第二章-基因工程制药课件.ppt
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1、第二章 基因工程制药,谢谢观赏,2019-5-18,第一节 概 述第二节 目的基因的获得第三节 基因表达第四节 基因工程菌的不稳定性第五节 基因工程菌中试第六节 重组工程菌的培养第七节 基因工程药物的分离纯化第八节 变性蛋白的复性第九节 基因工程药物的质量控制,第二章 基因工程制药,谢谢观赏,2019-5-18,一、基因工程技术生产药品的优点 二、基因工程药物生产的基本过程 三、国内外基因工程药物研究进展,谢谢观赏,2019-5-18,基因工程技术诞生:20世纪70年代 现代生物技术的发展 基因工程:应用DNA重组技术,按照人们的意愿,在基因水平上改变生物 遗传性,创造新的生物物种,通过工程化
2、手段为人类提供有用产品和服 务的技术。,谢谢观赏,2019-5-18,1.大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以获得(富集)的 生理活性蛋白和多肽。2.提供足够数量的生理活性物质。3.开发更多的内源性生理活性物质。4.通过基因工程和蛋白质工程对天然生理活性物质进行改造,优 化天然的生理活性物质。5.利用基因工程技术可获得新型化合物,扩大药物筛选来源。6.降低成本,提高产品质量。,谢谢观赏,2019-5-18,1.目的基因的获得 2.构建DNA重组体 上游技术 3.构建工程菌 4.工程菌的发酵 5.外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验,谢谢观赏,2019-5-18,谢谢观赏,2019-5
3、-18,目前研制的基因工程药物主要包括:1.免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体;2.细胞因子,如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子 表皮生长因子、凝血因子;3.激素,如胰岛素、生长激素、心钠素;4.酶类,如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶激 活剂、超氧化物歧化酶等。,谢谢观赏,2019-5-18,Vitamin A,谢谢观赏,2019-5-18,一、反转录法 二、化学合成法,谢谢观赏,2019-5-18,1mRNA的纯化(1)选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。(2)分离总RNA。(3)分离mRNA(多聚T纤维素),谢谢观赏,2019-5-18,2cDNA第一链的合
4、成(RT-PCR,随机引物)3cDNA第二链的合成4cDNA克隆5将重组体导入宿主细胞,谢谢观赏,2019-5-18,6cDNA文库的鉴定,谢谢观赏,2019-5-18,7目的cDNA克隆的分离和鉴定,谢谢观赏,2019-5-18,优点:准确性高、人工接头、改进、利用 局限性:1小分子量的蛋白或多肽 2已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3费用较高,谢谢观赏,2019-5-18,Vitamin B2,基因表达的成败,直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程,是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程,也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞 进攻,保护自身的过程
5、。,谢谢观赏,2019-5-18,1.原核细胞(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等)2.真核细胞(酵母、丝状真菌、动物细胞等),谢谢观赏,2019-5-18,1原核细胞(1)大肠杆菌 优点:遗传背景清晰,生长迅速。缺点:胞内表达,提取困难。包含体形式,需复性。表达后不存在修饰作用,应用受限。翻译产物的N末端常多余一个甲硫氨酸残基(AUG启始密码子 编码)容易引起免疫反应。大肠杆菌产生内毒素给纯化带来不便。蛋白酶水解作用破坏产物。,谢谢观赏,2019-5-18,1原核细胞(2)枯草芽孢杆菌 优点:分泌能力强,产物可直接到培养液中。缺点:蛋白酶水解活性更强。(3)链霉菌 优点:不致病 分泌能力强 具
6、有糖基化能力 缺点:培养条件要求高、遗传稳定性差,谢谢观赏,2019-5-18,2真核细胞(1)酵母:无毒、倍增时间短、分泌功能、糖基化作用、使之 成为理想的宿主。(2)丝状真菌:肽剪切、糖基化。(3)哺乳动物细胞:产品保真性高,生产效率低。,谢谢观赏,2019-5-18,1载体 表达载体必须具备下列条件:载体能独立复制 具有多克隆(MCS)位点和标记基因 具有很强的启动子 具有调节基因 具有很强的终止子 具有产生带有SD序列和AUG的mRNA的能力,谢谢观赏,2019-5-18,基因工程药物研究中常用的表达载体(1)PBV220系统 PL、PR串联启动子,增强启动信号。rrnB基因的终止信号
7、。PL、PR与rrnB之间有MCS及SD序列。CITS857抑制子基因(温控诱导)质粒较小(366kb),便于插入大的外源基因,谢谢观赏,2019-5-18,PBG-2:由PBV220衍生,可以表达与IgG结合的融合蛋白,并且是有蛋白剪切位点,便于表达后纯化及纯化后剪切。,谢谢观赏,2019-5-18,(2)PET系统 IPTG诱导(异丙基-硫代-D-半乳糖苷)多克隆位点上有NdeI或NCOI单一切点,切开后粘性末端为 ATG,便于外源基因插入表达。在外源基因的N末端可融合6个His,便于纯化。,谢谢观赏,2019-5-18,2影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素(1)外源基因的拷贝数(2)启动
8、子的强弱(3)SD序列的有效性(4)SD与ATG的间距(5)密码子的组成(偏爱性)(6)产物的稳定性(7)产物对宿主的影响,谢谢观赏,2019-5-18,3表达形式(1)融合蛋白,增强稳定性。(2)非融合表达。,谢谢观赏,2019-5-18,1载体 YEP类(酵母附加体质粒)由大肠杆菌质粒,2m质粒和Trp或URA3组成,ARS来自2m质粒。YRP(酵母复制型质粒)ARS来自染色体DNA、TrP1、URA3双标及大肠杆菌质粒。YCP(酵母着丝粒型质粒)除具有YRP元件外,还具有着粒成份。,谢谢观赏,2019-5-18,YIP(酵母整合型质粒)含有可与染色体进行同源重组的序列 酵母表达型质粒 分
9、泌型表达质粒 带有控制蛋白质分泌的信号序列,谢谢观赏,2019-5-18,2影响目的基因在酵母中表达的因素(1)外源基因的拷贝数(2)TATA盒启动子成分(3)分泌信号序列(4)终止序列(5)翻译后修饰(6)对宿主影响,谢谢观赏,2019-5-18,基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象,质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。,谢谢观赏,2019-5-18,1.质粒的分裂不稳定性:指工程菌分裂时出现一定比列不含质粒的子代菌的现象。主要与两个因素有关:(1)含质粒菌产生不含质粒子代的频率,质粒丢失率与 宿主菌、质粒特性和培养条件有关。(2)含质粒菌与不含质粒菌比生长速率的差异的大小。2.
10、质粒的结构不稳定性:指DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。,谢谢观赏,2019-5-18,1.选择合适的宿主菌 2.选择合适的载体 3.选择压力 4.分阶段控制培养 5.控制培养条件 6.固定化,谢谢观赏,2019-5-18,一、工程菌选择二、反应器(发酵罐)设计三、发酵培养基组成四、工艺最佳化与参数监测控制,谢谢观赏,2019-5-18,一、基因工程菌的培养方式二、基因工程菌的培养工艺三、基因工程菌的培养设备,谢谢观赏,2019-5-18,基因工程产品纯化前的性质:目的产物在体系中含量较低 体系中组份复杂(细胞、代谢物、残留培养基及无机盐等)目的产物稳定性差:对pH、温度
11、、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面活性剂等十分敏感,容易失活、变性。,谢谢观赏,2019-5-18,1.含目的产物的初始物料的特点 利用基因工程菌进行发酵生产的产物,其上游过程中的各种因素 均对分离纯化技术和工艺有直接影响。这些因素包括:(1)菌种类型、形式,各种生物学性质,产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置,表达方式(胞内、胞外、包含体),代谢物种类,产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等;(2)原材料和培养基的来源及质量是否稳定;(3)生产工艺和条件。包括灭菌方法和条件,生产方式(连续、批 式、半连续),生产周期,生产能力,工艺控制条件及方式等;(4)初始物料的物理、化学和生物学特性。
12、包括产物浓度、主要杂质 种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、流体力学性 质和热力学性质等。,谢谢观赏,2019-5-18,2.物料中杂质种类和性质 物料中杂质种类和性质包括相关性和非相关性杂质的含量、化学性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性(对热、pH、盐、有机溶剂等)、溶解度、分配系数、挥发性及吸附性能等。,谢谢观赏,2019-5-18,3.目的产物的特性 目的产物特性主要有产物的化学、物理和生物学特性。包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性(对热、冷冻、pH、盐、有机溶剂和金属离子等)、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附
13、性能、生物活性、亲和性、配基种类、表面活性等。,谢谢观赏,2019-5-18,4.产品质量要求 产品质量要求主要包括产品质量指标,产品用途,对纯度、生物活性、比活的要求。允许的杂质种类和最大允许含量,特殊杂质的种类和最大允许量,以及对使用的影响,产品剂型、贮存稳定性等。,谢谢观赏,2019-5-18,基因工程药物的分离纯化一般包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品、成品加工等步骤。,谢谢观赏,2019-5-18,谢谢观赏,2019-5-18,分离纯化的技术特点:条件温和 选择性好 收率要高 纯化过程快速,谢谢观赏,2019-5-18,1.细胞收集 2.细胞破碎,物理破碎法
14、:高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎法、高压挤压法,化学破碎法:渗透冲击、增溶法、脂溶法,生物破碎法:酶溶法(溶菌酶、甘露糖酶、壳多糖酶等),谢谢观赏,2019-5-18,超声破碎法,谢谢观赏,2019-5-18,分离细胞碎片常用的方法有:离心沉淀:高速离心、超速离心膜过滤:微滤、超滤和反渗透双水相萃取:聚乙二醇-葡聚糖 聚乙二醇-无机盐,谢谢观赏,2019-5-18,分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术包括:离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱等。,谢谢观赏,2019-5-18,1.离子交换层析:是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换 剂上的平
15、衡离子进行可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离 的一种层析方法。pH、两性分子、侧链、,谢谢观赏,2019-5-18,2.疏水层析:是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异,对蛋白质组分进行分离的层析方法。疏水层析最常用填料是多聚糖(如琼脂糖)及硅胶。利用氨基酸侧链的疏水键。,谢谢观赏,2019-5-18,3.亲和层析:是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附,这种结合既是特异的,又是可逆的,改变条件可以使这种结合解除。,谢谢观赏,2019-5-18,4.凝胶过滤层析:又称为凝胶排阻层析、分子筛层析,是以多孔性凝胶填料为固定相,按分子大小对溶液中各
16、组分进行分离的液相层析方法。大分子先从色谱柱中流出,谢谢观赏,2019-5-18,1.DNA的去除(1)DNA在pH 4.0以上呈阴离子,可用阴离子交换剂吸附除去,但目的蛋白质PI应在6.0以上。(2)如蛋白质为强酸性,则可选择条件使其吸附在阳离子交换剂 上,而不让DNA吸附上去。(3)利用亲和层析吸附蛋白质,而DNA不被吸附,也可分离。(4)疏水层析对分离也有效,在上柱时需要高盐浓度,使DNA-蛋 白质结合物离解,蛋白质吸附在柱上,而DNA不被吸附。,谢谢观赏,2019-5-18,2.热原质的去除(1)整个生产过程在无菌条件下进行,防止产生热原质。(2)所有层析介质在使用前先除去热原质,在2
17、8下进 行操作,洗脱液需先经无菌处理,流出的蛋白质溶液 也应无菌处理,即通过0.2m微滤膜,并在28下保存。,谢谢观赏,2019-5-18,3.病毒的去除 成品中必须检查是否含有病毒。病毒主要来源于宿主细胞。经过色谱分离,一般能除去病毒,必要时可以用紫外线照射使病毒失活,或过滤将病毒除去。,谢谢观赏,2019-5-18,根据产物表达形式来选择根据分离单元之间的衔接选择根据分离纯化工艺的要求来选择(1)要具有良好的稳定性和重复性。(2)要尽可能减少组成工艺的步骤。(3)组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调,工艺与设 备也能相互适应。(4)在工艺过程中要尽可能少用试剂,以免增加分离纯化步骤
18、,或干 扰产品质量。(5)工艺时间要尽可能短。(6)工艺和技术必须高效,收率高,易操作,对设备要求低,能耗低。(7)具有较高的安全性。,谢谢观赏,2019-5-18,一、包含体形成的原因二、包含体的分离和溶解三、包含体蛋白复性方法,谢谢观赏,2019-5-18,包含体形成的原因主要是高水平表达的结果。在高水平表达时,新生肽链的聚 集速率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包含体的形成。重组蛋白在大肠杆菌中表达时,缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子,如折叠酶和分子伴侣等,也导致包含体的形成。,电镜下包含体颗粒,谢谢观赏,2019-5-18,包含体虽然由无活性的蛋白组成,但包含体形成对重组蛋白
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