发酵法在谷胱甘肽研究与制备中的应用课件.ppt

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1、第一章 生物技术在食品加工中的应用,Food Biotechnology,食 品 生物 技术,基因工程在食品加工中的应用 酶工程在食品加工中的应用 细胞工程在食品加工中的应用 现代发酵工程在食品加工上的应,内容提要:,第一节基因工程在食品加工中的应用,食品基因工程:指利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗传物质，以改良食品的品质和性状、提高食品的营养价值、贮藏加工性状、酶制剂的生产和改良以及感官性状改造的技术。主要包括以下几个方面：,一、改善食品原料加工特性和改良食品品质,在动物食品原料的改良上，基因工程技术起到了非常重要的作用。如:把采用基因工程技术生产的牛奶生长激素（bovine

2、 somatotropin，BST）注射到母牛上，提高母牛产奶量。采用基因重组（recombinant）的猪生长激素，注射于猪上，便可使猪瘦肉型化，有利于改善肉食品质。,在植物食品品质的改良上，基因工程技术主要集中于改良蛋白质、碳水化合物及油脂等食品原料的产量和质量。比如基因工程油菜含油量可达50%-60%,（一）蛋白质改良,蛋白质改良的目标主要有两个:一是提高必需氨基酸的含量，二是改善蛋白质的加工性能。原因:大部分植物蛋白的营养较低：谷类蛋白质中赖氨酸(Lys)和色氨酸(Trp)，豆类蛋白质中蛋氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)等一些人类所必需的氨基酸含量较低,通过人工合成基因、同源基因或异

3、源基因导入植物细胞的途径，可获得高产蛋白质的作物或高产氨基酸的作物。已获得转基因拟南芥菜可生产富含Met（蛋氨酸）的2s白蛋白 通过基因工程技术，可将谷物类植物基因导入豆类植物，开发蛋氨酸含量高的转基因大豆。,我国学者把从玉米种子中克隆得到的富含必需氨基酸的玉米醇溶蛋白基因，导入马铃薯中，使转基因马铃薯块茎中的必需氨基酸提高了10%以上。美国F1orida Gainesvil1e（佛罗里达州盖恩斯维尔）大学的科学家将外来的高分子量面筋蛋白基因导入一普通小麦中，获得了含量更多的高分子量面筋蛋白质的小麦。这样的小麦面筋蛋白具有良好的延伸性和弹性。,（二）油脂类食品,食用油有三个重要的质量指标：营养

4、价值、氧化稳定性和功能性但这三个指标之间存在着矛盾 含较多的高不饱和脂肪酸的食用油对人的健康是有益的，但存在着氧化稳定性、加工性能差的缺点含较多的饱和脂肪酸的食用油加工性能好，但氧化稳定性hao，对健康不利。,食品工业解决此问题的方法,食品工业采用的方法是对植物油进行氢化处理但在氢化过程中不可避免地会产生反式构型脂肪酸反式脂肪酸会增加血液中低密度脂胆固醇的水平，最新研究成果表明，反式脂肪酸与心脏病的发病有线形关系。,基因工程技术与传统的育种方法结合为人们提供了改善植物油质量的新途径，它不仅可增加植物油脂肪酸中不饱和脂肪酸的含量，而且不会带来反式脂肪酸问题，还可降低饱和脂肪酸的含量，提供对人体健

5、康有益的植物油。,如：通过导入硬脂酸ACP脱氢酶的反义基因，可使转基因油菜种子中硬脂酸的含量从2%增加到40%。而将硬脂酰CoA脱饱和酶基因导入作物后，可使转基因作物中的饱和脂肪酸的含量有所下降,而不饱和脂肪酸的含量则明显增加。,美国Calgene（卡尔京：美国最早获准上市的基改食品的公司）公司正在开发高硬脂酸含量的大豆油和芥花菜油，新的大豆油和芥花菜油将含30%以上的硬脂酸，这些新油可以取代氢化油用于制造人造奶油、液体起酥油和可可脂替代品，而不含氢化油中含有的反式脂肪酸产物。,（三）碳水化合物,使用基因工程技术调节淀粉合成过程中特定酶的含量或几种酶之间的比例，从而达到增加淀粉含量或获得性质独

6、特、品质优良的新型淀粉。,高等植物体内设计淀粉生物合成的关键性酶类主要有ADP葡萄糖焦磷酸化酶（ADP glcpyrophosphorylase，AGPP）、淀粉合成酶（starch synthase，SS）淀粉分枝酶（starch branching enzyme，SBE），其中淀粉合成酶又包括颗粒凝结型淀粉合成酶（granule-bound starch synthase,GBSS）和可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase，SSS）。,比如：通过反义基因抑制淀粉分枝酶基因则可获得完全只含直链淀粉的转基因马铃薯直链淀粉油炸性能好。枝链淀粉抗老化性能好！Monsant

7、o（孟山都农业生物技术公司）公司开发了淀粉含量平均提高了2030%的转基因马铃薯。这种新马铃薯使油炸后的产品具有更强的马铃薯风味，更好的质构，较低的吸油量和较少的油味,二、改善发酵食品品质,发酵食品的品质、风味及产率是影响发酵食品工业经济效益的关键因素，而这些又都取决于所使用的微生物菌株品种但传统的微生物育种方法又难以有效地达到定向改造微生物性状的目的利用DNA重组技术、反义RNA技术及基因缺失等基因工程技术来构造所需要的基因工程菌株是解决这一问题的一条方便、快捷的途径。,（一）酱油,酱油风味的优劣与酱油在酿造过程中所生成氨基酸的量密切相关，参与此反应的羧态酶和碱性蛋白酶的基因已被克隆并转化成

8、功，在新构建的基因工程菌株中碱性蛋白酶的活力可提高5倍。羧态酶的活力可提高13倍。,酱油的制造中压榨是与产品得率密切相关的操作。与压榨有关的酶有：多聚半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶和纤维素酶、果胶酶等这些酶的基因均已被克隆高纤维素酶活力的转基因米曲霉生产酱油时，可使酱油的产率明显提高。,木糖可与酱油中的氨基酸反应生成褐色物质，从而影响酱油的风味！而木糖的生成与制造酱油用曲霉中木聚糖酶的含量与活力密切相关。用反义RNA技术抑制该酶的表达所构建的工程菌株酿造酱油，可大大地降低这种不良反应地进行，从而酿造出颜色浅、口味淡的酱油，以适应特殊食品制造的需要。,（二）啤酒,在正常的啤酒发酵过程中，由啤酒酵母细胞产

9、生的乙酰乳酸经非酶促的氧化脱羧反应会产生双乙酰。当啤酒中的双乙酰超过阈值（0.020.10mg/L）时，就会产生一种不愉快的馊酸味，严重破坏啤酒的风味与品质。去除啤酒中双乙酰的有效措施之一就是利用乙酰乳酸脱羧酶，但是酵母细胞本身没有该酶。,利用转基因技术将外源乙酰乳酸脱羧酶基因导入啤酒酵母细胞，并使其表达，是降低啤酒中双乙酰含量的有效途径。Sone等人用乙醇脱氢酶的启动子和穿梭质粒载体YeP13将产气肠杆菌乙酰乳酸脱羧酶基因导入啤酒酵母，并使其表达。当用此转基因菌株用于啤酒酿造时，可使啤酒中的双乙酰含量明显降低，且不影响其它的发酵性能和啤酒中正常风味物质。,由于用此法所构建的基因工程菌株中乙酰

10、乳酸脱羧酶基因是存在于酵母的质粒而不是染色体上，因此使该基因随着细胞分裂代数的增加而发生丢失，造成性能的不稳定。Yamano等人将外源的乙酰乳酸脱羧酶基因整合到啤酒酵母的染色体中，从而构建了稳定遗传的转基因啤酒酵母。使用这种转基因酵母酿制啤酒，也能明显降低啤酒中双乙酰含量，而且不会对啤酒酿造过程中的其它发酵性能造成不良影响。,目前各国学者最关注的是：把糖化酶基因引入酿酒酵母，构建能直接利用淀粉的酵母工程菌用于啤酒、白酒及酒精工业，能革除传统酒精工业生产中的液化和糖化步骤，实现淀粉质原料的直接发酵，达到简化工艺、节约能源和降低成本的效果。,美国的Cetus天鲸公司和日本的Suntory（三德利啤

11、酒）公司分别把酒曲霉和米根霉的糖化基因转入酿酒酵母获得成功国内也有许多学者正在从事这方面的研究。唐国敏等从黑曲霉糖化酶高产株T21合成的糖化酶cDNA，经5端和3端改造后克隆到酵母质粒YED18上，转化酿酒酵母；,罗近贤等将大麦的淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA重组进大肠杆菌酵母穿梭质粒，构建含双基因的表达分泌载体PMAG15，用原生质体转化法将之引入酿酒酵母，实现了大麦淀粉酶和糖化酶的高效表达，99%以上的酶活力分泌至培养基中。,（三）奶酪,在奶酪工业中，近年来成功地将牛胃蛋白酶的基因克隆入微生物体内并使其表达，由此构建的基因工程菌可用来生产牛胃蛋白酶，彻底解决了奶酪工业受制于牛胃蛋白酶来源

12、不足的问题，并降低了生产成本。,（四）面包,将含有地丝菌属LIPZ基因的质粒转化到面包酵母中，利用转基因酵母发酵生面团生产的面包较蓬松，内部结构较均匀。麦谷蛋白的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)和醇溶蛋白决定面包的烘烤质量。,通过对HMW麦谷蛋白亚基的结构和序列分析，发现HMW亚基在N端和C端具有非重复的氨基酸序列，而蛋白质分子的大部分序列是六肽和九肽的重复单位。N端和C端含有Cys（半胱氨酸）残基，从而形成分子间二硫键，产生很高分子质量的线性聚合物，这些聚合物使得生面团具有较好弹性。,HMW麦谷蛋白聚合物的弹性也部分地由六肽和九肽重复单位产生其结构特性，这些重复单位采取转角的构象上述研究

13、结果提示我们可以通过两种策略来改良面粉的弹性：通过增加HMW麦谷蛋白亚基因拷贝数来增加HMW的含量；引入具有超量Cys残基的HMW亚基来产生高交联的聚合物。由于HMW麦谷蛋白亚基的表达量约占总谷蛋白（grain protein）的2，所以引入一个单基因拷贝可能会产生显著的影响。,三、酶制剂的生产和改良,凝乳酶（chymosin）是第一个应用基因工程技术把小牛胃中的凝乳酶基因转移至细菌或真核微生物生产的一种酶。1990年美国FDA已批准在干酪生产中使用。由于这种酶生产寄主基因工程菌不会残留在最终产物上，符合GRAS（Generally Recognized As Safe）（一般认为安全）标准，

14、被认定是安全的，无需标示）。,重组DNA技术生产小牛凝乳酶,首先从小牛胃中分离出对凝乳酶原专一的mRNA（内含子已被切除）借助反转录酶、DNA聚合酶和St核苷酸酶的作用获得编码该酶原的双链DNA 以质粒或噬菌体为运载体导入大肠杆菌 用放射性mRNA或cDNA探针进行杂交，可以挑选出含有专一性cDNA的克隆,为使外源基因在细菌中有效表达，在上游端还需插入适当转录启动子序列，核糖体结合部位以及翻译的起始位点AUG。表达后的加工及基因的改造,耐热淀粉酶基因的克隆和表达：,大致过程是这样的。将提取的嗜热脂肪芽孢杆菌全染色体DNA，经限制性内切酶割成小片段并与PBR322质粒DNA重组，转化大肠杆菌获得

15、芽孢杆菌基因文库，从中选出目的基因克隆入芽孢杆菌表达载体并转化入芽孢杆菌中。,操作步骤如下：,提取纯化嗜热脂肪芽孢杆菌染色体DNA。提取纯化质粒PBR322及PBD6。紫外分光光度计测定染色体DNA及质粒DNA的含量。,染色体DNA的酶切。载体PBR322DNA的制备。DNA重组 质粒DNA转化及克隆菌株筛选 产生淀粉酶活力的重组菌株的鉴定 耐热淀粉酶基因的次克隆及表达。,糖化酶的研究,对于糖化酶的研究，近年来国外已有将本霉菌（A.niger、A.shirosamii、Rhizopus）糖化酶基因引入酵母中，并成功地得到表达。同时，我国也对糖化酶的基因克隆、转化、表达进行了系列研究,环状糊精

16、生产,环状糊精可将多种有机物质包埋在分子内部，从而赋予这些物质以新的物理和化学性质，广泛应用在医药、食品、化妆品等领域，具有良好的市场发展前景,由于环状糊精葡基转移酶（CGT）生产菌产酶活力低，故使环状糊精因生产成本高而使其应用受到限制。复旦大学和上海市工业微生物研究所合作，首次在国内应用染色体整合扩增技术，以嗜碱性芽孢杆菌N272作供体，克隆了CGT基因，成功地构建了高表达CGT的基因工程菌BS167。摇瓶试验糊精化酶活力最高达8 900U/mL。,采用基因工程手段改良产酶菌株，近年来还应用于超氧化物歧化酶（SOD、葡萄糖异构酶 等。,第二节酶工程在食品加工中的应用,酶在食品工业中的应用可以

17、增加产量，提高质量，降低原材料和能源消耗，改善劳动条件，降低成本，甚至可以生产出用其它方法难以得到的产品，促进新产品、新技术、新工艺的兴起和发展。具体应用包括以下几个方面：,（一）酶法生产葡萄糖,以前常用酸水解法生产葡萄糖浆，但酸水解法在右旋糖当量值（DE）高于55时产生异味。20世纪50年代末，日本成功地应用酶法水解淀粉生产葡萄糖，从此葡萄糖的生产在国内外大都采用酶法。,酶法生产葡萄糖以淀粉为原材料，先经淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成葡萄糖。淀粉酶是最早实现工业生产的酶，也是迄今为止用途最广的酶。,酶法生产葡萄糖 的优点,制造葡萄糖时酸糖化法与酶糖化法的比较.doc用于淀粉加工的酶是淀

18、粉酶和糖化酶。淀粉酶可以从淀粉分子内部任意水解1,4糖苷键，使粘度降低，水解产物为麦芽糖、低聚糖等；糖化酶从淀粉的非还原末端水解1,4键生成葡萄糖，也可水解1,6键,工艺过程,酶法生产G工艺流程.doc,操作方法,液化目的：加热淀粉浆使淀粉颗粒破裂，分散并糊化。淀粉先加水配成浓度为30%40%的淀粉浆，pH值一般调至6.06.5，添加一定量的淀粉酶后，在8090的温度下保温45min左右，使淀粉液化成糊精。由于一般细菌淀粉酶最适温度仅70，在80时不稳定，所以需要向淀粉乳液中添加Ca2+和NaCl,自1973年使用最适温度为90的地衣芽孢杆菌淀粉酶后，液化温度可提高到105115，高温淀粉酶的

19、发现和应用极大地缩短了淀粉液化时间，提高了液化效率。淀粉的液化程度以控制淀粉液的DE在1520范围内为宜。DE太高或太低对糖化酶的进一步作用不利。,随着固定化技术的发展，固定化的淀粉酶也有应用。将枯草杆菌淀粉酶固定在溴化氰活化的羧甲基纤维素上，在搅拌反应器中水解小麦淀粉。虽然固定化酶的反应活力比可溶酶低，但因为可溶酶在加热条件下易失活，发生钝化现象，因而从总的反应效果上看，固定化酶的产率较高。固定化的淀粉酶不存在外部扩散限制，可用于多次连续批式反应。,糖化,液化完成后将液化淀粉液冷却至5560，pH值调至4.55.0后加入适量的糖化酶。保温糖化48h左右，糊精就基本上转化为葡萄糖。糖化酶在食品

20、和酿造工业上有着广泛用途，是酶制剂工业的重要品种。糖化酶的产生菌几乎全部是霉菌，如黑曲霉、臭曲霉、海枣曲霉、宇佐美曲霉、雪白根霉、龚氏根霉、杭州根霉、爪哇根霉以及拟内孢霉等。,国内生产糖化酶的菌种主要是黑曲霉和根霉。黑曲霉糖化酶的最适温度在55左右如果能提高糖化酶的最适反应温度，则淀粉液化和糖化过程就可以在同一反应器中进行，既节省设备费用，降低冷却过程的能量消耗，也避免了微生物污染。因此对耐热糖化酶的研制得到了极大关注，,最近从嗜热菌Thermococcus litoralis中分离得到淀粉糖化酶，最适反应温度可以达到95。该酶如果能够大量生产，将给淀粉糖化工业带来一场革命。,（二）果葡糖浆的

21、生产,全世界的淀粉糖产量已达1 000多万吨，其中70%为果葡糖浆。果葡糖浆:由葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成部分果糖而得到的葡萄糖与果糖的混合糖浆由于葡萄糖的甜度为蔗糖的70%，而果糖的甜度是蔗糖的1.51.7倍，所以果葡糖降的甜度可达到或超过与蔗糖。相同的甜度下，糖的使用量减少了，而且摄取果糖后血糖不易升高，还有滋润肌肤的作用，因此很受人们的欢迎。,1、果糖含量及其发展,国际上按果糖含量及其发展分为三代：第一代果葡糖浆：含42%的果糖，其它成分为葡萄糖53%，低聚糖5%，浓度为70%72%，甜度与蔗糖相当第二代果葡糖浆：含果糖55%，葡萄糖40%，低聚糖5%，浓度为76%78%，甜度约为

22、蔗糖的1.1倍；第三代果葡糖浆：含果糖量在90%以上，低聚糖3%，浓度为79%80%，甜度约为蔗糖的1.4倍。此外有的国家还生产纯度为97%以上的结晶果糖。,我国从上世纪60年代开始从事第一代果葡糖浆的研制工作，1982年山东黄县酒厂建成了我国当时唯一能用自制固定化酶生产果葡糖浆的生产厂家，其异构酶转化率达到国际80年代初的先进水平。1984年我国第一个万吨级果葡糖厂在安徽省蚌埠市建成投产。目前，我国已有20多家果葡糖厂，年生产能力20万吨左右,2、工艺过程,果葡糖浆生产所使用的葡萄糖，一般是由淀粉浆经淀粉酶液化，在经糖化酶得到的葡萄糖，要求DE值大于96。将精制的葡萄糖溶液pH调解为6.57

23、.0加入0.01mol/L硫酸镁在6070的温度条件下，由葡萄糖异构酶催化生成果葡糖浆。异构化率一般为42%45%。,通常葡萄糖异构酶是以固定化形式存在的，不同的公司应用不同来源的葡萄糖异构酶和不同的固定化载体制备了各种固定化酶。固定化的葡萄糖异构酶占固定化酶整体市场的份额很大，每年有数百万吨产品,表2-4用于工业化生产的葡萄糖异构酶的固定化方法,3、注意事项,Ca2+对淀粉酶有保护作用，在液化淀粉时需要添加，但它对葡萄糖异构酶却有抑制作用，所以葡萄糖溶液需用层析等方法精制，以去除其中所含Ca2+。葡萄糖异构酶的最适pH值，根据来源不同而有所差别。一般放线菌产生的葡萄糖异构酶，其最适pH值在6

24、.58.5的范围内。但在碱性范围内，葡萄糖容易分解而使颜色加深，为此生产时一般控制pH值在为6.57.0。,葡萄糖转化为果糖的异构化反应是吸热反应。随着反应温度的升高，反应平衡向有利于生成果糖的方向变化。异构化反应的温度越高，平衡时混合糖液中果糖的含量也越高.但当温度超过70时葡萄糖异构酶容易变性失活，所以异构化反应的温度以6070为宜。在此温度下，异构化反应平衡时，果糖可达53.5%56.5%,（三）饴糖、麦芽糖、高麦芽糖浆,饴糖在我国已有2000多年的历史，传统生产是用米饭同谷芽一起加热保温做成。,近年来国内饴糖已改用碎米粉等为原料先用细菌淀粉酶液化，再加少量麦芽浆糖化，这种新工艺使麦芽用

25、量由10%减到1%，而且生产也可以实现机械化和管道化，大大提高了效率，节约了粮食。淀粉酶作用于淀粉时，是从淀粉分子的非还原性末端水解1,4键切下麦芽糖单位，在遇到支链淀粉1,6键时作用停顿而留下极限糊精，因此用麦芽糖酶水解淀粉时麦芽糖的含量通常低于40%50%，从不超过60%，如果淀粉酶与脱支酶相配合作用于淀粉，则因后者切开支链淀粉1,6键，而得到只含1,4键的直链淀粉。由于麦芽糖在缺少胰岛素的情况下也可被肝脏所吸收，不致引起血糖水平的升高，所以可适当供糖尿病患者食用。,麦芽糖的生产工艺,淀粉用淀粉酶轻度液化（DE 2以下）加热使淀粉酶失活再加入淀粉酶与脱支酶，在pH5.06.0、4060反应

26、2448h，淀粉几乎完全水解。浓缩到90%以上结晶析出纯度98%以上的结晶麦芽糖残留在母液干燥后得到低聚糖，,麦芽糖加氢还原便可制成麦芽糖醇，其甜度为蔗糖的90%是一种发热量低的甜味剂，可供糖尿病、高血压、肥胖病人食用,注意：,制造麦芽糖时，淀粉液化的DE值以低为宜，以免大量生成聚合度为奇数的糊精，导致葡萄糖生成量增加和使麦芽糖的收得率降低，一般以DE2为宜，但这样低的DE，淀粉浆粘度较高，为此宜用10%20%的淀粉乳进行生产。,工业生产的脱支酶主要来自克氏杆菌（K.pneumoniae）或蜡状芽胞杆菌变异株(B.cerreas var.mycoides)以及酸解普鲁兰糖芽孢杆菌(B.acid

27、opullulyticus)，该酶因水解茁霉多糖聚麦芽糖的1,6键，故又称为茁霉多糖酶。淀粉酶主要来自大豆（大豆蛋白质生产时综合利用的产物）及麦芽糖，微生物也生产淀粉酶（主要为多粘芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等），因这类微生物还同时生产脱支酶，故水解淀粉时麦芽糖收得率高达90%95%，但这类微生物耐热性不是很理想。,高麦芽糖浆,是含麦芽糖为主的淀粉糖浆，仅含少量葡萄糖，由于麦芽糖不易吸湿，因此国外糖果工业常用它代替酸水解淀粉糖浆。生产方法：以含固形物35%、DE10左右的淀粉糖化液加入霉菌淀粉酶（Fungamyl 800L）0.5%0.8%，于pH5.5、55水解48h脱色精制DE4050，含麦芽糖

28、45%60%、葡萄糖2%7%以及麦芽三糖等。日本是用大豆淀粉酶水解低DE液化淀粉而制成,二、酒精工业,世界范围的酿造业是当前商业中具有最稳定经济效益的行业。提高转化率或产量以获得高额利润是发展和改进技术的动力。原材料主要包括两种：糖类物质（水果汁、树汁、蜂蜜等）和淀粉类物质（谷类或根类等），后者需要在发酵前水解成单糖。当这些底物与适当的微生物一起发酵，最终会得到一种液体，它含有很多成分，酒精含量从百分之几到20%或更高。,酶传感器的用于发酵工业，使得食品发酵的过程更易于监测和控制，提高了生产效率。表2-6列出了一些常用的测定仪器。表21.doc,（一）葡萄酒,世界各地生产的葡萄酒有几百种。红葡

29、萄酒是把黑葡萄压碎，而后整个发酵而成。生产白葡萄酒时，把黑葡萄的皮去掉，或直接利用白葡萄。玫瑰红葡萄酒是由带少许皮的红葡萄发酵而来，把原料中的糖分完全发酵就成了干葡萄酒，若仍留下少量的糖分，则成了甜葡萄酒。,在葡萄酒的酿制过程中常用到的酶,1.果胶酶 分解葡萄原料中的果胶 果胶影响果汁的压榨与澄清。在葡萄酒生产过程中，使用果胶酶处理的葡萄汁或葡萄浆，可以改善压榨、过滤性能，促进果汁的澄清，从而提高原料的出汁率和出酒率。,另外，还有利于改善葡萄酒的风味。酿制白葡萄酒时，使用果胶酶后，由于改善了压榨性能，缩短了压榨时间，可防止一些单宁的过量抽出，从而提高了葡萄酒的风味。在酿制红葡萄酒时，由于果胶酶

30、可分解细胞壁的主要构成物质果胶，破坏果皮细胞结构，有利于存在于果皮细胞内的色素的浸提作用。缩短了发酵时间，也有利于葡萄酒的成熟和增加葡萄酒的香气。用量一般为1040mg/L，视添加成品酶的活力而定。,2.蛋白酶,在葡萄酒的生产中常用的是酸性蛋白酶。酸性蛋白酶能促进葡萄酒中蛋白质的水解，从而防止葡萄酒中蛋白质混浊沉淀的发生，提高了葡萄酒的非生物稳定性。,3.花青素酶,葡萄酒中的花色苷主要来源于葡萄果皮中，少数情况下也源于果肉中：如在野生种、一些欧美杂种及少数欧洲品种中。加入花青素酶可以分解葡萄酒中的游离的色素，在一定程度上能够防止红葡萄酒色素沉淀的产生，同时也可用于白葡萄酒的脱色。,4.葡萄糖苷

31、酶,在对果汁和果酒的香气成份进行研究时，人们发现其中除了游离态的挥发性萜烯类化合物风味成分外，还存在着许多以糖苷形式存在的风味物质的前体。这些前体成分随着果实成熟，在内源葡萄糖苷酶作用下，转变为相应的香气物质。但是，由于内源酶活力较低，不能完成所有的转化，因此外加葡萄糖苷酶的处理对葡萄酒成品的香气有相当好的改进效果。,5.其它酶类,葡萄糖氧化酶处理葡萄酒能有效地去除氧，阻止褐变，延长产品保存期。溶菌酶是葡萄酒中乳酸菌的有效抑制剂，使用溶菌酶能降低SO2用量，减少其对人体（累积毒性）及葡萄酒（漂白作用、硫味）的不良影响。,（二）啤酒,酿造过程如图2-2所示 啤酒酿造过程如图2.doc,1.固定化

32、啤酒酵母的应用,固定化酵母技术用于啤酒生产是在固定化酵母技术、生物反应器的设计等基础上发展起来的，它将原来的分批发酵法改为连续生产，大大提高了生产能力，并能较为容易地改进生产工艺使产品质量均一，缩短啤酒发酵和成熟时间。目前，用于啤酒生产的固定化酵母多采用包埋法，它是在一个预制的基质材料中将酵母细胞包埋进去。用海藻酸钙、DEAE纤维素等材料来固定啤酒酵母菌取得了较为满意的效果。充填固定化酵母的生物反应器主要分为固定床和流化床两种。,（1）固定化酵母技术用于啤酒主发酵。麦汁于8条件下通过装有固定化酵母的生物反应器，啤酒酵母迅速利用麦汁进行各种代谢过程，生成乙醇和各种副产物。,（2）固定化酵母技术用

33、于啤酒后发酵。在主发酵工艺阶段形成的嫩啤酒，在风味、组成等方面需经后熟工艺才能达到产品质量要求。后熟的目的主要是：完成残糖的后发酵，增加啤酒稳定性，饱和CO2充分沉淀蛋白质，澄清酒液；消除双乙酰、醛类及H2S等嫩酒味，促进啤酒成熟，尽可能使酒液处于还原态，降低氧含量。其中，酒体中双乙酰的指标，只有经过后发酵的贮酒过程，才能下降至产品要求的规定值0.2mg/kg以下。,固定化啤酒酵母 特点,大大缩短后熟时间：传统的啤酒后熟工艺需要三周左右的时间，固定化酵母技术只需数天即可生产出符合产品质量要求的啤酒。固定化酵母的生理特性随着使用时间的延长而发生变化，生物反应器操作工艺参数的正确控制及污染的有效防

34、治等，这些技术上都需要进一步完善。,2.葡聚糖酶提高啤酒的持泡性,葡聚糖是一种粘性多糖，大麦原料中的葡聚糖含量一般占干物质的5%8%适量的葡聚糖是构成啤酒酒体和泡沫的重要成分 但含量过高会给整个啤酒生产过程和产品质量带来不利影响。,在麦芽汁生产阶段，过多的葡聚糖会使糖化醪的粘度升高，麦芽汁难于过滤，延长了麦芽汁过滤时间，降低了麦芽汁得率，并容易造成麦芽汁混浊。过量的葡聚糖进入发酵液后与蛋白质结合，使啤酒酵母容易产生早期沉淀，影响发酵的正常进行 成品啤酒中的葡聚糖含量超出一定范围时，容易形成雾浊或早期凝胶沉淀，严重影响产品的品质,原料大麦中不含葡聚糖酶，在发芽过程中产生一定量的葡聚糖酶并对葡聚糖

35、进行降解作用。因此，要选用葡聚糖含量低的大麦原料，并在制麦芽过程中控制发芽条件，使葡聚糖尽可能充分降解。但在使用因发芽欠佳导致麦芽中葡聚糖降解不足的麦芽，或使用较多大麦作辅料时，往往需要添加葡聚糖酶来降低糖化醪中的葡聚糖含量，以保证糖化和发酵的正常进行。,3.酶法降低双乙酰含量,双乙酰即丁二酮（CH3COCOCH3），其含量是影响啤酒风味的重要因素，是品评啤酒成熟与否的主要依据，对啤酒质量具有决定性的影响。在啤酒生产中，双乙酰的形成与消除对促进啤酒成熟和缩短发酵周期起着重要的作用。双乙酰的口味界限值很低，仅为0.10.15mg/L，超过此阈值会使啤酒带有不愉快的馊饭味。一般成品啤酒的双乙酰含量

36、不得超过0.1mg/L。,双乙酰是啤酒酵母在发酵过程中形成的代谢副产物，一般认为双乙酰是由前体物质乙酰乳酸经非酶氧化脱羧形成。加入乙酰乳酸脱羧酶可使乙酰乳酸转化为羟基丙酮（乙偶姻），从而有效地降低啤酒中双乙酰的含量，加快啤酒的成熟。乙酰乳酸脱羧酶的用量应根据酶活力的大小和酵母活性的高低来确定，以保证成品啤酒中双乙酰的含量控制在0.1mg/L，且不影响啤酒的口感和其它理化指标,4.用固定化木瓜蛋白酶改善啤酒的品质,啤酒在长期放置过程中，啤酒所含的多酚类物质会与多肽结合，形成所谓冷混浊而变混。为了防止啤酒的混浊并保持啤酒的泡持性，Witt等人用戊二醛交联法来固定木瓜蛋白酶，用于连续水解啤酒中的多肽

37、，从而达到防止混浊的目的。又据Finlav报道，将木瓜蛋白酶吸附在壳质上，再用戊二醛交联，制成固定化木瓜蛋白酶，将其用于防止啤酒的混浊，效果良好。此法具有酶活力高，不引起啤酒品质变化，特别是不影响啤酒香味等优点。,三、蛋白制品加工工业,以蛋白质为主要成分的制品称为蛋白制品，如蛋制品、鱼制品和乳制品等。酶在蛋白制品加工中的主要用途是：改善组织，嫩化肉类，转化废弃蛋白质成为供人类使用或作为饲料的蛋白质浓缩液，因而可以增加蛋白质的价值和可利用性 蛋白酶作用后产生小肽和氨基酸，使食品易于消化和吸收。但是不同来源的蛋白酶对食品作用后产生的效果不同。,目前酶水解法可得到的蛋白制品,用木瓜蛋白水解酶制成嫩肉

38、粉，使肉食嫩滑可口；用蛋白酶生成明胶、多肽；香肠加工等；加工不宜使用的蛋白质，制造蛋白水解物。,蛋白质制品加工的其它酶类,主要有：溶菌酶处理肉类，则微生物不能繁殖，因此肉类制品可以保鲜和防腐 葡萄糖氧化酶在食品工业上主要用来去糖和脱氧，保持食品的色、香、味，延长保存时间。,四、蛋品工业,用葡萄糖氧化酶去除禽蛋中的微量葡萄糖，是酶在蛋品加工中的一项重要用途 葡萄糖的醛基具有活泼的化学反应性，容易同蛋白质、氨基酸等的氨基发生褐变反应（又称美拉德反应，maillard reaction），使蛋白质在干燥及贮藏过程中发生褐变，损害外观和风味。干蛋白是食品工业常用的发泡剂，当蛋白质发生褐变，溶解度减小，

39、起泡力和泡沫稳定性下降。为了防止这种劣变，必须将葡萄糖除去。过去虽用酵母或自然发酵法除糖，但时间长，品质不易保证。用葡萄糖氧化酶处理，除糖效率高，周期短，产品质量与效率高，并可改善环境卫生。,葡萄糖氧化酶的作用是催化葡萄糖脱氢，氧化成为葡萄糖酸，同时产生过氧化氢，后者被共存的过氧化氢酶催化分解为水和氧，一分子葡萄糖氧化酶在1min内可催化34 000个葡萄糖分子，反应如下：葡萄糖氧化酶 过氧化氢酶C6H12O6+O2+H2O C6H12O7+H2O2;2 H2O2 2 H2O+O2总反应为：C6H12O6+O2 2 C6H12O7,工业上葡萄糖氧化酶从黑曲霉、青霉等提取，最适反应pH5.6左右

40、，使用时将适量的酶与过氧化氢酶加入蛋白质中，在3540保温数小时，葡萄糖即被分解而去除添加过氧化氢酶目的：提供葡萄糖氧化时有充分的氧，残余过氧化氢被过氧化氢酶所分解，有效的葡萄糖氧化酶活力很强，在添加过氧化氢以后即可看到大量气泡形成，若过氧化氢酶活力不足应逐步补加。为了提高酶的使用效果，也研究了固定化酶的应用，将尼崎青霉（Pen.amagasakiens）葡萄糖氧化酶，同溶壁小球菌的过氧化氢酶按1006混合后包埋在聚丙烯酰胺凝胶之中，可用于蛋白质脱糖。,五、焙烤食品工业,酵母在面团中，依靠面粉本身淀粉酶和蛋白酶的作用生成麦芽糖和氨基酸来进行繁殖和发酵。使用酶活力不足或陈久的面粉，发酵力差，烤制

41、的面包体积小、色泽差，虽向面粉中补充葡萄糖或蔗糖，效果也不理想用酶活力高的面粉发酵制成的面包气孔细而分布均匀，体积大、弹性好、色泽佳因此欧美各国都把淀粉酶活力作为面粉质量指标之一。为了保证面团的质量，可添加酶进行强化。,面粉中添加淀粉酶，可调节麦芽糖生成量，使二氧化碳产生和面团气体保持力相平衡。蛋白酶可促进面筋软化，增加延伸性，减少揉面时间与动力，改善发酵效果。用于强化面粉的酶，以霉菌的酶为佳，因耐热性低，在烤焙温度下迅速失活而不致过度水解。用淀粉酶强化面粉可防止糕点老化。用蛋白酶强化的面粉制通心面条，延伸性好，风味佳。糕点馅心常用淀粉为填料，添加淀粉酶可改善馅心风味。糕点制造加入转化酶，使蔗

42、糖水解为转化糖，防止糖浆中蔗糖晶析。,美国、加拿大制造白面包时，还广泛使用脂肪氧化酶（这种酶存在于大豆、小麦中，可使不饱和脂肪酸氧化）。在脂肪氧化酶的作用下，使面粉中不饱和脂肪氧化并同胡萝卜素等发生共轭氧化作用而将面粉漂白。此外这种酶由于氧化面粉中不饱和酸，生成芳香的羰基化合物而增加面包风味，改善面团结构。,乳糖酶也用于添加脱脂奶粉的面包制造，乳糖酶分解乳糖生成发酵性糖，促进酵母发酵，改善面包色泽,七、水果加工业,用于水果加工保藏的酶有：果胶酶、柚苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖氧化酶以及过氧化氢酶等。,（一）用于除果胶，提高出汁率和澄清果蔬汁 果蔬中的果胶是植物细胞的间隙物质。它在酸性和高

43、浓度糖溶液中可以形成凝胶。这一特性是制造果冻、果浆等食品的物质基础。但在果汁加工中，由于果胶具有很高的粘稠度，它的存在给榨汁、过滤和澄清带来困难。果胶酶可以催化果胶分解，使其失去产生凝胶的能力。工业上用黑曲霉、文氏曲霉或根酶所产生的果胶酶，处理破碎的果实，可以加速果汁过滤，促进果汁澄清，提高果汁产量。,（二）用于橘子囊衣的脱除在制造桔子罐头时，用黑曲霉所产生的纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的联合酶处理桔瓣，可以从桔瓣上除去囊衣。,（三）用于柑橘类水果的果汁脱苦形成柑橘类果汁苦味的物质主要是柚皮苷和柠碱。通过柚苷酶处理橘汁，可以将柚皮苷水解成无苦味的鼠李糖、葡萄糖和柚皮素，除去橘汁中带苦味的柚苷；

44、通过柠碱前体脱氢酶的作用，在NAD或NADP存在时，可以使柠碱前体脱氢；加黑曲霉橙皮苷酶于橘汁中，可以将不溶性的橙皮苷分解成水溶性橙皮素、从而使橘汁澄清，也脱去了苦味。,（四）用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶处理橘汁瓶装橘汁贮藏时，因光线照射而生成过氧化物，促进氧化，使色泽和风味变坏，若用葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶处理，可以除去橘汁中的氧气，从而使橘汁在贮藏期间保持原有的色香味。用葡萄糖氧化酶还可防止水果冷冻保藏时的发酵变质而达到保鲜效果。,第三节细胞工程在食品加工中的应用,细胞工程技术应用于食品工业是随着细胞培养和细胞融合技术的发展而发展起来的。在细胞培养方面最典型的例子是人参细胞培养成功，还有香料

45、与色素的生产。目前白酒、果酒、酱类等食品发酵行业主要以使用酵母为主，曲霉也适于酒类和酱油生产。这些行业的微生物育种目标是培养出耐乙醇酵母、耐盐酵母、耐高糖酵母、无泡酵母、耐温酵母及谷酰胺酶与蛋白质分解酶活性高的曲霉。,具有重要意义的成就是嗜杀其它菌类活性的嗜杀酵母新菌株的培育成功日本协和发酵公司已完全使用嗜杀性葡萄酒酵母配制新酒目前，正研究运用细胞融合技术取得其它菌株，应用于食品发酵工业之中。总之，细胞工程在新技术对食品工业革新有着很大的潜力。,一、氨基酸菌种育种,在氨基酸生产菌育种研究中，第一个被研究的是L谷氨酸生产菌。该菌自1956年首次从自然界分离到棒杆菌后，经过几十年各种方法的人工诱变

46、或多重的营养缺陷型菌株筛选，已成为我国推广应用于味精厂的高产优良谷氨酸生产菌FM84-415。该菌仍不太稳定，易被噬菌体感染,用FM84-415和FM242-4作为出发菌株进行原生质体融合筛选出产酸能力比出发菌株高，而且对噬菌体有抗性的谷氨酸发酵生产菌株。,二、肉类加工,肉类冻结加工过程中要想提高冻结肉的质量,原料及成品处理必须做到以下几点:第一，为了防止冻结中冰晶的成长，要尽可能的进行快速冻结，缩短冻结时间，使生成的冰晶体大小整齐；第二，要尽可能的降低冻结终温，以提高结晶率，使残存液相浓度变高，减少残留液相的数量，降低冷藏温度，以降低各项的饱和蒸汽压；,第三，要尽可能不使冰结晶在冷藏中温度出

47、现上下波动，防止冰结晶的成长。在常规的肉类冻结过程中，第三条是可以通过控制冻结品的冷藏温度来达到的，而第一条和第二条却很难做的完美，从而造成肉在冻结后汁液流失严重，形成多孔状等不良现象 主要原因:在现有的冻结条件下，肉类冻结时间长，要达到冻结要求，所需要的冻结温度要求较低。,冰核细菌的应用将有望促进冻结技术的发展,冰核活性（INA）细菌具有在较高温度（-5-2）下形成规则、细腻、微小异质冰晶的能力国外已将INA菌液及其胞外冰核应用于食品的冷冻浓缩、冷冻干燥和改善食品的冷冻质地等方面，并将细菌或其胞外冰核应用于肉类食品的冻结。该技术主要以下特点：,可以提高过冷却点、缩短冻结时间，从而确保冻结的质

48、量，避免长时间冻结过程后的机械损伤，同时还可以节约能源、提高冷冻效率。在冷冻过程中，含有冰核细胞的和不含有冰核细胞的样品间的核温和冻结时间存在极大差异（见表3-1），表3.doc,从表3-1可以看出，含有冰核细胞的样品核温高，这样就能保证肉类食品在零下较高的温度下冻结，从而大大缩短冻结时间，提高冷冻效果。Li Jingkun等报道，用冰核菌P.syringage处理鱼肉，过冷点提高3.4，当在-5冷冻时，与对照相比，处理的冷冻时间降低了33%。因此，冰核细菌应用于食品冷冻中可以节约能源和冷藏费用。,可以改变肉食品的质地。常规冷冻食品的结构是冰晶无序形成和全面生长，产生海绵状的结构，使冻结后的食

49、品具有各向同质的机械特性。利用冰核细菌的冷冻导致各向非同质结构产品的形成，达到有效冷冻和质地改善的目的。,利用微生物及其代谢物改善肉制品的品质、延长产品货架期提高安全性据报道乳酸乳球菌产生的细菌素Nisin，是一种天然的新型食品防腐剂，已被全世界50多个国家和地区批准使用。江芸等在真空包装、低温保存的基础上，向猪肉中添加国产Nisin等防腐保鲜剂，研究了Nisin在鲜肉保鲜中的作用。结果表明，Nisin的抑菌作用明显，特别是对G+菌具有独特的抑制作用，如果在肉制品的保鲜中，配合乳酸钠和山梨酸钾使用，抑菌效果更强。,三、原生质体融合技术在酵母菌工程菌构建上的应用,以酒精酵母和热带假丝酵母为亲本，

50、通过原生质体融合技术，获得了既具有糖化酶活性又能高产酒精的稳定型酵母融合株，酒精发酵产量可达8.8%和11.5%。将酿酒酵母与粟酒裂殖酵母进行属间原生质体融合选育到降解苹果酸强的菌株。利用发酵力强的葡萄酒酵母与降酸能力强、发酵性能好的粟酒裂殖酵母融合，获得的融合子酵母,具有安全性能好，稳定性强；单菌株发酵，易管理，操作简单稳定；产品口味好，口感稳定，用原生质体融合技术的培养选育出的优良菌株降酸率可达30.4%，比葡萄酒酵母的降酸性提高20%。,四、微生物蛋白,微生物发酵生产的蛋白质，有的可直接供人食用，有的可做家畜、家禽饲料，增加人们肉食供应。最近国外上市的真菌蛋白，其蛋白含量占44，比牛排瘦