微生物的培养与应用ppt-人教课标版课件.ppt
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1、特点:小 简 低,微生物,病毒细菌放线菌真菌原生动物,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。,1.分类,一、微生物,课题1:微生物的实验室培养,专题2 微生物的培养与应用,2.病毒,病毒的结构,SARS冠状病毒、禽流感病毒,病毒的增殖,细菌的外形与大小,3.细菌,A.球菌 B.杆菌 C.弧菌 常见的细菌三种典型形态,A,B,C,细菌的结构,芽孢:细菌形成的椭圆形的休眠体,芽孢的壁很厚,对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。芽孢又小又轻,可以随风飘散。当环境适宜(如温度、水分适宜)的时候,芽孢又可以萌发,形成一个细菌。,异养菌:腐生菌寄生菌
2、大部分病原菌,光能自养型:光合细菌化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌,细菌的营养类型,根据细菌所利用的能源和碳源的不同,将细菌分为两大营养类型。自养菌:,菌落,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时,就会形成一个肉眼可见的,具有一定形态结构的子细胞群体,叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。,细菌的菌落特征因种而异,菌落,4.放线菌,结构:单细胞原核生物分支状的菌丝(基内菌丝、气生菌丝),(2)繁殖,孢子丝|孢子,链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素,微生物中发现了几千种抗生素,其中2/3是由放线菌产生的,应用:,5.真菌,酵母菌,酵母菌和霉菌,青霉,生 殖,腐生生活,孢子生殖,6
3、.营养及功能,C、H、O、N、P、S,五大营养物质,碳源,氮源,生长因子,水,无机盐,微生物化学元素组成:,二、培养基,培养基(培养液)是由人工方法配制而成的,专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。,培养基的类型,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方3.不管哪种培养基,一般都含有水、碳源、氮源、无机盐、等营养物质,另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需,而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,碳源 氮源 生长因子 无机盐 水,无菌技术,纯化大肠杆菌的实验操作,.制备牛肉膏蛋白胨培养基,1.计算
4、根据配方比例,计算出各种成分的用量2.称量 准确地称取各种成分3.溶化 将成分熔化,并定容到一定体积4.灭菌:培养基(高压蒸汽灭菌)培养皿(干热灭菌)5.倒平板:待培养基冷却到50左右时,在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板,无杂菌污染才可用来接种。注意:平板倒置:使培养基表面水分更好挥发,防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养基造成污染。倒平板时不要将培养基溅在皿盖和皿底之间,否则容易引起培养基污染 配置固体培养基时,需要加凝固剂:琼脂,倒平板操作,.纯化大肠杆菌,平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线培养后,可以分离到由一个细胞
5、繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体-菌落。稀释涂布平板法:将菌液进行一系列的梯度稀释后,将不同稀释度的菌液分别涂布在琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够够的菌液里,聚集在一起的微生物将分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个菌落温馨提示:涂布平板法所有操作都应在火焰附近进行。平板划线法和稀释涂布平板法都是为了使聚集的菌种分散成单个细胞,以便得到纯化的菌落。,温馨提示:1、接种环的灼烧目的:接种前杀死接种环上的微生物;每次划线前,杀死上一次划线残留菌种,使每一次划线菌种来自上一次划线的末端,以便聚集微生物得到稀释;划线结束的灼烧是为了杀死残留菌种,避免污染环境和感染工作者。2、灼烧的接种环冷
6、却才能操作,以免温度太高,杀死菌种。3、第二次以及以后的平板划线操作时,总从上一次划线末端开始划线:使细菌数目随着划线次数增加而逐渐减少,最终得到单个细菌繁殖而来的菌落4、有时候观察不到菌落;菌液浓度大,划线距离短,培养时间长,2.稀释涂布平板的操作方法,4.菌种的保存,接种到固体斜面培养基,菌落长成后置于4冰箱保存。,3.微生物的恒温培养,.长期保存:,甘油冷冻管藏法,.临时保藏:,三.结果分析与评价,.培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长,说明培养基的制备是成功的,否则需要重新制备。.接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致
7、,并符合大肠杆菌菌落的特点,则说明接种操作是符合要求的;如果培养基上出现了其他菌落,则说明接种过程中,无菌操作还未达到要求,需要分析原因,再次练习。.是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同,及时观察记录的同学会发现这一点,并能观察到其他一些细微的变化。,代谢类型,光能无机营养(光能自养型),光能有机营养(光能异养型),化能无机营养(化能自养型),化能有机营养(化能异养型),光,光,无机物,有机物,无机物,有机物,无机物,有机物,二氧化碳,二氧化碳及简单有机物,二氧化碳,有机物,大多数已知细菌和全部真核微生物,硝化细菌氢细菌,紫色非硫细菌,蓝细菌绿色硫
8、细菌藻类,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌能利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌,某些真菌和放线菌也能分解尿素。,4、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例:PCR技术,启示:寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求,到相应的环境中
9、去寻找。,原因:因为热泉温度70800C,淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术,此项技术要求使用耐高温(930C)的DNA聚合酶。,.筛选菌株,要分离一种微生物,必须根据该微生物的特点,包括营养、生理、生长条件等;方法:抑制大多数微生物的生长 促进目的菌株的生长结果:培养一定时间后,该菌数量上升,再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理:,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等),同时抑制或阻止其他微生物生长。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基:,从物
10、理性质看此培养基属于哪类?,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源?,碳源:葡萄糖 氮源:尿素,培养基的氮源为尿素,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素,缺乏氮源而不能生长发育繁殖,而受到抑制,所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,5、培养基选择分解尿素的微生物的原理,允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基,叫做选择培养基,尿素,尿素,6、怎样证明此培养基具有选择性呢?,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离尿素细菌,判断该培养基有无选择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,1、显微镜直接
11、计数:,利用血球计数板(血细胞计数板),在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目:,不能区分死菌与活菌;不适于对运动细菌的计数;需要相对高的细菌浓度;个体小的细菌在显微镜下难以观察;,缺点:,2.间接计数法(活菌计数法)原理:在稀释度足够高时,微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的,即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法:稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml),M代表稀释倍数。,?,说明设置重复组的重要性。在设计实验时,一定要涂布至少3个平板,作为重复组
12、,才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时,一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致,结果不一致,意味着操作有误,需要重新实验。,注意事项为了保证结果准确,一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中,经涂布,培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,计算公式:,每克样品中的菌株数=(CV)M,某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234,那么每克样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml)()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4,B,(三)设置对照,判断培
13、养基中是否有杂菌污染:,将未接种的培养基同时进行培养。,判断选择培养基是否具有筛选作用:,完全培养基(营养成分齐全)接种后培养观察菌落数目。,主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。,实例:在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时,A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落,但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因:土样不同培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),小结:通过这个事例可以看出,实验结果要有说服力,对照的设置是必不可少的。,方案一:由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二:将A同学配
14、制的培养基在不加土样的情况下进行培养,作为空白对照,以证明培养基是否受到污染。,结果预测:如果结果与A同学一致,则证明A无误;如果结果不同,则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,实验设计,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右,再取样,将样品装入事先准备好的信封中。,“微生物的天然培养基”,一土壤取样,数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,二制备培养基,由于初次实验,对于稀释的范围没有把握,因此选择了一个较为宽泛的范围:稀释倍数为103107。准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选
15、择培养基,1个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管。将稀释相同倍数的菌液,在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目,因此,牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照,用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度原因:不同微生物在土壤中含量不同目的:保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,(三)样品的稀释,问题:为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度?测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量,选用的稀释范围相同吗?,原因:土壤中各类微生物的数
16、量(单位:株/kg)是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中:好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万,放线菌数约为477万,霉菌数约为23.1万。结论:为获得不同类型的微生物,就需要按不同的稀释度进行分离,同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板,则说明稀释操作比较成功,并能够进行菌落的计数,如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大,表明试验不精确,需要重新实验。,.微生物的培养与观察,在菌落计数时,每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果,
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