甲酸（15:2:1）以展开剂，365nm紫外光灯照射的条件下可鉴别出该制剂中的何首乌；用硅胶G板，以三氯甲烷甲醇水（13:7:2）的下层溶液为展开剂，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，105加热的条件下能鉴别出黄芪；用硅胶G板，以甲醇丁醇三氯甲烷水（4:6:6:1）为展开剂，以5%三氯化铝乙醇溶液为显色剂，105加热，紫外光灯365nm照射下可鉴别出淫羊藿；用硅胶G板，甲苯乙酸乙酯甲酸水（20：10:1:1）的上层溶液为展开剂，展至

3、约15cm，以5%三氯化铝乙醇溶液为显色剂，365nm紫外光灯照射下可鉴别出陈皮。HPLC法含量测定中，淫羊藿苷的浓度在130gmL-1范围内呈良好线性，样品的平均加样回收率为99.87%。关键词：龟鹿补肾丸；显微鉴别；薄层色谱法；高效液相色谱法注：本论文（设计）题目来源于教师的国家级（或省部级、厅级、市级、校级、企业）科研项目，项目编号为： 。Study on Testing Methods for the Main Components of Guilu Bushen Pills Abstract This article focuses on the qualitative and qu

4、antitative test methods from the main component of the guilu bushen pills. Guilu bushen pills are treated with qualitative identification by microscopic identification method and TLC; The lcariin of the pills was determined by HPLC. Results: When TLC method is applied, Silica gel G plate prepared by

5、 0.5%NaOH solution used as the stationary phase , toluene - ethyl acetate - formic acid (mole ratio is 15:2:1) used as the developing agent, polygonum multiflorum is identified at the wavelength of 365 nm; When silica gel G plate is used as the stationary phase , chloroform - methanol - water (13:7:

6、2) solution used as as the developing agent, 10% sulfuric acid in ethanol used as chromogenic reagent, heated to 105, astragalus is identified at the wavelength of 365 nm; When silica gel G plates used as the stationary phase, methanol - butanol - chloroform - water (mole ratio is 4:6:6:1) as the de

7、veloping agent, 5% ethanol solution of aluminum chloride as chromogenic reagent, heated to 105, epimedium is identified at the wavelength of 365 nm ; When silica gel G plate used as the stationary phase ,the upper solutionof toluene - ethyl acetate - formic acid - water (mole ratio is 20:10:1:1) use

8、d as developing solvent, 5% ethanol solution of aluminum chloride as chromogenic reagent, dried tangerine peel can be identified at the wavelength of 365 nm. HPLC method for determination of the concentration of lcariin was established, curve of the concentration of lcariin from 1 to 30gmL-1 showed

9、a good linear. The sample average recovery rate is 99.87%.Keywords Guilu Bushen Pills Microscopic Identification Thin-Layer Chromatography (TLC) High Performance Liquid Chromatography 目 录1 前言12 显微观察33 薄层分析43.1龟鹿补肾丸中何首乌的检验43.2龟鹿补肾丸中黄芪的检验63.3龟鹿补肾丸中淫羊藿的检验83.4龟鹿补肾丸中陈皮的检验94 含量检验114.1水分检验114.2装量检验114.3含量测

10、定115 结论13参考文献：14致谢151 前言龟鹿补肾丸具有补肾壮阳，益气血，壮筋骨的疗效，其主要成分为陈皮、黄芪、淫羊藿、何首乌。目前市场上存在多种假冒伪劣的补肾药品，此类药品有些所含成分与国家药品标准规定不符，有些以非药品冒充药品或者以他种药品冒充，再有些是未经批准生产、进口的，变质、被污染的，所标明的适应症或者功能超出规定范围的等等，导致使用者使用后不但没有达到补肾的效果，反而出现了多种并发症。因此，对其主要成分进行定性定量检验，可保证其药效。对于有关补肾类药品的检验的发展趋势是：在改革开放以来，人们对自己的身体状况越来越重视，自20 世纪70 年代以来，补肾药品进入人们生活。其生产由

11、开始时的小作坊，发展到目前的机械化自动生产。其药品的检验方法也逐步完善，各种先进仪器投入使用，新老结合的检验方法，更能保证药品的质量。前人对龟鹿补肾丸做了以下相关研究：1987年，唐品高在新中医杂志中刊登了龟鹿补肾丸治复发性口疮的实验研究1。1995年，张永流和文贵荣在中药材期刊中刊登了龟鹿补肾丸和龟鹿补肾口服液对肾上腺皮质系统影响的研究2。1996年，张永流和文贵荣又在中药材期刊中刊登了龟鹿补肾丸和龟鹿补肾口服液对雄性生殖系统影响的研究3。2001年，曹毓卿, 林育华和徐植灵在中国中药杂志中文章2000年版（一部）饮片名称商榷写出有关龟鹿补肾丸的主要药效4 。2003年，李文静，刘洁琼，李坤

12、杰等人在中国实验方剂学杂志刊登了对龟鹿补肾丸的主要药效学的研究5，这2个实验研究指出龟鹿补肾丸具有壮精骨、益气血、补壮阳的功效，对于身体虚弱、腰腿酸软、肾亏精冷、性欲减退等症。该文研究龟鹿补肾丸对免疫和内分泌功能、生殖附性器官生长发育的作用。2004年，邱明英和罗勤在吉林中药学期刊中刊登了龟鹿补肾丸治疗脾肾阳虚型不孕症42例实验研究6。2007年，张浚, 王晖和张小兵在现代食品与药品杂志中也刊登了用HPLC测定龟鹿补肾丸中淫羊藿苷含量的研究实验，该实验研究结果表明，该合剂中酸枣仁皂苷A的含量较高；以酸枣仁皂苷A为含量测定指标，对于酸枣仁合剂镇静催眠有效部位的质量控制具有重要意义7。2008年，

13、洪育萍, 王瑜和庄锡伟在天津药学期刊中刊登了薄层扫描法测定龟鹿补肾丸中大黄素的含量的研究8。这两项研究让我在自主研究实验时，在薄层和高效液相方面的操作有了依据。2009年，徐艳娟在实用中医药杂志中刊登了龟鹿补肾丸治疗围绝经期抑郁症疗效观察的研究9。2012年，伊丽娜, 胡翊健和王建红在时珍国医国药期刊刊登了在有关补肾阳类方研究概述，该文认为，肾阳虚是肾阳虚弱，无力，气化失常，阴寒内生，并使性与生殖能力减退的病理变化，以全身功能低下伴见寒象为审证要点。文章还写出，临床除了3个方剂以外还有相应的改良方剂，如龟鹿补肾丸。该文章对方剂的药效及相关机理进行了简单的概述10。该研究对我的论文相关机理方面有

14、了不小的帮助。根据中华人民共和国药品管理法规定，凡进口药品（药材）以及出口成药必须经口岸药品检疫所检验合格后方准进出口。药品企业为保证其药品质量而设立的质量管理机构，负责药品生产全程质量监督，物料审核，产品放行，现场检查，检验药品含量，纯度等。对龟鹿补肾丸的主要成分进行检验，可有效打击假冒伪劣。目前中国生产龟鹿补肾丸的厂家主要分布在北京，广东，四川，上海等地。各厂家根据自己不同的配方生产，但产品的主要成分都不尽相同。各厂都有专门的化验室对其药品进行检验，以保证药品的药效。本文的目的是为通过对药材有效成分进行分析鉴定，提供一种鉴定方法，以确保选用的药材符合质量要求，防止有害人民健康的药品流入国内

15、。 2显微观察对龟鹿补肾丸进行显微观察，看其主要组分的组织构造在高倍数下是否清晰可见，如其特征组织构造在显微镜观察下能清晰可见，则说明该药品中含有能引起药效的主要成分，反之，则不含或含少量。取本品，置显微镜下观察，如图1所示。仪器：XSP-4C生物显微镜。 图1龟鹿补肾丸主要组分的显微观察显微观察下清晰可见龟鹿补肾丸中淫羊藿、黄芪、金樱子、酸枣仁等的主要组分的组织构造。结果表明，龟鹿补肾丸由标示的各药材组成。3薄层分析薄层色谱法（TLC）是将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层，待点样、展开后，根据比移值与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值作对比，用以进行药品的鉴别、杂质

16、检查或含量测定的方法。近年来，薄层色谱法在药品鉴定方面得到了迅速发展。由于薄层色谱法具有直观、经济、简便的特点，已成为目前药物分析中应用广泛的色谱方法。3.1龟鹿补肾丸中何首乌的检验龟鹿补肾丸中何首乌的薄层检验方法步骤如下：(1) 取本品9.04g，加甲醇30mL，放置1小时，时时振摇，滤过；(2) 滤液蒸干，残渣加水10mL，在加盐酸2mL置水浴上加热10分钟；(3) 冷却，用乙酸乙酯20mL振摇提取；(4) 分取乙酸乙酯液，置水浴上蒸干；(5) 残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液；(6) 另取何首乌对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；(7) 对样品和对照品进行薄层色谱法试验，采

17、用由0.5%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板，吸取上述供试品溶液5L，对照药材溶液12L，分别点于同一板上；(8) 以甲苯乙酸乙酯甲酸（15:2:1）为展开剂，展开；(9) 取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。将龟鹿补肾丸与何首乌对照药材色谱进行比较，结果见图2。图2何首乌的薄层检验分析图2中第1列的点为龟鹿补肾丸展开后的点，第2列为何首乌对照药材展开后的点。检测条件如下：(1) 检测温度：28(2) 检测湿度：62(3) 层析板：0.5NaOH溶液制备的硅胶G板(4) 展开剂：甲苯乙酸乙酯甲酸（15:2:1） (5) 显色剂：紫外光灯365nm结果分析：由图2可见龟鹿补肾丸色谱中，在与

18、何首乌对照药材色谱相应位置上，显相同颜色荧光斑点。3.2龟鹿补肾丸中黄芪的检验龟鹿补肾丸中黄芪的薄层检验方法步骤如下：(1) 取本品16.07g，剪碎，加硅藻土5g，研匀；(2) 超声处理30分钟，滤过，残渣加甲醇50mL；(3) 超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干；(4) 分取乙酸乙酯液，置水浴上蒸干；(5) 残渣加水30mL，温热使溶解；(6) 用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次25mL；(7) 合并正丁醇提取液，用1%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次20mL；(8) 再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20mL；(9) 正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；(10) 另取黄芪对照药材

19、1g，加乙醚20mL，同法制成对照药材溶液；(11) 再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；(12) 照薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各3l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷甲醇水（13:7:2）的下层溶液为展开剂，展开；(13) 取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰。将龟鹿补肾丸与黄芪对照药材的色谱进行比较，结果见图3。 图3黄芪的薄层检验分析图3中第 1列的点为龟鹿补肾丸展开后的点，第2列为黄芪对照药材展开后的点，第3列为黄芪甲苷对照品展开后的点。检测条件：(1) 检测温度：28(2) 检测湿度：62(3) 层析板：硅胶

20、G板(4) 展开剂：三氯甲烷甲醇水（13:7:2）的下层溶液(5) 显色剂：10%硫酸乙醇溶液(6) 条件：105加热结果分析：由图3可见龟鹿补肾丸色谱中，在与黄芪对照药材、黄芪甲苷对照品色谱相应位置上，显相同颜色荧光斑点。3.3龟鹿补肾丸中淫羊藿的检验针对龟鹿补肾丸中的成分淫羊藿，采用以下步骤进行检测：(1) 取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；(2) 照薄层色谱法试验，吸取（鉴别）(2)项下供试液4mL及对照品溶液2l，分别点于同一硅胶G薄层板上；(3) 以甲醇丁醇三氯甲烷水（4:6:6:1）为展开剂；(4) 展开，取出晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，在105

21、加热至显色清晰置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结果见图4。图4淫羊藿苷的薄层检验分析图4中第一列的点为龟鹿补肾丸展开后的点，第二列为淫羊藿苷对照品展开后的点。检测条件：(1) 检测温度：28(2) 检测湿度：62(3) 层析板：硅胶G板(4) 展开剂：甲醇丁醇三氯甲烷水（4:6:6:1） (5) 显色剂：5%三氯化铝乙醇溶液(6) 条件：105加热，紫外光灯365nm由图4可见龟鹿补肾丸色谱中，在与淫羊藿苷对照品色谱相应位置上，显相同颜色荧光斑点，初步鉴定此样品中含有淫羊藿苷。3.4龟鹿补肾丸中陈皮的检验龟鹿补肾丸中陈皮的薄层检验

22、方法步骤如下：(1) 取本品5.00g，加甲醇30mL，超声处理30分钟；(2) 滤过，残渣加水20mL，温热使溶解；(3) 用乙醚振摇提取3次，每次20mL；(4) 分取水层，用水饱和正丁醇振摇溶液洗涤3次，每次20mL，合并正丁醇液；(5) 再用正丁醇饱和的水20mL洗涤，分取正丁醇液，蒸干；(6) 残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；(7) 另取陈皮对照药材0.5g，加甲醇10mL，同法制成对照药材溶液；(8) 再取橙皮苷对照品，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液；(9) 照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液与对照药材溶液各2L，对照品溶液5L，分别点于同一硅胶G薄层板上；(10) 以乙

23、酸乙酯甲醇水（10:2:1.5）为展开剂，展至约7cm，取出，晾干；(11) 再以甲苯乙酸乙酯甲酸水（20：10:1:1）的上层溶液为展开剂，展至约15cm,取出，晾干；(12) 喷以5%三氯化铝乙醇溶液，至紫外光灯（365nm）下检视。将样品与对照药材的色谱进行比较，结果见图5。图5陈皮的薄层检验分析图5中第1列的点为龟鹿补肾丸展开后的点，第2列为陈皮对照药材展开后的点，第3列为橙皮苷对照品展开后的点。检测条件：(1) 检测温度：28(2) 检测湿度：62(3) 层析板：硅胶G板(4) 展开剂：乙酸乙酯甲醇水（10:2:1.5）展至约7cm；甲苯乙酸乙酯甲酸水（20：10:1:1）的上层溶液

24、展至约15cm(5) 显色剂：5%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯（365nm）下检视由图5可见龟鹿补肾丸色谱中，在与陈皮对照药材、橙皮苷对照品色谱相应位置上，显相同颜色荧光斑点。4 含量检验4.1水分检验按水分测定法第一法测定，应不得过11.0%。仪器：202-0型电热恒温干燥箱、FAZ104型电子天平。室温：22，湿度：53%。干燥前后称重结果如表1。表1 称重结果瓶重瓶重瓶+样称重瓶+样称重干燥后称重干燥后称重17.3421g18.1956g19.6533g20.2719g19.4410g20.0789g17.3419g18.1956g19.4392g20.0785g 水分=, 水分= 平均

25、值=。项目结论：平均值为9.3%11.0%，所以符合规定，产品合格。4.2装量检验平均装量应不少于60g；每个容器装量应不少于g。仪器：BS223S型电子天平，3次称重重量见表2。表2 称重结果第1次称重第2次称重第3次称重平均值63.127g63.774g63.252g63.38g项目结论：平均值=63.38g60g，所以符合规定，产品质量合格。4.3含量测定本品含淫羊藿以淫羊藿苷计，每1g不得少于0.20mg。仪器：LC-10ATvp型高效液相色谱仪；BS224S型电子天平。 室温：22，湿度67%，色谱条件与系统适用性实验：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相：乙腈-水（26:74），流

26、速1.0mL/min，检验波长270nm，取样量： 2.5085g; 2.5020g，淫羊藿苷对照品浓度:10.010mg/mL。进样量：20l、供试品20l。含量=含量=平均值=平均值为0.22mg/g0.20mg/g，所以符合规定，产品质量合格。5 结论文章用显微镜进行观察，同时采用TLC法对龟鹿补肾丸进行定性鉴别; 用HPLC法测定该制剂中淫羊藿苷的含量。结果：薄层色谱法在用0.5NaOH溶液制备的硅胶G板，以甲苯乙酸乙酯甲酸（15:2:1）以展开剂，365nm紫外光灯照射的条件下可鉴别出该制剂中的何首乌；在用硅胶G板，以三氯甲烷甲醇水（13:7:2）的下层溶液为展开剂，以10%硫酸乙醇

27、溶液为显色剂，105加热的条件下能鉴别出黄芪；以用硅胶G板，以甲醇丁醇三氯甲烷水（4:6:6:1）为展开剂，以5%三氯化铝乙醇溶液为显色剂，105加热，紫外光灯365nm照射下可鉴别出淫羊藿；在用硅胶G板，以乙酸乙酯甲醇水（10:2:1.5）为展开剂，展至约7cm；甲苯乙酸乙酯甲酸水（20：10:1:1）的上层溶液为展开剂，展至约15cm，以5%三氯化铝乙醇溶液为显色剂，365nm紫外光灯照射下可鉴别出陈皮。HPLC法含量测定中，淫羊藿苷的浓度在130gmL-1范围内呈良好线性,样品的平均加样回收率为99.87%。检测结果说明该药品的主要成分的含量符合规定，质量合格。参考文献 1 唐品高.龟鹿

28、补肾丸治复发性口疮J.新中医,1987, (10): 152 张永流, 文贵荣.龟鹿补肾丸和龟鹿补肾口服液对肾上腺皮质系统影响的研究J.中药材,1995, (01): 38-403 张永流, 文贵荣.龟鹿补肾丸和龟鹿补肾口服液对雄性生殖系统影响的研究J. 中药材,1996, (09): 469-4724 曹毓卿, 林育华, 徐植灵.中国药典2000年版(一部)饮片名称商榷J. 中国中药杂志, 2001, 02: 65-725 李文静, 刘洁琼, 李坤杰, 等.龟鹿补肾丸的质量控制J. 中国药师，2009, 1209: 1273-12756 邱明英, 罗勤.龟鹿补肾丸治疗脾肾阳虚型不孕症42例J

29、.吉林中医药, 2004, (01): 30 7 张浚, 王晖, 张小兵. HPLC测定龟鹿补肾丸中淫羊藿苷的含量J. 现代食品与药品杂志, 2007, 06: 37-398 洪育萍, 王瑜, 庄锡伟. 薄层扫描法测定龟鹿补肾丸中大黄素的含量J. 天津药学, 2008, (04): 34-359 徐艳娟.龟鹿补肾丸治疗围绝经期抑郁症疗效观察J. 实用中医药杂志, 2009, (07): 44310 伊丽娜, 胡翊健, 王建红.补肾阳类方研究概述J.时珍国医国药,2012, 02: 728-72911 Azamjon Soliev. Separation of Ginsenosides at E

30、levated Temperature by Ultra High Pressure Liquid ChromatographyJ. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 2007, 30(19): 19-2012 D. H. Fine. An Organic Nitrogen Specific Detector for High Pressure Liquid ChromatographyJ. Analytical Letters , 1977,10(4): 305-307致 谢本论文是在老师的悉心指导下完成的，在实验过程中，他们给予了我耐心的指导和热情的帮助！他们渊博的学识，高尚的人品，严谨求实的作风，都对我产生了极大的影响。在此我对他们表示由衷的敬意和至深的感谢！