基因工程应用概述课件.ppt

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1、3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 1,基因工程Gene Engineering,授课课时:40 学时，实验：20 学时(S502),第3周开始(1单2双周)考试方式:笔试上课地点:1208，3511（69周）任课教师:谭志远教授，办公室，S508联系电话:85288311,Email,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 2,课程要求,通过本课程的学习，掌握基因工程的一些基本原理和基本操作技术等。总成绩平时（20）实验（30）考试（50）平时成绩(考查迟到、早退，课堂提问、讨论、遵守课堂纪律等方

2、面),3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 3,教材和参考文献,楼士林等，基因工程，科学出版社，2002吴乃虎，基因工程原理（第二版上、下册），科学出版社，1998张惠展编著，1999年出版，基因工程概论，华东理工大学出版社。Watson,J.D et al.Recombinant DNA,W.H.Freeman and Company,New York,2ed,1992Robert F.Weaver,Molecular Biology,科学出版社,2000（影印版）,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Sl

3、ide 4,本课程内容,第一章 绪论第二章 基因克隆的工具酶第三章 基因工程的载体第四章 目的基因的制备第五章 目的基因导入和重组子的筛选第六章 外源基因的表达第七章 基因操作的基本技术第八章 植物基因工程及应用第九章 动物基因工程及应用第十章 医学基因工程及应用,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 5,第八章 植物基因工程及应用,第一节 高等植物的遗传学特性第二节 高等植物基因转化第三节 植物基因工程应用第四节 转基因的安全性,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 6,第一节 高等植物的遗传学特

4、性,a.遗传操作的简易性大多数高等植物可以开花授粉，通常可产生大量的后代，所以即使是非常稀有的基因突变和基因重组事件，其遗传后果也易被观察。b.整株植物的再生性植物细胞具有全能性，单个细胞可以在适当激素浓度诱导下完成脱分化、再分化的过程，分化成为叶和根，茎，最终形成整株植株。所以转化了外源基因的植物细胞可以再生形成完整的植株。c.染色体的多倍体性许多高等植物以多倍体的形式存在，大约三分之二的禾本科植物是多倍体，其染色体数目范围从24至144不等！其特征是体细胞变异频率高，在组织培养中植物细胞是遗传不稳定的。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide

5、7,第二节 高等植物基因转化,一.植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 8,二.农杆菌介导的基因转化方法(一)农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏

6、阴性土壤杆菌（A.tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumorinducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段TDNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链TDNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。TDNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 9,无限制地生长

7、与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。1.Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。Ti质粒大约在160240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。,3/21/2023

8、4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 10,Ti质粒的结构,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 11,表达载体pBIn19的结构,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 12,T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。tms由两个基因组成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）tmr由一个基因组成iptz：tmt由若干基因构成，合成稀有氨基酸衍生物，称为opines。它有三个成员：octopine

9、精氨酸与丙酮酸的缩合物Napaline精氨酸与酮戊二酸的缩合物Agropine谷氨酸与二环糖的缩合物据此可将Ti质粒分为三大类，感染的植物诱导合成这些有机碱，但不能利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根癌农杆菌使用作为氮源及碳源。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 13,2.T-DNA的整合机制：T-DNA的详细整合机制尚不清楚，但有几个环节是明确的：T-DNA切除由Vir区编码的特异性内切酶完成，分别在LB和RB的第三个碱基和第四个碱基之间产生缺口，并形成单链T-DNA。T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不对称

10、的，RB顺序与整合有关，而LB无关。T-DNA的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列，但整合位点的特异性尚未确定。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 14,T-DNA的整合机制,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 15,(二).Ti质粒转化植物细胞的战略,.Ti质粒的改造有以下理由使天然的Ti质粒不能作为表达载体使用：a.生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。b.有机碱的合成与T-DNA的转化无关，而且

11、可能会影响植物细胞生长，因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除有机碱合成基因（tmt）c.Ti质粒约为200kb，重组操作非常困难，也很难找到单一的酶切位点。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 16,d.Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA的大量扩增，须添加入大肠杆菌复制子。加入植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物细胞启动子及末端polyA化信号，加入多聚人工接头以利于外源基因的克隆。植物中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。2

12、.植物细胞转化的共整合系统T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr。首先在E.coli中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上，Kmr筛选转化细胞。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 17,共整合载体,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 18,3.植物细胞转化的双元系统,目前T-DNA转化植物细胞的标准方法是双元系统，即

13、穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 19,双元载体系统,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 20,农杆菌转化植物细胞,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 21,(

14、三).改良植物性状的策略,基因克隆技术提供了一种新的改良植物的方法，它可以直接的改变植物的基因型。有两种策略可以应用。1）基因附加：通过添加1个或多个基因改变植物的性状。2）基因扣除：利用基因工程技术使一个或多个植物已经存在的基因失活。灭活植物基因是通过反义技术来实现的。将外源基因反向的连接到载体中，当基因转录成mRNA后，与正常的mRNA是反向互补的。我们称这种反向互补为反义RNA，缩写为asRNA。反义RNA阻止原有基因表达的机理尚不明了，但可以肯定，正义和反义RNA之间的杂交与这一事件有关，可能双链的RNA很快被核酸酶降解，或者反义RNA阻止了核糖体与正义RNA的结合。,3/21/202

15、3 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 22,反义技术的原理,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 23,1.基因附加的方法,我们以抗虫基因为例来说明。1.1 理想的杀虫剂在农业生产中危害最严重的是昆虫。为了减少损失，一般使用杀虫剂。大部分杀虫剂没有选择性，杀灭害虫的同时也消灭了天敌，同时对生物圈中的其他生物产生影响，包括人，污染了环境。有一些生物生长在植物体内，可以避免农药的伤害。理想的杀虫剂具有的特性:它必须对害虫有害，但毒性应该有选择性，对其他生物无害。杀虫剂能够必降解，作物收获后不存在残留，并且对环境无污染。

16、,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 24,可以保护整个植株，不单单是地上部，免受害虫危害。到目前为止，我们还未发现这样的理想杀虫剂，最相近的是来自于苏云金杆菌的-内毒素。a)苏云金杆菌的-内毒素苏云金杆菌在孢子形成的过程中，细胞内形成杀虫晶体蛋白称为-内毒素，其活性很强，有时要比有机磷毒性高80000倍，而且选择性很强，不同品系的细菌和成不同的毒蛋白。在细菌中积累的-内毒素是无活性的前体，昆虫食用后，前毒素被蛋白酶消化后产生有毒性的蛋白，结合到昆虫肠道内，破坏表皮细胞，使昆虫不能进食，从而饥饿而死。不同昆虫中，晶体结构不同产生了特异性。,3/

17、21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 25,CryI鳞翅目幼虫CryII鳞翅目和双翅目幼虫CryIII鳞翅目CryIV双翅目CryV线虫纲CryVI线虫纲,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 26,苏云金杆菌并不是最近才发现的，早在1904年即开始使用，可以作为无公害的杀虫剂，但他很容易降解，所以要不断的补充，增加了农民的成本。因此研究者试图生产不需要连续补充的-内毒素，一种方法是利用蛋白质工程，修饰其蛋白结构使其更加稳定，另一种方法是通过基因工程是植物能够合成自己的毒素。b)将-内毒素克隆到玉米中传

18、统杀虫剂在玉米上效果较差，主要害虫是玉米螟，生物技术学家试图获得能合成-内毒素的玉米。北卡莱罗纳Ciba-Geigy实验室使用Cry1A(b)内毒素，这是一个1155个氨基酸的蛋白，29-607位的片段具有毒性。Ciba-Geigy研究小组并没有使用完整的基因，只使用了前648个密码子，人工合成了这一片段，这样可以对原始基因进行修饰，使用玉米偏爱的密码子。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 27,原始基因中GC含量是38%,而人工基因的GC含量为65%。将人工基因连接到盒式载体上，后接一个来自于CaMV的多腺苷酸化信号，利用微粒轰击法将其引入

19、玉米的胚中。胚胎长成植株后，利用PCR法鉴定。利用人工基因特异的片段作为PCR引物。下一步工作就是利用免疫技术鉴定转基因植株是否合成了-内毒素，结果显示人工基因确实具有活性。不同植株中产生的-内毒素数量不同，从250-1750ng/mg总蛋白，这种差异是由位置效应引起的。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 28,位置效应,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 29,转基因植株是否对玉米螟有抗性呢？在田间调查了6周，应用两条标准来衡量：害虫对植株总的危害，以及虫道的长度。转基因植株表现了较好的抗虫

20、效果，对照虫道长度40.7cm,转基因植株虫道只有6.3cm。1.2 其它的基因附加工程在水稻、棉花、马铃薯、番茄和其它作物上也进行了-内毒素工程，获得昆虫抗性也不仅仅是指有着一种方法。蛋白酶抑制剂也是较好的选择，它可以一只昆虫肠道内的蛋白酶活性，阻止或减缓害虫生长，许多植物能产生蛋白酶抑制剂，如豇豆和common bean,他们的基因已经被成功的转移到其他植物中，但一般蛋白的表达量比较低。这种抑制剂对甲虫的效果非常明显，所以对需要长期贮存的种子作物是一种很好的选择。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 30,2.基因扣除,基因扣除（gene

21、knocking out）这一词语不是很恰当，因为并不去除基因，只是让基因失活。有许多方法可以使基因失活，最成功的是反义技术。我们将以延长货架期的工程番茄为例进行说明。2.1 反义技术的原理在一个反义实验中，克隆的基因是反向的连接到载体中，这意味着当克隆的基因转录成mRNA后，与正常的mRNA是反向互补的。我们称这种反向互补为反义RNA，有时缩写为asRNA。一个反义RNA阻止原有基因合成表达产物，我们尚不清楚其潜在的机理是什么，但可以肯定，正义和反义RNA之间杂交与这一事件有关，可能双链的RNA很快被核酸酶降解，或者反义RNA阻止了核糖体与正义RNA的结合。,3/21/2023 4:03 P

22、M,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 31,2.2 利用反义RNA延迟番茄果实的成熟美国的Calgene公司和英国的ICI种子公司利用反义技术改造番茄，延长其货架期。a)多聚半乳糖醛酸酶在番茄果实成熟过程中的作用番茄从开花到收获需要大约8周的时间，第6周开始，果实的颜色和风味开始变化，此时成熟过程的基因开始启动，包括多聚半乳糖醛酸酶，使果实开始软化。运输过程中，造成伤害，降低了商品品质。b)克隆多聚半乳糖醛酸酶基因在1980s中期，ICI种子公司的生物技术部与Nottinghan大学合作进行了实验。从正常多聚半乳糖醛酸酶基因的5端获得了一个730bp的限制性片断，包含了一半的编

23、码序列，将植物的多腺苷酸化信号连接到片段的头部，CaMV启动子连接到尾部，插入Ti质粒pBIN19中。引入植物后，转录后形成了反义RNA。降低了多聚半乳糖醛酸酶基因的表达。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 32,延迟成熟番茄的构建过程,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 33,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 34,pBIN19分子重组到根癌农杆菌中，用来侵染番茄茎端，转移到含kan的培养基中，再生形成了完整的植株。实验的结果通过4个途径分

24、析：1Southern杂交检测反义基因2Northern杂交检测反义基因的转录，利用只能与反义RNA杂交的单链探针。3反义基因对正义多聚半乳糖醛酸酶基因表达量的影响，通过与正义RNA的Northern杂交检测，使用与正义mRNA特异的探针。史研究显示，转基因植株的多聚半乳糖醛酸酶mRNA的表达量明显低于对照。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 35,4聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，多聚半乳糖醛酸酶的表达量明显降低。转基因果实虽然也在逐渐的成熟，但可以存放很长的时间。这意味着反义RNA虽然不能完全将多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的

25、表达量，延缓成熟过程。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 36,转基因番茄PG酶活性的变化,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 37,三.病毒介导的遗传转化,植物病毒广泛存在，而且不受单子叶或双子叶的限制。因此病毒作为植物基因工程的载体日益受到人们的重视。在已知300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒约占91%，双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。RNA不适合于作为克隆载体，因为RNA的操作非常困难。在植物上已知有两种DNA病毒，花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic v

26、irus,CaMV）和双联体病毒（geminivirus），但都不是基因克隆的理想载体。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 38,花椰菜花叶病毒载体已用来克隆了一个基因进入芜箐甘蓝，有两个因素限制了其应用：1）花椰菜花叶病毒基因组的大小，即使是切除了非必须序列，花椰菜花叶病毒载体的承载插入片段的能力还是有限的，只能插入很小的片段。2）花椰菜花叶病毒的寄主范围非常窄，主要是芸苔属植物如芜菁、甘蓝和花椰菜等。这类病毒比较有潜力侵染重要的作物，如玉米和小麦，然而在侵染过程中，这类病毒重新排列并删除部分序列，搅乱插入的DNA序列。这种病毒可引起破坏性

27、的侵染，需要严格的防护，防止载体从寄主中逃逸侵染自然中的植物。所以花椰菜花叶病毒作为克隆载体还需要进一步的改造。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 39,四.基因枪转化法,农杆菌侵染双子叶植物获得转基因植株是非常成功的，自然界中的农杆菌只侵染双子叶植物，对单子叶植物不敏感。虽然通过添加乙酰丁香酮类物质可使农杆菌侵染单子叶植物，但单子叶植物的再生比较困难，因而农杆菌转化单子叶植物仍然是比较困难的。1984年，科学家发现，超螺旋结构的细菌质粒，虽然不能在植物细胞中复制，但可以重组整合到植物染色体内。受这一现象的启发产生基因直接转移技术。重组机制并

28、不清楚。因为细菌质粒与植物DNA之间没有同源性。事实上整合是随机的发生在植物染色体的任何位点。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 40,植物基因直接转移的原理,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 41,基因枪（particle gun）又称微弹轰击法（microprojectile bombardment,particle bombardment,biolistic)。,最早是由Cornell大学研制的火药基因枪。1990年，美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS-1000系统。基因枪的组成部分有

29、：点火装置、发射装置、挡板、样品室、真空系统组成。基因枪转化的基本步骤如下：DNA微弹的制备 DNA-微弹载体的制备 靶外植体准备 DNA微弹轰击 轰击后外植体的培养基因枪转化率差异很大，一般在10-310-2之间。McCabe在大豆上高达2%，而有的报道仅有10-4。相对于农杆菌介导的转化率要低得多，而且基因枪转化,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 42,成本高；嵌合体比率大遗传稳定性差。即使这样，该方法在单子叶植物上也有广泛应用，有如下优点：a)无宿主限制，无论是单子叶植物和双子叶植物都可以应用。b)受体类型广泛，原生质体、叶圆片、悬浮培

30、养细胞、茎、根、以及种子的胚、分省组织、愈伤组织、花粉细胞、子房等几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击。c)可控度高，商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度，命中特定层次的细胞。d)操作简便迅速。正因为基因枪这些优点，使基因枪成功的应用于：植物基因转化，特别是单子叶植物的转化；外源基因导入植物细胞器；种质转化（茎尖分生组织、配子体、胚胎细胞）。e)植物基因表达调控研究。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 43,第三节 植物基因工程的应用,一.利用植物转基因技术研究基因的表达与调控（一）转报告基因研究植物基因

31、的表达与调控植物对环境中的光、重力等因素尤为敏感。这些因素均可诱导基因的表达。利用报告基因环境因素的变化对基因表达的影响，是植物分子生物学的重要内容。在植物中常用的报告基因有：I 大肠杆菌的葡萄糖苷酸酶（GUS）:相当于在微生物及动物系统中使用的半乳糖苷酶，只是其作用底物为葡萄糖苷酸。该酶在脊椎动物和微生物中表达，植物细胞中几乎不表达。当gus基因转入植物细胞内表达时，若与X葡萄糖苷酸酶（X-gluc，与X-gal相似），保温后，就会产生蓝色反应，借此可以预测报告基因表达程度，但是该酶不能分泌在细胞外，因此在测定酶活时，须将细胞杀死，破碎。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生

32、物技术班同学们听课！,Slide 44,II 昆虫的荧光素酶基因：植物活细胞基因表达的检测可用昆虫的荧光素酶基因作为报告基因，其工作原理如下：将昆虫荧光素和ATP表达荧光素酶的植物细胞混合，该酶催化昆虫荧光素的氧化反应，并生成AMP、CO2和光，表达该酶的植物细胞或组织便可用感光胶片检测。例如，叶子的表面用砂纸磨损然后注入含有昆虫荧光素和ATP的缓冲液中，晾干，将X光胶片覆盖在叶子上，则表达昆虫荧光素酶的细胞就会使胶片感光与同位素检测方法一样。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 45,荧光素酶基因在植物中的表达,3/21/2023 4:03

33、PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 46,（二）T-DNA插入灭活基因及克隆基因,Ti质粒上的T-DNA能随机整合入植物染色体中，因而已广泛应用于植物基因的定性及分离上。T-DNA插入某植物基因，便可导致其插入灭活，性状发生改变。以此在体内鉴定灭活基因的生物学功能。此外，T-DNA还可用于克隆植物基因。将含有NPTII标记基因的PBR322重组质粒导入含有T-DNA两侧边界顺序的Ti质粒中，转化根瘤农杆菌，并将此菌侵染植物。获得转基因植物后，挑选各种突变株，并提取DNA，用Sal I水解DNA，T-DNA区域及NPTII中无Sal I切口，但pBR322上有一个Sal I切

34、口，位于Tcr基因内，连接后转化大肠杆菌，切下植物基因组片段，作探针杂交植物cDNA文库，便可获得灭活的整个植物基因。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 47,(三）利用转座元件克隆植物基因,转座子可以从基因组的一个位置移动到另一个位置，如果插入到基因的编码序列内，可以导致基因的失活，导致形状变异。目前已在多种植物中发现转座子的存在，如玉米的转座子AC-DS系统，将这些转座子导入其他植物中，筛选变异株，就可以将相关的基因克隆出来。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 48,二.利用转基因植物生

35、产外源蛋白质,一旦植物的转基因技术发展起来，人们就感兴趣利用转基因植物作为生物反应器，生产异源蛋白质及其它高分子化合物。（一）异源蛋白药物利用哺乳类动物细胞产生蛋白药物是极其昂贵的，而植物生长成本较低，农田里可换得大量蛋白质药物。目前这方面的项目仍在实验室里进行：如人的脑腓肽、人血清蛋白、及小鼠的单克隆抗体等。举例说明：将小鼠的抗体轻链和重链基因分别在两种烟草植物中表达，转基因植物由根瘤农杆菌介导的基因转化方法构建。然后两种植物品系杂交，产生的子代植物表达小鼠的重链轻链两种蛋白。从烟草的叶子里可检测到完整的抗体分子，含量为叶细胞蛋白总量的1.5%实验还表明，植物的蛋白分泌系统能够识别小鼠抗体前

36、体的信号肽顺序。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 49,（二）食用或工业用油,首批大规模生产并取得商业效益的非食用性转基因植物产品是工业用油，其中包括制造肥皂和去垢剂的月桂酸（12个碳原子）。科学家们仅表达一个特殊的基因就使油菜生产月桂酸而不是通常的18个碳原子的不饱和脂肪酸。这个实验田试验结果极其成功，经济效益显著。此外，利用油菜易于生长及产量高的特点，人们还致力于用它生产其它工业用油。如，作用润滑油及尼龙生产的原料芥酸；用于麦淇淋生产的6十八碳烯酸等等。（三）高分子材料通过转基因植物获得的高分子原材料范围极其广泛。包括：可被生物降解的聚

37、羟丁酯塑料（PHB）以及天然棉花与聚酯的混合纤维等。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 50,三.改良植物品种,（一）控制果实成熟的转基因植物蔬菜和水果成熟后，其组织呼吸速度及乙烯合成速度普遍加快，并迅速导致果实皱缩和腐烂。通过基因工程抑制乙烯的合成和信号传导，既可延长果实的寿命及存架期，也为果实的运输提供了条件，具有重要的经济意义。1990年和1991年，两位科学家分别用反义RNA技术，分别抑制了番茄中的ACC合成酶基因及EFE基因的表达，乙烯合成分别抑制了97%和99.5%明显增加了番茄的保存期。目前有关的研究工作仍在继续，并已扩展到了草

38、莓、梨、苹果、香蕉、芒果、桃、甜瓜等。另外，切断乙烯的信号传导也可延缓转基因果实的成熟，,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 51,目前已经克隆乙烯的受体基因CTR1和ETR1等，转基因果实的成熟被大大延迟。减少水果由于损伤（如机械搬运）而变质的另一种思路是：植物尤其是成熟果实中表达大量的半乳糖醛酸酶（PG）。它能水解果胶而溶解植物的细胞壁，使成熟果实易于损伤，降低PG的表达量也能有效地减少果实的损伤。具体方法是：将PG cDNA 5端区域反向接在花椰菜花斑病毒（CaMV）启动子的下游。构成表达PG反义RNA的基因。这个基因重组入大肠杆菌根瘤农

39、杆菌的Ti穿梭质粒上。通过根瘤杆菌进入番茄细胞内。这种转基因番茄表达大量的PG反义RNA。显著地减少了PG的活性，使番茄不易软化破损腐烂，并成为首次上市的转基因植物，其商标为FLAVR SAVRTM。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 52,（二）抗虫害的转基因植物,昆虫对农作物的危害是极大的。在美国，农场主每年花费几十亿美元去对付危害农作物的昆虫。目前对付昆虫的最主要武器仍是化学杀虫剂。这些农药不同程度地对人畜有害，污染环境。利用转基因技术可望培养出抗虫害的农作物优良品种。大致有三种战略：I 含细菌内毒素的转基因植物构建：天然的微生物杀虫剂

40、，如苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）已用了三十年了。该细菌能产生一种结晶蛋白，编码基因位于Bt中一个75kb的质粒上。基因的表达依赖于Bt孢子形成。这种结晶蛋白分子量约为125KD，对许多昆虫的幼虫表现毒性。但对成虫和脊髓动物无作用。Bt合成的只是无活性的原毒素（1178aa.）。当被幼虫进食后，,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 53,其消化道中的蛋白酶便将毒素原蛋白水解成68kD的毒性片段。这个片段与幼虫中肠细胞表面的受体结合，从而干扰这些细胞的正常功能。然而靠商业生产Bt孢子是有限的，且毒性蛋白原在体

41、外并不稳定，因而保护期很短。最近含有修饰的毒性蛋白的转基因抗虫棉已问世。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 54,II 蛋白酶抑制剂 BT转基因植物容易产生抗性，而且抗虫谱较窄。胰蛋白酶抑制剂是广泛存在于种子和块茎中一类蛋白质，在防御昆虫和病原菌侵染中起重要作用。其抗虫机理是：与昆虫消化道内的蛋白消化酶结合，形成EI复合物，阻断或减弱蛋白酶对外源蛋白的消化；EI还可以刺激昆虫过量分泌消化酶，产生厌食反应。胰蛋白酶抑制剂用于抗虫植物培育一般不会产生抗性，而且抗虫谱广。但在植物中的表达强度较低，抗虫性不强。III 细菌毒素与丝氨酸酶蛋白酶抑制剂的

42、混合植物实验结果表明：混合比单独毒素提高20倍。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 55,（三）抗病的转基因植物,1.抗病毒农作物感染病毒是个严重的农业问题。感染导致生长缓慢、产量降低、质量减退。构建抗病毒转基因植物有以下几种策略：I 病毒外壳蛋白基因Cp基因导入植物细胞后，可能以下述作用方式使植物获得保护：（1）当裸露的病毒遗传物质进入植物细胞后，立即被外壳蛋白包装，阻止了病毒核酸的翻译与复制。（2）在Cp水平上阻止病毒脱壳。TMV外壳蛋白CP的转烟草植物，该转基因植物在TMV存在条件下，能抗病毒感染30天左右，正常植物34天之后使被TMV

43、感染。最近的实验结果表明，CP表达抵御病毒侵袭也在其它谷物中成功，如马铃薯、番茄、苜蓿等。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 56,II 转表达复制酶亚基反义基因的植物：将TMV5端基因片段（含复制酶亚基因）作为目的基因，成功地构建了其反义基因的转烟草植株。实验结果表明，病毒RNA的合成抑制了2550倍。系统的病毒侵染症状特征消失或大量减少。此外，卫星RNA、核糖体失活蛋白基因、干扰素也成功的应用于转基因抗病毒植物的培育。2.抗细菌基因工程细菌性病害防治较为困难，药剂常常不能完全奏效，同时又易造成环境污染。某些情况下，作物本身缺乏抗性材料，限

44、制了抗病育种的发展。重组DNA技术开辟了一条解决问题的新途径。常用的抗细菌基因有：杀菌肽、溶菌酶。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 57,3.抗真菌基因工程基于对植物防御机制的初步了解，目前提出了以下基因工程抗真菌病害的技术路线：几丁质酶与-1,3-葡聚糖酶 过氧化酶 防御素 植物本身抗病基因和病原菌无毒基因 阻碍真菌蛋白质合成的抗真菌蛋白，核糖体失活蛋白（RIP）渗透蛋白基因（osmotin）抗毒素（phytoalexin）、植保素等。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 58,（四）抗除

45、草剂的转基因植物,在农作物大田里，杂草的存在可使农作物减产10%。目前使用的除草剂专一性不强，或多或少对农作物生长有影响，这就限制了除草剂的大量使用。现有三种战略构建抗除草剂的农作物：I 强化表达除草剂的靶蛋白（酶）基因：目前使用的大量这类的除草剂中，只有少数几种除草剂的细胞靶部位被鉴定。5-烯醇式为酸基莽草酸3磷酸盐合成酶（EPSPS），是植物叶绿体中芳香族必需氨基酸生物合成中的一个酶，而除草剂草甘磷glyphosate（glifoseit）是通过强烈抑制该酶而杀死植物的。glyphosate在除草剂中使用最为广泛。因为它很少的剂量就能杀灭广谱杂草，对环境的危害也比其它除草剂小，进入土壤后能

46、被微生物迅速降解。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 59,将来自矮牵牛花的EPSPS cDNA转入植物中，转基因酶活比非转基因植物提高了20倍，使得转基因植物较好地耐受glyphosate的存在。但转基因植物生长缓慢。II 克隆表达除草剂的突变靶蛋白（酶）基因：Klebsiella pneumoniae中的EPSPS对草甘磷亲和性降低了16倍鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)分离出了一个EPSPS突变体，转入烟草，表现出了较好的耐性。Monsanto公司的Kishore在E.coli分离出了一个突变体SM-1，

47、对草甘磷的耐性提高了8000倍。III除草剂的降解、解毒基因溴腈衍生物（Bromoxynil）是一种抑制光合成反应的除草剂，Klebsiella ozaenae有一基因编码一种腈水解酶，能将Bromoxynil降解为3,5二溴4羟苯甲酸。将该细菌基因转入烟草中已获成功。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 60,（五）改变花型及花色的转基因植物,全世界花卉产业的产值高达上百亿美元，通过插花工艺来装饰花束和花篮，需要培育各种花卉植物。目前构建具有不同花型及花色特征的转基因花已成可能。有关研究工作主要集中在世界最大的花卉出口国荷兰。花冠的颜色是由花

48、冠中的色素组成决定的。在大多数花卉中，色素为黄酮类物质。它由苯丙氨酸通过一系列的酶促反应生成。而颜色主要取决于黄酮类似物质侧链取代基的不同性质及结构。比如花青素衍生物呈蓝色。在黄酮类色素物质的生物合成途径中，苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）是一个关键酶。在矮牵牛属植物中已成功地应用反义RNA技术抑制,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 61,了CHS基因的表达，使得在转基因植物中花冠的颜色从野生型的紫红色转变成了白色。并且因对CHS基因表达的抑制程度差异而出现了一系列中间类型的花色。在烟草中，反义RNA抑制CHS基因表达，使野生型的桃红色转变成了白

49、色花冠。天然的玫瑰没有蓝色的花冠，因为蔷薇科植物缺少合成蓝色色素的酶系，从矮牵牛花中克隆了一个控制合成蓝色素的基因。目前正在将该基因转入玫瑰植物中，期望出蓝色的玫瑰。,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 62,（六）抗环境压力的转基因植物,环境大气层中的氧自由基（超氧化物负离子）对植物的损伤是严重的。在生理状况下，植物体内的超氧化歧化酶（SOD）将之转化为过氧化氢，后者经过氧化酯作用后，分解释放出水和氧气。但过量的氧自由基则对植物的某些组织如花卉的寿命有所影响。将SOD基因转入花卉植物中，可以节省氧气的需求量，以增加鲜花的保存期。另外，抗盐、抗

50、碱、抗寒、抗旱抗热的转基因植物也在研究中。常用的抗逆基因主要有以下几种：抗冻蛋白（antifreeze protein,AFP）脯氨酸合成酶甜菜碱合成酶渗调蛋白（osmotin,OSM）乙醇脱氢酶,3/21/2023 4:03 PM,欢迎02级农业生物技术班同学们听课！,Slide 63,（七）改良作物的品质,传统的植物育种以及杂交回交技术在过去一段时间内培育出许多农作物优良品种，但这种技术已接近极限，植物的转基因技术有望打破这种限制：1.植物淀粉合成的控制：淀粉由直链淀粉与支链淀粉组成，淀粉的质量与淀粉的组成有关。植物淀粉合成中的两个重要的酶是淀粉合成酶（GBSS）以及分支酶（BE）。分别控