克隆基因的表达课件.ppt

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1、第7章 克隆基因的原核表达,basic process of DNA recombination in vitro体外DNA重组的基本步骤,2.重组体的制备：将目的基因的DNA片断连接到能自我复制并带有选择性标记（如：抗菌素抗性标记）的载体分子上（DNA重组过程，需要各种工具酶的参与）,3.重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。,*,1.目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。,2,5.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物,原核生物中基因

2、的表达,操纵子,多顺反子mRNA,多肽,转录,翻译,真核生物中基因的表达,基因,前体mRNA,成熟mRNA（单顺反子）,蛋白质前体,成熟蛋白质,转录,转录后加工,转运，翻译,翻译后加工,表达体 载体 宿主第一代 原核生物表达体系 质粒、噬菌体 细菌第二代 酵母表达体系 穿梭质粒 酵母第三代 哺乳类细胞表达体系 病毒、脂质体 培养细胞第四代 基因直接导入 DNA本身 生殖细胞、体细胞、个体,表达体系的发展,contents,1 外源基因在原核生物(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、农杆菌等)中的表达2 外源基因在真核生物（酵母、植物、动物）中的表达,1 外源基因在原核细胞中的表达,1.1原核生物基因表达的

3、特点1.2 外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须的结构1.3几种类型的原核表达载体1.4提高基因表达效率的途径,1.1 原核生物基因表达的特点,只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)：催化所有RNA的合成。基因的表达是以操纵子为单位的。原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。mRNA的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及同16S核糖体RNA 3末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。,外源基因在原核细胞中

4、表达的必要条件,通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA；必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达；外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框(open reading frame，ORF)；利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。,大肠杆菌表达外源基因的优势,全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,*,大肠杆菌

5、是最常用的原核表达宿主菌。,大肠杆菌表达外源基因的劣势,缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素,*,理想的大肠杆菌表达载体,（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。（2）具有显性的转化筛选标记。（3）启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低。（4）启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制。（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点。,复制起始位点、筛选标志、启动子、转录终止子、核糖体结合位点和多克隆位点是构成表达载体的最基本元件。,1

6、.2外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须的结构,转录水平,翻译水平,启动子转录终止子,核糖体结合位点密码子质粒拷贝数,P tac=3 P trp=11 P lac,1.2.1 原核表达载体常用的启动子,启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列,Tac 启动子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5（抗葡萄糖代谢阻遏的突变型大肠杆菌）的 10 序列拼接而成的杂合启动子。调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5启动子（P tac=3 P trp=11 P lac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用 tac 启动子比用 l

7、acUV5 启动子更优越。,（1）Tac表达系统,Lac和Tac表达系统是最早建立并得到广泛应用的表达系统。大肠杆菌 JM109 等菌株常被选用为 Lac、Tac表达系统的宿主菌。,lac、tac 启动子的宿主菌,IPTG（异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷）用于诱导 lac、tac 启动子的转录，但由于 IPTG 本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG 解决方法 lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控（使用阻遏蛋白lacI的温度敏感突变株lacI（ts）。在较低温度（30）时外源基因表达受到

8、抑制，在较高温度（42）时则开放。）乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录,lac、tac 表达系统存在的问题,IPTG 诱导PGEX系列表达载体的表达,原核表达载体PGEX系列带有一个“tac”强启动子，载体上还携带Laclq基因，编码Lac抑制因子，当无IPTG存在时，Lac阻遏蛋白能抑Ptac转录，保持低水平表达。加入诱导物IPTG时它可与Lac阻遏蛋白结合，导致其构象变化，起到去阻遏作用，起动转录，高效表达。,GST基因,以噬菌体早期基因转录启动子 PL、PR 为核心构建的表达系统 PL、PR 表达系统都选用温度敏感突变体 cI 857(ts)的基因产物来调控 PL

9、、PR 启动子的转录。,（2）PL和PR表达系统,PL 和 PR 表达系统存在的问题,由于 PL 和 PR 表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用 PL 或 PR 表达系统。但在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30提高到 42 需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。,大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。

10、T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的。pET系列载体是这类表达载体的典型代表。pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统常用宿主细胞为大肠杆菌菌株BL21（DE3）（因为菌株BL21（DE3）的染色体能表达T7 噬菌体RNA聚合酶）等。,（3）T7表达系统,T7 噬菌体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启 动子的转录。T7 RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因

11、的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。常见的有化学诱导型、温度诱导型等。,T7 表达系统,（4）其他表达系统,营养调控型、糖原调控型、pH调控型等,外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 RNA 混合物。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。,1.2.2 转录终止子,目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二

12、聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用,外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。mRNA 翻译的起始效率主要由其 5端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）通常在AUG上游3-11bp，长约3-9bp,5 UAAGGAGG 3,1.2.3 核糖体结合位点（RBS）,一般来说，mRNA 与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于 SD（UAAGGAGG）序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以 GGAG 四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，

13、均会导致翻译效率大幅度降低,mRNA 与核糖体的结合程度,SD 序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻 AUG 的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。如：对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍,SD 序列与起始密码子之间序列的影响,SD序列与起始密码子 AUG之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AU

14、G之前大约7个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低,SD 序列与起始密码子之间距离的影响,大肠杆菌中的起始 tRNA 分子可以同时识别 AUG、GUG 和 UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常 GUG 为 AUG 的50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。除此之外，从 AUG 开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与 mRNA 的 5 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰 mRNA 在核糖体上的准确定位。目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与 启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。

15、,起始密码子及其后续若干密码子的影响,不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。因此对外源基因表达而言，需选择宿主细胞偏爱的密码子。,1.2.4 密码子,质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。,1.2.5 质粒拷贝数,1.3 几种类型的原核表达载体,一种典型的大肠杆菌表达载体示意图,大肠杆菌表达载体的基本成分,核糖体结合位点（与翻译有关）,转录终止子,表达载体类型,非

16、融合型表达载体：-所表达的蛋白是天然完整蛋白（具有非常接近于真核细胞体内蛋白质的结构，因此表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质。但也易被细菌蛋白酶破坏）融合型表达载体：-所表达的蛋白是融合蛋白（稳定性大大增加，不易被细菌蛋白酶降解；也易于分离纯化）分泌型表达载体：-产物可跨膜分泌至胞周间隙,1.3.1 非融合型表达载体,为了在原核生物细胞中表达出非融合蛋白，可将带有起始密码ATG的真核基因插入到原核启动子和SD序列的下游，组成一个杂合的核糖体结合区，经转录翻译，得到非融合蛋白。,*,P,SD,Foreign DNA,非融合型表达载体,非融合基因,主要元件：强启动子 SD：ATG：

17、第一个密码子,非融合型表达载体pKK223-3,Brosius等在哈佛大学的Gilbert实验室组建的 在大肠杆菌细胞中，它能极有效地高水平表达外源基因 它具有一个强的tac(trp-lac)启动子。这个启动子是由trp启动子的35区、lacUV5启动子的10区、操纵基因及S-D序列组成,tac启动子之后是一个取自pUC8的多克隆位点（MCS）定位在启动子和S-D序列后 在MCS下游的一段DNA序列中，还包含一个很强的核糖体RNA的转录终止子，目的是为了稳定载体系统载体的其余部分由pBR322组成。,1.3.2 融合型表达载体,将外源基因与载体自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅

18、读框进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。表达融合型蛋白应非常注意其阅读框架，其阅读框应与融合的DNA片段的阅读框一致，翻译时才不至于产生移码突变。在这种结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合分子中释放并回收异源蛋白,*,融合蛋白表达载体的构建,最关键的一点：两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，为目的蛋白分离回收创造条件外源基因应装在受体蛋白编码基

19、因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺,P,SD,Foreign DNA,融合型表达载体,融合基因,常见的用于构建融合蛋白的受体蛋白,谷胱甘肽转移酶（GST）：维持良好空间构象硫氧化还原蛋白（TrxA）：维持良好空间构象麦芽糖结合蛋白（MBP）：促进分泌金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）：免疫亲和层析外膜蛋白（OmpF）：促进分泌-半乳糖苷酶（LacZ）：免疫亲和层析泛素蛋白（Ubi）：维持良好空间构象,融合型蛋白表达载体pGEX系统,由Pharmacia公司构建（已被G

20、E公司收购）由3种载体pGEX-lXT，pGEX-2T和pGEX-3X以及一种用于纯化表达蛋白的亲和层析介质Glutathione Sepharose 4B组成。含有启动子tac及lac操纵基因、SD序列、lacI阻遏蛋白基因等。与其他表达载体不同之处在于S-D序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。,Ptac：适合IPTG诱导GST融合蛋白方便纯化产物切割方便：pGEX-1T凝血酶pGEX-2T-凝血酶pGEX-3T-X因子,融合型载体-pGEX系列,1.3.3 分泌型表达载体,主要元件：启动子和SD序列信号肽序列：通常位于SD序列下游，编码信号肽，

21、可引导蛋白跨膜,分泌型表达蛋白,优点：目的蛋白稳定性高：高重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳定性大约是在细胞质中的1100倍目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整：相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去,*,缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业

22、化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。,分泌型表达载体pin系统,以pBR322为基础构建的它带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即Ipp(脂蛋白基因)启动子 在启动子的下游装有lacUV5的启动子及其操纵基因 lac阻遏子的基因(1ac I)也克隆在这个质粒上,作为分泌克隆表达载体中关键的编码信号肽的序列，是取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa(外膜蛋白基因)。,SS为信号肽序列,1.4 提高基因表达效率的途径,1、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子-提高转录水平核糖体结合位点（ATG-SD）避免产物降解：分泌/融合表达（提高其稳定性）,*,2、选择合适宿主 Lac 启动子-La

23、cI菌 PL/PR-CI857 溶源菌 3、诱导表达（可减轻细胞的代谢负荷）温度诱导-PLPR/IPTG的化学诱导-Plac、Ptac 4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解,2 外源基因在真核生物中表达,宿主：酵母菌、植物细胞、动物细胞等。,2.1 外源基因在植物中的表达,见第八章,2.2外源基因在动物中的表达,重组的外源基因,动物细胞,体外培养的动物细胞,卵细胞,药物、疫苗等,转基因动物个体,人体细胞,基因治疗,转染,动物遗传性状改良药物筛选评价模型,胚胎发育,见第九章,summary,PTac、PLac、PTrp、PL、PR、PT7启动子、转录终止子、SD序列、偏爱密码、融合蛋白、非融合蛋白、分泌型蛋白、GST、大肠杆菌表达外源基因的优势和劣势？提高基因表达效率的途径？表达形式：融合表达、非融合表达、分泌型表达、诱导表达、pET系列表达载体、pGEX系列表达载体Tac表达体系（pGEX）、T7表达体系（pET）,