革兰氏染色试验步骤课件.ppt

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1、实验一 显微镜（油镜）的使用和细菌 的三种基本形态观察,一、实验目的1、学习并掌握油镜的基本原理和使用方法。2、观察和识别细菌的三种基本形态。,二、基本原理,1、增加照明强度 在油镜与载玻片之间加入与玻片的折射率相仿的镜油，使进入物镜的光线不会由折射或反射造成损失，基本上全进入镜头，结果提高了照明强度，使图像更加清晰。折射率(n)空气 1.00 水 1.33 香柏油 1.52 玻璃 1.55,2、增加显微镜的分辨率 分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离的能力。D值愈小则表明分辨力愈强。D=0.61/NA NA=nsin/2：光波波长 NA：物镜的数值孔径值 n：介质折射率：镜口角（总是小于18

2、0）,三、实验器材,1、标本：细菌三型玻片。2、试剂：香柏油、镜头清洗液（V乙醚:V酒精7:3）。3、器具：显微镜（有油镜）、擦镜纸、玻璃棒等。,四、实验步骤,1、放置标本:将染色的细菌三型玻片置于镜台上。2、找合适的视野:先用低倍镜寻找合适的视野并将欲观察的部位其移到视野中央。3、转换油镜：将油镜转到工作位置。4、调节聚光器与油镜数值孔径一致：将聚光器上升到最高位置，可变光阑开到最大。5、加香柏油：使油镜镜头浸入香柏油中。注意油镜镜头千万不要压在玻片标本上。6、调焦：转动粗调焦螺旋，再缓慢地提升油镜调焦至物像清晰。注意下降或上升镜筒或载物台绝不可用力过猛。7、观察:仔细观察细菌的三种基本形态

3、8、显微镜用毕后的处理:上升镜筒，取下玻片，清洁油镜,棒状杆菌,螺旋菌,注意事项,1、油镜工作距离短，故操作时要特别谨慎，切忌用眼 睛对着目镜边观察边下降镜筒，而应从侧面注视。2、调焦时，应特别注意，切勿将粗调节器向反方向(由高向低)转动而损失镜头和玻片。,实验报告,1、绘细菌三种基本形态图2、简述油镜的工作原理,实验二 细菌的芽孢染色和 革兰氏染色法,一、实验目的1、学习并掌握革兰氏染色和芽孢染色的原理和方法。2、了解革兰氏染色和芽孢染色在细菌分类鉴定中的重要性。,1、革兰氏染色原理 革兰氏染色法是Gram发明的一种细菌鉴别染色法，通过这种染色方法，可将细菌分为两大类：一类被染成紫色，称为革

4、兰氏阳性细菌；一类被染成红色，称为革兰氏阴性细菌。其染色原理主要根据两类细菌的细胞壁化学组成和结构不同。,二、基本原理,二、基本原理,通过结晶紫液初染和碘液媒染后，在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫液和碘液的复合物，G+细菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联致密，因此遇脱色剂乙醇处理时，因失水而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。反之，G-细菌的细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄，交联度差，遇脱色剂乙醇后，以类脂为主的外膜迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此细胞褪成无色。再经番

5、红、沙黄等红色染料复染,就使G-细菌呈现红色,而G+细菌则保留紫色。,1、革兰氏染色原理,染色结果：阳性细菌（G+）：染成紫色染色结果：阴性细菌（G-）：染成红色,2、芽孢染色原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后又难以脱色这一特点，用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸，在加热条件下，延长染色时间，使染料不仅进入菌体也进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂番红复染后，芽孢仍保留初染剂的绿色，而菌体则被染成复染剂的红色。,三、实验器材,1、菌种：大

6、肠埃希氏菌（Escherichia coli）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。2、试剂：革兰氏染液:草酸铵结晶紫染液、卢戈氏典液、95%乙醇、番红复染液；芽孢染液:5%孔雀绿染色液、0.5%番红水溶液。3、器具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、镊子、木夹、香柏油、酒精乙醚液、擦镜纸等。,1、革兰氏染色,四、实验步骤,2、芽孢染色,染色结果（革兰氏染色）,枯草芽孢杆菌（革兰氏染色）,大肠杆菌（革兰氏染色）,染色结果（革兰氏染色）,金黄色葡萄球菌（革兰氏染色）,染

7、色结果（芽孢染色）,枯草芽孢杆菌（芽孢染色）,1、革兰氏染色关键是脱色时间，如脱色时间过长，会造成假阴性。如脱色时间过短，会造成假阳性。2、革兰氏染色的菌种，选用培养18-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3、芽孢染色的菌种的菌龄，应使大部分芽孢仍保留在菌体内为宜。芽孢杆菌一般在37下培养12-14h效果最佳。4、在孔雀绿加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。,注意事项,实验报告,1、绘枯草芽孢杆菌图2、将革氏染色结果填于下表,实验视频,实验三 放线菌和真菌的形态 特征观察,一、实验目的1、学习观察放线菌和真菌形态的基本方法。2、观察放线菌和

8、真菌的形态特征。,放线菌：放线菌是无隔分枝的菌丝体，为革兰氏阳性菌。典型放线菌的菌丝体分化产生各种形态特征：,二、基本原理,扦片法：将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，可观察到不同生长时期放线菌自然生长状态下的形态特征。,真菌,三、实验器材,1、菌种：细黄链霉（Streptomyces microflavus）红酵母（Rhodotorula SP）产黄青霉（Penicillium chrysogenum）黑曲霉（Aspergillus niger）黑根霉（Rhizopus nigricans）总

9、状毛霉（Mucor racemosds）2、培养基：高氏1号琼脂、麦芽汁琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂或查氏培养基。3、试剂：0.1%美蓝染液、乳酸石炭酸棉蓝染色液、50%乙醇。4、器具：显微镜、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、接种杯、解剖针、擦镜纸等。,放线菌形态观察方法（扦片法）,四、实验步骤,倒平板：冷至约50倒平板约20ml，凝固待用。,接种：用接种环挑取菌种在琼脂平板上划线接种。,扦片：用灭菌的镊子夹起盖玻片以约45扦入平板内（扦在接种线上）,培养：倒置平板，28培养5-7天。,镜检：拔出盖玻片，擦去背面培养物，将有菌的一面放在载玻片上，直接镜检或将有菌的一面朝下，放在滴有0.1%美蓝染色液载

10、玻片中镜检。,1 盖玻片2 培养基,酵母菌形态观察方法（美蓝浸片法）,霉菌形态观察方法（直接制片法）,注意事项,1、镜检时请特别注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。2、染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖片时，染液过多会溢出，过少会出现大量气泡而影响观察。3、制片时，用镊子或解剖针小心将菌丝分开，要尽可能保持霉菌自然生长状态和完整性。,放线菌和真菌形态,放线菌,酵母菌,黑曲霉菌,青霉菌,根霉菌形态,根霉菌（无性孢子和有性孢子）,实验报告,绘细黄链霉菌、红酵母菌、产黄青霉菌和黑曲霉菌的形态图。,实验四 微生物显微镜直接 计数法,一、实验目的1、明确血细胞计数板计数的原理2、掌握血细胞计

11、数板进行微生物计数的方法。,常用的测定微生物数量方法有镜检直接计数法和平板菌落计数法。镜检直接计数法采用血细胞计数板。构造如下：,二、基本原理,平面图,侧面图,盖玻片,计数室,方格网，分为9个大格，中央大格E为计数室,放大的计数室，分25中格,放大的中格，分16小格,小格 中格,计数室全貌,1mm2共分400小格厚1mm，可得总数,二、基本原理,计数室大方格的边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，计数室与盖玻片高度为 0.1mm，计数室体积为0.1mm3（万分之一毫升）。计数时先计5个中方格（计5个点）的总菌数，然后求得每个中方格的平均数，再乘以中格数（25或16），就得出一个大方格（

12、0.1mm3）计数室中的总菌数，再乘以104（换算成1mm 含菌量）及菌液的稀释倍数，即可算出1mm 原菌液中的总菌数值。,1、菌种：红酵母菌（Rhodotorala sP）。2、试剂：无菌生理盐水。3、器具：显微镜、血细胞计数板、吹风机、盖玻片、无菌滴瓶（内装玻璃珠）、无菌毛细管、擦镜纸、吸水纸等。,三、实验器材,四、实验步骤,菌悬液制备：以计数室内每小格5-10酵母菌为宜。,清洗计数板：自来水冲洗计数板后用吹风机吹干。,加菌液：用毛细管吸取酵母菌悬液滴加在盖玻片边缘，让菌液沿缝隙自动进入计数室。,显微镜计数：每个计数室选5个中格（4个角各1个和中央1个）计数。,计算,清洗血细胞计数板：用水

13、冲净，后用吹风机吹干，放入计数板盒中。（切勿用硬物洗刷）,注意事项,1、取样前，必须将菌悬液摇匀。2、计数室内不可有气泡。3、凡压在中格线上的菌体，切莫四边全计，常只计上方和右边两条线上的。4、计数时，遇出芽的酵母菌，芽体大小达到母 细胞直径的一半时计为2个。,实验报告,1、将结果填入下表,实验五 显微测微尺的使用和 微生物大小的测定,一、实验目的 1、学习并掌握用显微测微尺测定微生物大小的原理和方法。2、增强微生物细胞大小的感性认识。,二、实验原理,微生物大小的测定，需要借助于特殊的测量工具显微测微尺（包括镜台测微尺和目镜测微尺）,镜台测微尺：中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等

14、分为100格，每格长0.01mm（即10m）。,目镜测微尺：可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格两种。,用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺校正目镜测微尺，求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的长度m（校正值）。然后根据目镜测微尺测量的微生物格数，即可计算出微生物细胞的实际大小。,图示为目镜尺47小格对应镜台尺7小格校正值71047149m,1、菌种：酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）2、器具：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、接种环、载玻片、盖玻片等。,三、实验器材,四、实验步骤,校

15、正 低倍镜清晰地观察镜台测微尺的刻度后，转动目镜筒使目镜尺的刻度与镜台尺的刻度平行。移动镜台尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，分别数出两重合线之间镜台尺和目镜尺所占的格数。,1、观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。2、换高倍镜校正时，务必十分细心，防止物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。,注意事项,实验报告,应用显微镜测微技术测量酵母菌菌体大小。（一）写出实验原理（二）实验结果：写出目镜测微尺的标定公式。将目镜测微尺的校正结果填入下表：,3、在高倍镜下测量酵母菌大小，将结果填入下表：,实验六 化学和物理因素对 微生物的影响,一、实验目的1、掌握培养基配制的一般方法和干热灭菌、高压蒸汽

16、灭菌的原理和方法。2、了解常用化学消毒剂和紫外线对微生物作用的原理、方法和杀（抑）菌能力。,二、实验原理,1、干热灭菌,利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。,2、高压蒸汽灭菌,将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽，从而增加灭菌器内的压力，使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。,3、常用化学消毒剂,重金属离子 与菌体蛋白质结合而使之变性，或与酶蛋白的巯基相结合而使酶失活；重金属盐 是蛋白质沉淀剂，或与代谢产物发生螯合作用而使之变为无效化合物；有机溶剂(酚、醇、醛等)使蛋白质及核酸变性，也可破坏细胞膜

17、透性使内含物外溢卤族元素及其化合物：碘可与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合而使蛋白质失活，氯气与水发生反应产生的强氧化剂也具有杀菌作用；有机染料 在低浓度条件下可抑制细菌生长，革兰氏阳性菌更加敏感；表面活性剂 能降低溶液表面张力，这类物质作用于微生物细胞膜，改变其透性，同时也能使蛋白质发生变性。,4、紫外线,紫外线杀菌机理主要是因为它作用于细胞内的DNA（脱氧核糖核酸），诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。,1、菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。3、试剂：2.5碘酒，5石炭酸，75乙醇，0.05龙胆紫，1%来苏尔

18、，无菌生理盐水。4、器具：高压蒸气灭菌锅、电子天平、无菌培养皿、三角瓶、烧杯、量筒、刻度吸管、三角涂棒、玻棒、漏斗、药匙、pH试纸(PH 5.59.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、棉线、纱布、无菌滤纸片、剪刀、镊子、等。,三、实验器材,四、实验步骤,(一)化学因素对微生物的影响化学消毒剂对微生物的杀(抑)菌作用(滤纸片法)1、用无菌吸管吸取0.5ml的大肠杆菌（培养24h）菌悬液加入到上述平板中。2、将已灭菌并冷至50左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿中（约1520ml），充分混匀，水平放置待凝固。3、将已凝固好的带菌平板底皿划分成46等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称。4、用无菌镊子将

19、已灭菌的小圆滤纸片(直径5mm)分别浸入装有各种消毒剂溶液的试剂瓶中浸湿。取出滤纸片时要在瓶口沥去多余药液，以保证各滤纸片所含消毒剂溶液量基本一致。5、无菌操作将滤纸片贴在平板相应区域平板中间贴上浸有无菌生理盐水的滤纸片作为对照。6、将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于37温箱中，24h后观察记录抑(杀)菌圈的大小。,紫外线对微生物的影响1、制备菌悬液（大肠杆菌）2、溶化培养基3、倒平板4、接种（涂布法）5、加一块灭菌三角形黑纸置平板中央6、打开皿盖紫外线照射20min 7、关闭紫外灯取下黑纸8、倒置培养（37培养24h）9、观察记录结果8、倒置培养（37培养24h）9、观察记录结果,(二)物理

20、因素对微生物的影响,注意事项,1、干热灭菌结束后，一定要等箱内温度降到70左右才能打开箱门取物，否则冷热空气相遇会引起玻璃器皿爆炸甚至发生安全事故！2、高压蒸汽灭菌完毕，压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力骤然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，污染棉塞，甚至引起安全事故！3、滤纸片法测定化学消毒剂的杀(抑)菌作用实验中，取出滤纸片时要在瓶口沥去多余药液，以保证各滤纸片所含消毒剂溶液量基本一致。,实验报告,2、测量常用几种化学消毒剂的抑菌圈大小，并将结果填入下表中,1、图示紫外线对微生物生长的影响,比较各化学消毒剂抑菌效果,实验七 细菌

21、鉴定中常规生理生化反应 甲基红试验与伏-普试验,一、实验目的 了解甲基红反应与伏-普反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义。,二、基本原理,1、甲基红试验：某些细菌在糖代谢过程中，将培养基中糖先分解成丙酮酸，丙酮酸再分解成甲基、乙酸、乳酸等，因而使培养基变酸，用甲基红指示剂pH4.2（红色）6.3（黄色），可使培养基由原来的桔黄色变为红色，即甲基红阳性反应。大肠杆菌为阳性反应，产气杆菌为阴性反应。,2、伏-普试验：某些细菌可利用葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进行缩合，脱羧变成乙酰甲基甲醇，此物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普反应阳性

22、，没有红色化合物产生则为阴性。产气肠杆菌伏-普反应阳性，大肠杆菌伏-普反应阴性。,三、实验器材,1.菌种：大肠杆菌，产气肠杆菌。2.培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。3.试剂：甲基红指示剂，40%KOH，5%a-萘酚4.器具：恒温培养箱，超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，接种环，记号笔，灭菌试管等。,四、实验步骤,、甲基红实验（M.R.试验）（1）接种：取3支装有葡萄糖蛋白胨水培养基试管，分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支不接种，作为对照。（2）培养：将接种的试管置37培养箱中培养48h后，加甲基红指示剂数滴摇匀（3）结果观察：呈现红色者为阳性 呈现黄色

23、者为阴性,、伏-普试验（V.P.试验）（1）接种：取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支不接种，作为对照。（2）培养：将接种的试管置37培养48h后，加入40%KOH510滴，然后再加入等量的5%a-萘酚溶液，用力振荡。（3）保温：再放入37温箱中保温30min，以加快反应速度。观察培养基的颜色变化。（4）结果观察 若培养物呈现红色，为伏-普反应阳性。,注意事项,1.在测定甲基红实验（M.R.试验）结果时，甲基红指示剂不可加的太多，以免出现假阳性反应。2.伏普反应要求在与空气充分接触下完成，因此，加入试剂后需充分振摇。,

24、实验报告,将试验结果填入下表,实验八 不同类群的土壤微生物分离,一、实验目的 1、了解微生物分离和纯化的原理 2、掌握选择培养基的配制及倒平板的方法和几种常用的分离纯化接种培养和鉴别微生物类群的基本操作技能和微生物的无菌操作技术。,二、基本原理,本实验采用平板分离法分离土壤中不同类群的微生物，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获

25、得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。主要根据菌落特征初步鉴别微生物的基本类群,三、实验器材,1、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号培养基，马丁氏培养基等。2、试剂：土壤悬液，无菌水。3、器具：超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、移液管、三角瓶、接种环、无菌培养皿、玻璃刮铲等。,四、实验步骤,1 稀释涂布平板法（1）培养基的配制：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏号琼脂培养基；马丁氏琼脂培养基（）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏号琼脂培养基；马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至5560，高氏号琼脂培养基加入10%酚数滴，马丁氏琼脂培养基加入链霉素溶

26、液。混匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿；（）制备土壤稀释液：称取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶，振动约20min，使土样与水分混合，将细胞分散.用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释的土壤溶液；,（）涂布接种：将上述每种培养基的三个平板地面分别用记号笔写上10-4，10-5，10-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4，10-5，10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml

27、对号加入已写好标记的培养基上，均匀涂布，室温下静置510min，使菌液吸附进培养基；（）培养：将高氏号琼脂培养基平板、马丁氏琼脂培养基平板倒置，于28恒温箱中培养35天，牛肉膏蛋白胨平板倒置，于37恒温箱中培养23天；（）菌落鉴别：待菌落长出后，根据菌落特征初步鉴别微生物的类群，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养止；（）菌种的移植与保存：挑取单个纯培养菌落少许，分别移植至上述相应三种培养基试管斜面上，分别置28和37恒温箱中培养，待菌苔长满斜面并确认为纯种后置4冰箱中保存。,2 平板划线分离法（1）倒平板：按稀释涂布法倒平

28、板，并用记号标明培养基名称，土样编号和实验日期；（2）划线接种与培养：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线接种，然后置恒温箱中培养。培养温度和方法同上；（）菌落鉴别：待菌落长出后，根据菌落特征初步鉴别微生物的类群，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养止；（）菌种的移植与保存：挑取单个纯培养菌落少许，分别移植至上述相应三种培养基试管斜面上，分别置28和37恒温箱中培养，待菌苔长满斜面并确认为纯种后置4冰箱中保存。,注意事项,1、高压蒸汽灭菌完毕，压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力骤然下降，内外压力不平衡，引起培养基暴沸，冲到瓶口污染棉塞，甚至引起安全事故！2.平板不能倒得太薄，为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。恒温培养时培养皿应倒置。3.在分离和接种过程中必须进行严格的无菌操作。4.用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些，否则易划破培养基。,实验报告,1、在平板上你分离得到哪种类群的微生物？简述它们的菌落特征。2、从自然界中筛选能产生高温蛋白酶的菌株，你将如何完成，请写出简明的实验方案。,