基因重组与基因工程概述课件.ppt

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1、基因重组与基因工程概述,中心法则,逆转录,转录,RNA,翻译,蛋白质,生物体,环境,基因的表达调控,适应环境,了解中心法则,为人类服务,即DNA重组技术。在分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，使其与载体构建成重组DNA，再转移到受体细胞。目的基因在受体细胞中表达，获得新的遗传性状。,基因工程,苏云金芽胞杆菌（BT）毒素蛋白基因,荧光蛋白酶基因,转胃安素番茄,高锌西洋番茄,转虾青素胡萝卜,痢疾疫苗土豆,乳汁中分泌人凝血因子的转基因山羊,乳汁中分泌人蛋白因子的转基因猪,主要内容,DNA重组重组DNA技术重组DNA与医学的关系,不同DNA之间发生共价连接形成新的DN

2、A 分子。基因移动和重组是生物界普遍现象，是生物进化的动力，DNA重组具有重要的生物学意义,DNA重组概念,第一节 DNA重组,DNA重组的类型,位点特异性重组（site-specific recombination）,接合(conjugation)转化(tranformation)转导(transduction),同源重组（homologous recombination）,转座重组（transposition recombination）,细菌的基因转移与重组,一、细菌的基因转移与重组,接合(conjugation)转化(tranformation)转导(transduction),（一）

3、接合作用(conjugation),指通过细胞的直接接触(如菌毛)，遗传信息从供体细胞单向转移到受体细胞的过程。,接合,转移,F因子,染色体DNA,性鞭毛,Griffith 肺炎球菌转化实验,（二）转化（transformation）,相关概念：,转化：细胞从周围介质中吸收裸露 的DNA,而获得新的遗传表型。,感受态细胞（competent cell）:具有摄取周围介质中游离DNA 分子能力的细菌细胞。,转化过程：,（三）转导（transduction）,通过病毒（噬菌体）介导发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移和重组过程。,转导,溶菌途径,溶原途径,噬菌体感染宿主后的两种结局,cI基因,

4、cro基因,溶原状态,cI基因,cro基因,溶菌状态,噬菌体感染宿主菌后的两种状态是由噬菌体的cI和cro两个基因编码调控蛋白控制的，溶原状态，cI 表达；溶菌状态，cro 表达。除了控制其他基因表达外，cI和cro两个基因编码调控蛋白是互为阻遏蛋白。,结合协同,cI基因,cro基因,溶原状态,cI基因,cro基因,溶菌状态,思考：当含噬菌体的细菌用紫外线轻度照射后，cI蛋白被降解,接下去会发生什么？停止照射后会怎样？为什么会进化成这种机制？,结合协同,二、同源重组（homologous recombination）,不需要特异DNA序列，而是依赖两分子之间序列的相同或相似性而进行的重组。同源

5、序列愈长，同源重组率愈高，反之，则不易发生重组。,概念,同源重组意义,同源重组发生在任何生物中。细菌如果通过接合或转化获得的外源DNA与宿主DNA充分同源，那末外源DNA就可以整合进宿主的染色体。同源重组也是DNA损伤修复的重要机制,Electron micrograph of a Holliday Junction,Holliday Junction(A)The structure of a Holliday junction bound by Cre recombinase(gray),a bacteriophage protein.(B)A schematic view of a Hol

6、liday junction.,E.coli 的同源重组过程：,Holliday模型同源重组步骤,两个同源染色体DNA排列整齐一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体通过分支移动产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：,片段重组体（见模型图右边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。,拼接重组体（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,位点特异性重组：由整合酶催化，在两个DNA位点特异的短序列之间发生的切割和

7、连接反应:噬菌体DNA整合细菌特异位点重组免疫球蛋白基因的重排,三、位点特异性重组,（一）噬菌体DNA的整合噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)。,attP,attB,E.coli DNA,Int,IHF,Int,IHF,Xis,DNA,噬菌体DNA的整合和切除,att:attachment site,Int:integrase,IHF:integration host factor,Xis:excisionase,POP,BOB,BOP,POB,

8、attL,attR,整合,切除,hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。,（二）细菌的特异位点重组,沙门氏菌H片段特异位点重组(倒位)决定鞭毛相转变,沙门氏菌H片段特异位点重组(倒位)决定鞭毛相转变,（二）细菌的特异位点重组,（三）、免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。,轻链的基因片段：,重链的基因

9、片段：,The organization of mouse immunoglobulin gene segments.The organization in germline cells is shown on the left,and the rearranged organization characteristic of mature B lymphocytes is shown to the right of the arrows.The rearranged states shown are but single examples of the many possibilities

10、for each gene family.,Consensus elements are located above and below germline variable-region genes that recombine to form genes encoding immuno-globulin chains.These consensus elements are complementary and are arranged in a heptamer-nonamer,12-bp to 23-bp spacer pattern.,-Chain-Chain H-Chain,23,12

11、,23,12,23,12,CACAGTG ACAAAAACC ACAAAAAACC CACAGTG,此重排的重组酶基因rag(recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。RAG1 识别九核苷酸序列，RAG2 加入复合物，切割七核苷酸序列位点等,CACAGTG ACAAAAACC,GTGTCAC TGTTTTTGG,7 核苷酸序列 12/23间隔序列 9核苷酸序列,重组信号序列（RSS）,重排机制：重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守

12、的重组信号序列(recombination signal sequence,RSS)。,V,J,分子内转酯反应,单链切开转移核苷酸修复、连接,免疫球蛋白基因重排过程,-OH亲核攻击,四 转座重组（transposition）,由插入序列和转座子介导的基因转移或重排。许多数细菌基因组含有几十个拷贝的能转座DNA片段，片段长度从几百到几万个bp,是遗传多样性的一个重要来源。,转座重组分类：插入序列(insertion sequence，IS)转座:由转座酶（transposase）、一个分离的反向重复序（inverted repests）列和侧翼二个正向重复序列（direct repeats）组成

13、。发生形式：保守性转座(conservative transposition)复制性转座(duplicative transposition)转座子（transposon，Tn）转座：除了有插入序列的 结构外，还带有抗性或其他标记基因。,转座序列结构,反向重复序列,反向重复序列,转座酶基因,IS,转座酶基因,ampR,反向重复序列,Tn3,转座酶基因,tetR,Tn10,IS,细菌中的三种转座子类型,插入序列的复制性转座,转座子(transposons)可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因,转座子转座,由转座子介导的转座,

14、Exon shuffling by transposition.(a)Transposition of an exon flanked by homologous DNA transposons into an intron on a second gene.transposase can recognize and cleave the DNA at the ends of the transposon inverted repeats.In gene 1,if the transposase cleaves at the left end of the transposon on the

15、left and at the right end of the transposon on the right,it can transpose all the intervening DNA,including the exon from gene 1,to a new site in an intron of gene 2.The net result is an insertion of the exon from gene 1 into gene 2.,转座子转座-外显子重组（混编）,外显子混编（Exon shuffling）：产生许多新功能的蛋白质,外显子混编是生物进化的一个重要过

16、程，得益于真核生物DNA编码序列的组织方式：断裂基因含有长长的内含子，含有许多的重复序列，并处于外显子的两侧。因此，内含子的存在提供了外显子混编的基础。有人提出人基因组编码的约6万种蛋白质是从几千个独立的外显子混编而来。,第二节 重组DNA技术,重组DNA技术相关概念及意义重组DNA技术的原理及过程重组DNA技术与医学关系,一、重组DNA技术相关概念及意义,（一）有关DNA克隆的相关概念克隆（clone）:通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体，这一群体可以是分子、细胞、动物或植物等。获取这一群体的过程称为克隆化（cloning）DNA克隆(DNA cloning)：是按人类的意愿，

17、在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。又称分子克隆（molecular cloning)，基因克隆（gene cloning）、重组DNA(recombinant DNA)。,重组DNA技术(recombinant DNA technology)：是指实现基因（或DNA）克隆所采用的方法及技术路线等。又称基因工程（gene engineering），遗传工程（genetic engineering）等。,（二）重组DNA技术的意义,填平了物种间不可逾越的鸿沟；缩短进化时间；对生物定向改造；基因结构、结构功能及调控研究的基础；

18、疾病诊治,二、重组DNA技术的原理及过程,基本过程：,分切接转筛,（一）工具酶,工具酶：系指能用于DNA和RNA分子的切割，连接，聚合，反转录等有关的酶系统称为工具酶。,常 用 的 工 具 酶,限制性内切核酸酶(restriction endonucleases)DNA连接酶(DNA ligase)DNA聚合酶I(DNA polymerase I)多核苷酸激酶(polynucleotide kinase)反转录酶(reverse transcriptase)DNA末端转移酶(DNA terminal transferase)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase),在DNA分子内

19、部的特异性的碱基序列内部进行切割 将两条以上的线性DNA分子或片段 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体 催化DNA 切口平移反应，制备高比活探针；DNA末端标记，合成cDNA的第二链 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的 5OH末端上 以RNA为模板合成互补的cDNA链 线性双链 或单链DNA分子的3OH末端加上同聚物尾 去除DNA,RNA,dNTP的5末端的磷酸基团,工 具 酶 主 要 功 能,1、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,定义：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基序列的核酸水解酶。分类I 型：复合功能酶内切(识别位点周围400-700 bp)

20、、甲基化、ATP酶和DNA解旋；III型：内切(识别位点周围25-30 bp)、甲基化II 型：识别和切割双链DNA的特异顺序(识别位点内),命名：根据酶的微生物学名命名：如：Escherichia coli,R株中几种限制酶：EcoR I，EcoR II，EcoR V第一字母（大写，斜体），示该酶微生物属名；第二、三字母（小写，斜体），示该酶微生物种名；第四字母（大写，斜体），示该酶微生物株或型；如一种菌株中有多种限制性内切酶，用罗马数字表示发现分离的先后顺序。,II型限制性内切酶的作用特点识别序列个碱基，4个核苷酸序列，则每（）个碱基出现一个靶序列；6个核苷酸序列出现的间隔是4kb,8个核

21、苷酸序列则是65kb。回文结构（palindrome）三种不同的切口：平末(blunt end)端、突出粘性末端(cohensive end or stick)突出粘性末端,限制性核酸内切酶三种切口,产生5突出粘性末端（sticky end):以EcoR I为例：5-G AATTC-3 5-GP OHAATTC-3 3-CTTAA G-5 EcoR I 3-CTTAAOH PG-5产生3突出粘性末端:以Pst I为例：5-CTGCA G-3 5-CTGCAp OHG-3 3-G ACGTC-5 Pst I 3-GOH p ACGTC-5产生平末端（blunt end):以Nru I为例：5-T

22、CG CGA-3 5-TCGp OHCGA-3 3-AGC GCT-5 Nru I 3-AGCOH pGCT-5,II型限制性内切酶的用途：DNA克隆 DNA杂交与序列分析 改建质粒 构建基因组图谱和文库限制与修饰系统（restriction modification，R-M系统）：甲基化酶与相关的II型限制性内切酶组成，它们识别相同序列，发挥不同功能。如：EcoRI restriction endonuclease和 EcoRI methylase,restriction modification(a)EcoRI,a restriction enzyme from E.coli,makes

23、staggered cuts at the specific 6-bp inverted repeat sequence shown.This cleavage yields fragments with single-stranded,complementary“sticky”ends.Many other restriction enzymes also produce fragments with sticky ends.(b)Bacterial cells with restriction endonucleases also contain corresponding modific

24、ation enzymes that methylate bases in the restriction-recognition site.For example,E.coli cells containing the EcoRI restriction enzyme also contain EcoRI methylase,a modification enzyme that catalyzes addition of a methyl group to two adenines in the EcoRI recognition sequence.The methylated restri

25、ction site is not cleaved by EcoRI,assuring that a cell making this restriction enzyme does not destroy its own DNA.,2、DNA聚合酶（DNA polymerases）,能合成DNA的酶称DNA聚合酶。常用的酶：大肠杆菌DNA聚合酶及其大片断（Klenow片段）Taq DNA聚合酶反（逆）转录酶末端脱氧核糖核酶转移酶（末端转移酶）,(1)大肠杆菌DNA聚合酶,5 3外切酶 53聚合酶 3 5外切酶,枯草杆菌蛋白酶,Klenow 片段,作用特点：多功能酶：53DNA聚合酶活性35外

26、切酶活性53外切酶活性主要用途:催化DNA 切口平移反应，制备高比活探针；DNA测序、合成cDNA第二链，及DNA末端标记（Klenow片段）,5,5,5,5,5,5,DNA酶 I,DNA聚合酶I（全酶）,利用大肠杆菌DNA聚合酶I进行切口平移法,Mg 2+,dATP dCTP dGTP-32P dTTP,T*,T*,T*,T*,T*,T*,5,5,5,5,5,5,5,5,限制性内切酶,Klenow 片段-32P dNTP,变性,3末端32P标记的单链DNA探针,利用Klenow片断进行3端标记,5末端突出的DNA,（2）Taq DNA聚合酶,1988年saiki在嗜热水生菌(thermus

27、aquaticus)分离出耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，MW=65kD，主要应用于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）中对DNA分子的特定序列进行体外扩增,（3）反转录酶(reverse transcriptase),亦称依赖于RNA的DNA聚合酶（RDDP)催化以RNA为模板的DNA聚合反应，以mRNA为模板，催化合成出互补的DNA，称为cDNA(com-plementary DNA)。主要用于cDNA文库的构建。35外切酶活性（又称RNA酶H活性），特异性降解RNA-DNA杂交分子中的RNA部分,（4）末端脱氧核糖核酸转移酶（末端转移酶,termi

28、nal transferase）,催化作用：在二价阳离子存在下，它催化dNTP加到DNA分子的3羟基端。用途：用于给载体或cDNA加上互补的多聚体尾巴，造成便于重组的人工粘性末端；用于DNA片断3-末端标记。,AAAAAn 3 mRNA,A A A AAn 3 mRNA,T T T T 5 cDNA,T T T T 5,GGGG,GGGG,T T T T 5,5CCCC,A A AA,Oligo(dT)引物反转录酶dNTP,Oligo(dC)引物Taq DNA 聚合物（或Klenow 片段）dNTP,去除mRNA链加oligo(dG)末端转移酶,cDNA双链,全长双链 cDNA的合成,5,5,

29、3,3,3,3,3、DNA连接酶(ligase)催化两个独立DNA片段的5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键，使DNA片段拼接起来T4连接酶：粘性末端和平末端；大肠杆菌连接酶：粘性末端,4、多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）寡核苷酸探针标记；用于连接反应，使缺 少端磷酸的DNA片段合成接头磷酸化,N,N,N,N,N,HO,Ad-P-P-P,5,3,N,N,N,N,N,P,5,3,+,Ad-P-P,+,-32PATP,ADP,寡核苷酸片段,32P标记的寡核苷酸片段,多核苷酸激酶,（二）基因载体（vector）,载体（vector）：携带目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和/

30、或表达的一类DNA分子。载体特征：自主复制 即有复制原点（必需）酶切位点（必需）大小适合筛选标记:如抗药性、营养标记、-半乳糖苷酶显色反应等拷贝数高,载体类型：来源:质粒；噬菌体；病毒,酵母人工染色体功能:克隆载型体和表达型载体受体细胞:原核细胞载体、真核细胞载体和穿梭载体（shuttle vector）,质粒（plasmid）：细菌染色体外小型双链环状DNA。质粒复制的类型：严紧型：1-5拷贝，与细菌复制密切相关松弛型：10-200拷贝以上常用载体：pBR322：4.36kb；人工构建；Tetr和Ampr；多克隆位点，松弛型pUC系列质粒：pBR322和M13噬菌体改建,2.674kb；Am

31、pr；蓝白斑筛选（lacZ，-肽）；高拷贝（500-700）,1、质粒载体,用途：保存与扩增 2kb的目的基因构建cDNA文库测序制备探针,复制点：ori筛选标记：ampr,tetr克隆位点：多个单一限制性内切酶位点,2、噬菌体载体（bacterieophage vector）,基因组特点：50kb双链DNA分子，末端12bp为互补单链（cos位点，又称粘端）两个启动子：PR和PL编码基因：包装蛋白，裂解功能蛋白等生长方式：溶菌性生长（组装噬菌体）溶源性生长（整合入细菌DNA内）,噬菌体载体（Bacteriophage Lambda）,cos,TACGGGGCGGCGACCTCGCGATGCC

32、CCGCCGCTGGAGCGC,Cos序列及酶切割位点,载体种类：插入载体（insertion vector）：外源性DNA直接插入酶切位点（EcoR）容量：几个kb代表载体：gt10；gt11用途：构建cDNA文库替代载体（substitution vector）：外源性DNA替代载体中央部分酶切位点：EcoR；BamH；Sal容量：9-22kb代表载体：EMBL4用途：构建基因组文库,cos,cos,cos,cos,cos,cos,cI,EcoR I,EcoR I,lacZ,E,B,S,E,B,S,gt10,gt11,EMBL4,噬菌体插入载体和替代载体示意图,3、柯斯质粒载体（cosmi

33、d）,基因组组成：质粒与噬菌体的cos位点联合构成、4-6kb、质粒复制起始位点、酶切位点、抗药性基因；容量：29-45kb代表载体：pGEM-3Zf（-）工作方式：具有噬菌体样的包装和感染，又具有质粒样的复制用途：基因组文库,（三）目的基因（target gene）,1、目的基因的用途研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、调控寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与治疗研究生物种系进化与相关同源性基因工程重组表达改造某些基因，以改良品种基因治疗,2、获得目的基因的方法,原核目的基因获得：直接分离真核目的基因获得：基因组文库筛选cDNA文库筛选人工合成PCR合成,DNA文库概念 DNA文库（DNA

34、library）：通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中的各种重组DNA分子的集合体。分两类：基因组文库(genomic library)：将某种生物细胞的基因组DNA切割成一定大小的片段后，分别与合适的载体重组并导入宿主细胞内克隆保存。这种保存在宿主细胞内的整个基因组DNA片段集合体称。cDNA文库(cDNA library)：将分离纯化获得某种真核细胞中的全部mRNA逆转录成cDNA，并通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中。这种保存在宿主细胞内的cDNA集合体称。,用聚合酶链反应（PCR）方法获取目的基因,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,第一次循环：变性（95oC）退火延伸（72

35、oC）,第二次循环,3,5,5,3,3,5,5,3,第三次循环,2530次循环后模板DNA含量可以扩大100万百倍以上,PCR原理,模板DNA,引物,引物,用聚合酶链反应（PCR）方法获取目的基因,一对引物分别含有BamH I 和Hind III 位点，PCR产物经双酶切后，可定向插入载体。,（四）外源基因与载体的连接,作用酶：DNA连接酶连接方式：粘性末端连接平末端同聚物加尾连接人工接头,人工接头连接法,BamHI接头,连接酶,BamHI切割,连接酶+BamHI切割的pBR322,（五）重组DNA导入受体菌,1、重组子导入受体菌的方式：转化（transformation）：特指将质粒DNA或

36、以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染（transfection）：病毒及其重组子导入受体细胞。,2、导入方法,氯化钙法 感受态：细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态 制备条件：冰浴、低渗CaCl2（0.1mol/L）转化反应：冰浴30分短暂热休克（42）转化效率：105-106/g DNA;环状DNA高于线状DNA 1000倍电穿孔法：电穿孔仪,（六）重组子的筛选与鉴定,1、阳性菌落筛选：抗药性标志：ampr、tetr、neor插入抗性失活互补筛选：蓝白斑筛选（-互补）、营养缺陷互补分子杂交：原位杂交、southern杂交,2、插入外源性DNA的鉴定：酶切（目的片段长度）PCR测序3

37、、表达蛋白的鉴定：免疫学、生物学活性,抗药性筛选,多克隆位点,启动子,裂开的N端,裂开的N端,外源DNA,半乳糖苷酶 N端编码序列,pUC182686bp,pUC182686bp,染色体,重组体pUC18,细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养,细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养,pUC18,含重组体pUC18的白色菌落,蓝色菌落,含载体pUC18的蓝色菌落,半乳糖苷酶C 端编码序列,转化,转化,利用 互补原理筛选（兰白斑筛选）重组子pUC18,蓝白斑筛选重组质粒,原位杂交,Radioactive probe will hybridize with its comple

38、mentary DNA,Wash filter,prepare autoradiograph and compare with master plate,Place nitrocellulose filter in sealable plastic bag with solution of labeled DNA probe,Southern blot,免疫学方法筛选重组子,DNA 重组技术实例：基因文库构建与筛选,人基因组文库构建Construction of a genomic library of human DNA in a bacteriophage l vector.,人基因组DN

39、A用限制性内切酶（Sau 3A）部分消化产生约20-kb带粘性末端的部分重叠的随机片段；载体消化：噬菌体DNA用Bam H1消化，去掉中间的可置换片段，并产生左右两个带粘性末端的片段基因组片段与噬菌体DNA拼接成重组DNA体外装配有活性的噬菌体，并感染大肠杆菌菌种培养、筛选、扩增保存,Infect E.coli,Individual clones,Production of overlapping restriction fragments by partial digestion of human genomic DNA with Sau3A.This restriction endonuc

40、lease recognizes the 4-bp sequence GATC and produces fragments with single-stranded sticky ends with this sequence on the 5 end of each strand.A hypothetical region of human genomic DNA showing the Sau3A recognition sites(red)is shown at the top.Partial digestion of this region of DNA would yield a

41、variety of overlapping fragments(blue)20 kb long.Use of such overlapping fragments increases the probability that all sequences in the genomic DNA will be represented in a l library.,Sau 3A sites,Human DNA,20-kb partial Sau 3A fragments,cDNA 文库构建Preparation of a bacteriophage l cDNA library,从文库中筛选目的

42、基因,外源基因在载体上表达必须具备：强的启动子 核糖体结合位点 翻译起始和终止位点,（七）克隆基因的表达,1、原核表达体系,大肠杆菌、枯草杆菌表达系统 优点：方法简单、迅速、经济，适合大规 模生产。缺点：但该系统缺乏转录后加工机制，不宜表达真核基因组DNA；缺乏翻译后加工机制，如不能进行糖基化 修饰等；表达的蛋白质通常形成包涵体。,酵母、昆虫、哺乳动物细胞表达系统 优点：能转录后加工，即能剪接内含子；能翻译后加工，即能糖基化修饰等；通常不形成包涵体，能正确折叠。缺点：但技术难度较大，成本较高，表达 量较低。,2、真核表达体系,第三节 重组DNA与医学的关系,（一）疾病基因的发现（二）生物制药（

43、三）DNA诊断（四）基因治疗（五）遗传病的预防,重组DNA医药产品,重组DNA技术实例:,转基因小鼠（transgenic mouse）,Photograph showing a transgenic mouse with an active rat growth hormone gene(left).This transgenic mouse is twice the size of a normal mouse(right).,1997年2月23日英国Roslin研究所Wilmut小组在英国自然杂志上发布用成年绵羊的乳腺上皮细胞（体细胞）核移植，获得了一头多莉克隆羊,姓名：Dolly性别：雌种族：哺乳纲，牛科，绵羊生日：1996年7月5日出生地：苏格兰基因父亲：无基因母亲：一只Finn Dorset种白绵羊线粒体母亲：一只苏格兰黑脸羊生育母亲：另一只苏格兰黑脸羊进入社交圈时间：1997年2月23日子女：生育6名，存活5名死亡：2003年2月14日,动物克隆,动物克隆技术路线,