毛细管凝胶电泳课件.ppt

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1、第九章 高效毛细管电泳法,High-performance capillary electrophoresis HPCE,是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的一种液相分离技术。,第一节 概述,基本构造,高压直流电源,分离通道毛细管,检测器,缓冲液贮存瓶,一、基本装置,电泳 electrophoresis 是指溶液中带电粒子 在电场作用下发生迁移的电动现象。,毛细管电泳 capillary electrophoresis 是利用被分析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物

2、质。,二、基本原理,电泳分离的基础,=eE,为离子移动的速度 e为电泳迁移率 E为毛细管柱进样端至检测窗口间电场强度。,电荷-尺寸,离子的电泳迁移率不同，在电场中移动的速度不一样，利用这个原理可以把不同的离子彼此分离。电泳迁移率与分析物质所带电荷呈正比，与摩擦阻力系数呈反比。如果两种物质带有不同的电荷或者通过缓冲溶液移动的摩擦力不同，那么这两种物质可以彼此分离。,1 离子移动的速率,=eE=eU/L,U是毛细管柱两端施加的压力 L是毛细管柱总长。,2 毛细管电泳中的板高,N=eU/2D,在凝胶板形电泳中，一般最高使用的电压约为500 V。在毛细管电泳中，一般可采用20,00060,000 V的

3、高电压。,3 电渗流,当高电压通过含有缓冲溶液的毛细管柱时，管内的溶质向阴极或阳极移动，产生电渗流。在柱内层氧化硅与溶质的界面上形成双电层是电渗流产生的原因。,电渗流的正面作用：1.增加分离速度；2.使得正、负电荷物质同时分离。电渗流的负面作用：1、减少分离时间和分离有效距离；2、电渗流的波动极大的影响迁移时间的重复性。,影响电渗流的因素：,PH值：PH值越高，电渗流越大。离子强度：离子强度越高，电渗流越小。缓冲溶液添加剂：离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精,控制电渗流的三个重要手段：,采用涂层毛细管，消除电渗流的影响；改变pH，从而调整电渗流的大小。pH10以后，电渗流基本不增加；添加剂：有

4、机溶剂可以降低电渗流的大小，从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时使用。,（4）进样方式 电动进样 是将毛细管柱的一端及其相应端的电极从缓冲池中移出，放入试样杯中，然后在一准确时间范围内施加压力，使试样因离子移动和电渗流进入毛细管柱。压力进样 是用压差使试样溶液进入毛细管。,三、方法特点,瑞典化学家Tiselius建立了“移界电泳”，成功地将人血清中的蛋白质分为5个主要成分，为蛋白质化学的发展奠定了基础。,优点:1.简单方便；2.高效快速；3.操作模式多4.成本低；5.应用范围广,20世纪3040年代 蒂塞利乌斯(A.W.K.Tiselius）建

5、立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术 获得1948年诺贝尔化学奖,1981年 J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离分析方法。,第二节 主要分离模式与应用,毛细管区带电泳 CZE毛细管胶束电动色谱 MECC毛细管等速电泳 CITP毛细管等电聚焦 CIEF毛细管凝胶电泳 CGE毛细管电色谱 CEC,一、毛细管区带电泳,基于试样中各个组分间荷质比的差异进行分离的。这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满。背景电解质的浓度一般高于试样，起运载电流的作用，其离子有一定的迁移率。当电流通过时

6、，缓冲溶液中的阴，阳离子分别以一特定的速度分别向正极和负极移动。同时试样中的不同离子将按各自的恒定速度移动，形成背景电解质离子流动中伴随有试样离子的流动。如果试样中不同离子的迁移率差别很大，就能将不同离子分离。,一、毛细管区带电泳,（一）基本公式及影响因素根据组分在电场E中迁移速度不同来分离。Vep=epE=epV/L Vep：迁移速度；ep：电泳迁移率V:毛细管两端的外加电压L：毛细管的长度电泳载体的电渗流 VOS=OSE=OSV/L,V=Vep+VOS tR=L/V=L2/(ep+OS)Vn=(ep+OS)V/2Dn与外加电压及ep 和 OS 有关n随分子量增大、扩散系数D变小而提高CZE

7、主要用于能解离的组分的分离，尤其是带正电荷的阳离子的分离。,Rs=（n 1/2/4）（/平）相邻两区带的迁移速度差平为两者的平均速度/平表示分离选择性n为柱效,添加剂,添加剂类型-甲醇、环糊精、乙腈 添加剂的目的：a 改善分离；b 抑制分析物在毛细管上的吸附。,添加剂的选择：,甲醇、乙腈（百分之五到百分之五十）：降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果；增加非极性物质的水溶性。环糊精、SDS等表面活性剂：增加分离选择性，提高分析效果；降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果。非极性高分子聚合物：掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附；降低电渗流；形成一定的分子筛，提高分子大小选择性。,（

8、二）生物样本的预处理,去除蛋白，常用乙腈毛细管预处理直接进样后处理,（三）应用示例,CZE法同时测定血浆中头孢羟氨苄和甲氧苄啶的含量电泳条件石英毛细管35cm75m(i.d);分离电压20kV;操作温度25;压力方式进样3.45kPa10s;正极进样,负极柱上267nm检测;缓冲液20mmol/L 硼砂(pH7.1)。每次运行前用0.1mol/L 氢氧化钠溶液、二次重蒸水和缓冲液分别冲洗3min、3min 和5min。血浆预处理 兔血浆0.5ml加入1 倍体积量的蛋白质沉淀剂乙腈1mol/L 盐酸（955）,涡旋振荡3min,10000r/min 离心10min,取上液进行分析。,中国抗生素杂

9、志 2005 年6 月第30 卷第6 期,分析条件的选择,缓冲溶液浓度对分离的影响,硼砂缓冲体系紫外吸收低,是毛细管电泳分析中最常用的缓冲体系之一。缓冲溶液的浓度不仅影响毛细管内表面的zeta 电势,还影响溶液的粘度系数及分析物的扩散系数,最终影响分析物的分辨率和迁移时间。改变硼砂缓冲液(pH7.1)的浓度使其分别为 10、20、30、40mmol/L,结果发现当浓度大于30mmol/L 时,由于较大电流产生大量焦耳热和严重的噪声信号不利于检测限的提高,明显引起区带展宽;当浓度小于20mmol/L时,迁移时间相对延长,综合考虑,选择20mmol/L 硼酸钠溶液为缓冲溶液。,CZE中缓冲溶液的影

10、响和选择：,在所选的pH范围内有较强缓冲能力；在检测波长处有低的紫外吸收；小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。,常用的CE缓冲体系：,磷酸钠体系：宽缓冲范围硼酸钠体系：高pH范围Tris-HCl体系：低pH范围醋酸-醋酸铵体系：CE/MS常用体系,缓冲溶液pH 值对分离的影响,改变硼砂缓冲溶液(20mmol/L)的pH 值(4.2、7.1、8.0、9.2),当pH 值大于8 时甲氧苄啶与周围峰不能完全分开;当pH 值为4.2 时分离效果更差,所以最佳pH 值为7.1。,运行电压对分离的影响,考察不同的运行电压(15、20、25kV)对迁移的影响,发现当电压大于20kV 时,虽然

11、迁移时间缩短,但基线噪声、背景电流增大;当运行电压小于20kV 时,迁移时间延长,同时,低运行电压易造成管壁吸附。只有当运行电压为20kV时,背景电流适中,信噪比最高,故选用运行电压为20kV。,毛细管清洗条件的选择,临用前采用合适的预清洗好的毛细管是保证结果重现的一个必要条件,为节省预清洗时间,只在每天开机后依次用 0.1mol/L 的NaOH 清洗10min,纯水冲洗5min,背景缓冲液冲洗5min,每次测定间省去0.1mol/L NaOH 清洗之一步骤,仅用缓冲溶液清洗5min,结果大大提高了迁移时间的精密度,峰面积的精密度也相应增加。,进样方式的选择,电压进样存在电歧视现象,定量准确性

12、不高。在上述优化条件下,采用压力进样,头孢羟氨苄和甲氧苄啶的线性范围分别为 0.44.0 和0.254.0g/ml,检出限分别为0.1 和0.18g/ml(S/N=3)。该方法测得头孢羟氨苄和甲 氧苄啶的在低、中、高浓度下的回收率均在 95%以上,迁移时间的 RSD 分别为 0.43%、1.44%;峰面积的 RSD 分别为 3.34%、4.0%,日内、日间精密度均符合方法学要求。,二、胶束电动毛细管色谱,原理：在电场作用下，毛细管水相可看作流动相，胶束相可看作是“准固定相”，溶质由于在胶束相和水相中的分配系数不同，而在不同的时间流出。驱动力：电渗流和电泳可分离不带电的中性有机物,常用表面活性剂

13、,阴离子型：SDS、STS、十二烷基磺酸钠阳离子型：DTAC、DTAB非离子型：CHAPS手性：胆酸、环糊精,pH影响，低胶束向正极迁移速度大，高电渗流增大,常用改性剂及其作用,适当浓度的有机改性剂，可增加缓冲液对样品组分的溶解力。混合溶剂改变溶质在胶束相和水相间的分配系数，使弱极性和非极性物质的分离成为可能。有机改性剂可使介电常数和电渗流系数下降，保留时间增加。,胶束电动色谱的应用特点:使毛细管电泳不仅能分离离子化合物，而且还能分离中性化合物.比高效液相色谱更为高效.HPLC 分离柱效为500025000理论板数/m MECC 可达到50000500000理论板数/m 比高效液相色谱更为高速

14、.MEKC分离时间通常小于30min，但达到相仿效率的LC，需要更长的时间。,应用示例,胶束电动毛细管色谱法测定血中的硫喷妥钠,三、毛细管凝胶电泳,原理CGE 是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方式 用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构，按分子的大小分离,1987年，Cohen发表了毛细管凝胶电泳的工作。当电泳从凝胶板上移到毛细管中以后，发生了奇迹般的变化：分析灵敏度提高到能检测一个碱基的变化，分离效率达百万理论塔板数；分析片段能大能小，小到分辨单个核苷酸的序列，大到分离Mb的DNA；分析时间由原来的以小时计算缩减到以分、秒计算。,毛细管凝胶电泳是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进

15、行的电泳。凝胶具有多孔性,起类似分子筛的作用,溶质按分子大小逐一分离。凝胶粘度大,能减少溶质的扩散,所得峰形尖锐,能达到CE中最高的柱效。,常用毛细管凝胶色谱柱,聚丙烯酰胺胶聚乙烯基吡咯烷酮聚环氧乙烷,四、毛细管等电聚焦,CIEF:建立在不同蛋白质或多肽之间等电点（pI值）差异基础上的分离方法。蛋白质的等电点(pI):指蛋白质分子的表观电荷数为零时的pH值。,方法:进样等电聚焦检测先将脱盐的试样（蛋白质）以1的浓度与两性电解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱(阳极端)，置于阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端，置于阴极电解质如NaOH中。施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pH的

16、位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域内停止移动。这样pI不同的蛋白质各组分会在毛细管内很窄的不同pH区域内聚焦.在阳、阴极电解液中加入盐如NaCI或NaOH,破坏pH梯度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生迁移、检测，使不同组分的蛋白质得到分离。,特点:等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程，这一过程可用于浓缩试样组分。具有极高的分辩率，可以分离等电点相差0.01pH的两种蛋白质.注意:电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定,五、毛细管电色谱（CEC）,将HPLC的填料填充于毛细管，以样品和固定相间的相互作用为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的分离过程。,Packed-column

17、CEC PCCECOpen-tubular CEC OTCEC,焦尔热效应、塞子效应、气泡效应,Sophora subprostata,Tamsulosin坦索洛新,Individual plasma concentrationtime curves of anisodamine enantiomers after an i.g.administration of 140 mg/kg in five rabbits.(1)(6R,2S)-,(2)(6S,2R)-,(3)(6R,2R)-,(4)(6S,2S)-anisodamine.,Individual plasma concentrationtime curves of anisodamine enantiomers after an i.v.administration of 50 mg/kg in five rabbits.(1)(6R,2S)-,(2)(6S,2R)-,(3)(6R,2R)-,(4)(6S,2S)-anisodamine.,