人教版教学基因工程基本操作程序-课件.ppt

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1、1.2 基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,(一)目的基因主要是_,也可是一些具有调控作用的因子。目的基因的获取方法主要有_和_两大类,编码蛋白质的基因,（二）获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成法（反转录法和化学合成法）,如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因等。,直接分离法,人工合成法,1、从基因文库中获取目的基因,（1）基

2、因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,1、原核细胞基因结构：,基因,非编码区：,非编码区：调控序列,编码区：编码蛋白质,终止子：终止转录,启动子：启动转录，RNA聚合酶结合识别位点,mRNA,翻译,特定功能的蛋白质,转录,特点：编码区是连续的，非编码区起调控作用,DNA分子,2：真核细胞基因结构：,基因,非编码区：,非编码区：,编码区：编码蛋白质,终止子,启动子,前体mRNA,外显子和内含子都转录,特点：编码

3、区间隔不连续！分为内含子和外显子。,编码蛋白质,不编码蛋白质,剪切掉内含子转录的部分,mRNA,DNA分子,提取某种生物的全部DNA,适当的限制酶,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组DNA分子,基因组文库,导入受体菌,（2）基因文库的构建方法,基因组文库的构建,有启动子和内含子,提取某生物特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体连接,cDNA文库,逆转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌,cDNA文库的构建-逆转录法：,部分基因：基因的选择性表达,无启动子和内含子,真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？,思考？

4、,真核生物：无非编码区和内含子,原核生物：无非编码区,（3）构建基因文库的目的,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,（4）从基因文库中得到目的基因的方法,2、利用PCR技术扩增目的基因,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。,原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,前提_,一段已知目的基因的核苷酸序列,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA

5、模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,：以_方式扩增，,指数,方式：,条件：,模板DNA（含目的基因）,四种脱氧核苷酸,1对引物,热稳定的DNA聚合酶(Taq酶),一段已知目的基因的核苷酸序列,过程：,PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,3、人工合成法,基因较小，核

6、苷酸序列已知（化学合成法）,化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,需要模板吗？,反转录法,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程:,第二步：基因表达载体的构建,3、基因表达载体的组成？,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代,使目的基因能够表达和发挥作用,2、基因表达载体构建的目的？（P162）,目的基因必须在启动子与终止子之间,目的基因,

7、启动子：,基因的首端，RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA,终止子：,基因的尾端，终止转录,标记基因：,鉴别受体细胞中是否含有目的基因,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的

8、表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,第三步：将目的基因导入受体细胞,转化,方法,将目的基因

9、导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,Ca2+处理法,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,基因表达载体,植物细胞,植物细胞染色体DNA上,新性状,农杆菌,（2）基因枪法微弹轰击法,特点：成本高,适用于单子叶植物,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花

10、粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,早期胚胎,新性状动物,早期胚胎培养技术,输卵管或子宫,胚胎移植技术,受体细胞？原因？,受体细胞：受精卵 受精卵的全能性高,一定是体内受精吗？,不，可以体内受精也可体外受精,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：,常用菌：,微生物作受体细胞原因：,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态

11、细胞吸收DNA,Ca2+处理法,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,Ca2+改变细胞膜的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,比较目的基因导入不同细胞的方法,农杆菌转化法,显微注射法,Ca2+处理法,体细胞,受精卵,原核细胞,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工

12、合成基因 B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达,C,第四步目的基因的表达和检测,抗虫鉴定 抗病鉴定活性鉴定等,抗原抗体杂交法,分子杂交法,DNA分子杂交法,（一）分子水平检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。,DNA分子杂交技术,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,探针：用放射性同位素标记的含有目的基因的DNA片段,（二）、鉴定（个体

13、生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分子杂交技术,方法:,抗原抗体杂交,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,如抗虫棉：让棉铃虫啃食棉铃，看其是否死亡,目的基因表达成功的标志：,通过转录、翻译产生相应的蛋白质。,基因工程成功的标志:,生物个体表现出特定的性状,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得

14、耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时

15、才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,C,基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A、人工合成目的基因 B、目的基因的检测和表达C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因与运载体结合,（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到A.用适当的酶对胰岛素基因与运载

16、体进行切割并连接B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”,ABCD,培养,培养,培养,导入,含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌,含有氨苄青霉素 的完全培养基,含有四环素的完全培养基,两种培养基均不能生长大肠杆菌,Ca2+处理细胞形成感受态细胞,检测,（培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌）,只有氨苄青霉素抗性基因质粒,只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌,不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌,完全培养基,导入,接种培养,接种培养,接种培养,含有四环素的完全培养基,完全培养基,大肠杆菌不含抗四环素基因,证明：,不存活,含有四环素的完全培养基,证明：,大肠杆菌的受体细胞含有目的基因,四环素抗性基因,四环素抗性基因,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,存活,导入,接种培养,接种培养,接种培养,接种培养,含有四环素的完全培养基,完全培养基,大肠杆菌不含抗四环素基因,证明：,不存活,含有四环素的完全培养基,证明：,大肠杆菌含抗四环素基因,证明：,大肠杆菌的受体细胞含有目的基因,四环素抗性基因,四环素抗性基因,完全培养基,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,