毛细管电泳技术及应用-生物在线课件.ppt

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1、毛细管电泳技术及应用,电 泳,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。,1808年，Reuss（俄国）首次发现电泳现象。1937年，Tiselius（瑞典）用于人血清蛋白质混合液的分离：发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；,经典电泳,利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰

2、胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术毛细管电泳。,毛细管电泳（Capillary Electrophoresis,CE）,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：采用了25-100m内径的毛细管；采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，毛细管电泳

3、的柱效远高于HPLC，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,分离过程,电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。,带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反。电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。,毛细管电泳的特点,1.仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.分析速度快、分离效率高 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子

4、；3.操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行；4.应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；,一、CE基本原理二、电渗现象与电渗流electroosmotic flow三、影响电渗流的因素四、淌度mobility五、CE中的参数与关系式六、影响分离效率的因素,毛细管电泳理论基础,毛细管电泳(CE)基本原理,电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。,电场力：FE=qE 阻 力：F=f故：qE

5、=fq离子所带的有效电荷；E 电场强度；离子在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数(对于球形离子：f=6；离子的表观液态动力学半径；介质的粘度；),所以，迁移速度：,（球形离子）,物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。淌度：单位电场强度下的平均电泳速度。,q离子所带的有效电荷；E 电场强度；离子的表观液态动力学半径 介质的粘度；,电渗现象与电渗流 electroosmosis and electroosmotic flow,1.电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。,当液体两端施加电压

6、时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow，简称EOF）。,2.HPCE中的电渗现象与电渗流,石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。,在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。,3.CE中电渗流的大小与方向,电渗流的大小用电渗流速度电渗流表示，取决于电渗淌度和电场强度E。即 电渗流=E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即=00真空介电常

7、数；介电常数；毛细管壁的Zeta电势。电渗流=0 E实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 电渗流=Lef/teoLef 毛细管有效长度；teo电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。,CE中电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向负极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向正极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性 表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向正极。,4.CE中电渗流的流形,电荷均匀分

8、布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。,5.CE中电渗流的作用,电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流+ef 阳离子运动方向与电渗流一致；-=电渗流-ef 阴离子运动方向与电渗流相反；0=电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在CE中，控制电渗流非常重要

9、。,CE中影响电渗流的因素,1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。,2.毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；,3.电解质溶液性质的影响,（1）溶液pH的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和

10、工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。,4.温度的影响,毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；CE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%3%；,5.添加剂的影响,（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。,（2）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。（3）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，ze

11、ta电势增大，电渗流增大；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。,淌度 Mobility,淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。1.绝对淌度(absolute mobility)ab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.有效淌度(effective mobility)ef 实际溶液中的淌度(实验中测定的)。ef=aii ai 溶质i 的解离度；i 溶质i 在解离状态下的绝对淌度,CE中的参数与关系式,1.迁移时间（保留时间）CE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。,V外加电压；L毛细管总长度；2.分离

12、效率（塔板数）在CE中，仅存在纵向扩散，2=2Dt,扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。,3.分离度,影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：,影响分离效率的因素区带展宽,1.纵向扩散的影响 在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：2=2Dt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：Winj=(24D t)1/2实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度

13、的1%2%。,3.焦耳热与温度梯度的影响,电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：,m电解质溶液的摩尔电导；I工作电流：cm电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：（1）减小毛细管内径；（2）控制散热；,4.溶质与管壁间的相互作用,存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，

14、浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。,5.其他影响因素,（1）电分散作用对谱带展宽的影响 当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2）“层流”现象对谱带展宽的影响 一般情况下，CE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；产生的原因：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。,一、高效毛细管电泳仪二、流程与主要部件三、进样方式四、检测器,毛细管电泳仪,仪器流程与主要部件,电压：030kV；分离柱不涂敷任何固定液；紫外或激光诱导荧光检测

15、器；（可检测到：10-1910-21 mol/L）,1.高压电源,（1）030 kV 稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；,2.毛细管柱（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；（2）规格：内径2075m，外径350400m；长度=1m,3.缓冲液池,化学惰性，机械稳定性好；4.检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；,类型 检测限/mol 特点紫外-可见 10-1310-15 加二极管阵列，光谱信息荧光 10-1510-17 灵敏度高，样

16、品需衍生激光诱导荧光 10-1810-20 灵敏度极高，样品需衍生电导 10-1810-19 离子灵敏，需专用的装置；,CE具体操作步骤：毛细管电泳的基本步骤包括清洗毛细管、更换电泳缓冲液、进样、电泳并同时在线检测。1).清洗毛细管 对于一根新的或久未使用的毛细管，需用1mol/L的NaOH溶液、0.1mol/L NaOH溶液、超纯水依次清洗。在有些情况下还需用0.1mol/LHCl、甲醇或去垢剂清洗,强碱溶液可以清除吸附在毛细管内壁的油脂、蛋白质等，强酸溶液可以清除一些金属或金属离子，甲醇、去垢剂可去除疏水性强的杂质。,在进行每次分析前可用相当于毛细管总体积23倍的0.1mol/L的NaOH

17、溶液清洗一遍，一般为23 min，而后注入电泳缓冲液，以保证分析结果的重复性。,2).更替电泳缓冲液 在进行每次分析前可用相当于毛细管总体积23倍的0.1mol/L的NaOH溶液清洗一遍，一般为23 min，而后注入电泳缓冲液，以保证分析结果的重复性。上一步清洗过程结束后，毛细管和电极从清洗液中移至电泳缓冲液，不可避免地将强碱或强酸等溶液带至其中。缓冲液本身也会因挥发、电泳等而改变其离子强度。因此对于精确分析，每分析五次后需更换一次样品盘中的缓冲液。一般分析，半天更换一次即可。,3）毛细管电泳的进样方式,进样量：毛细管长度的1%-2%；nL级、非常小；1.流体力学进样方式（1）进样端加压（2）

18、出口端抽真空（3）虹吸进样,毛细管一端插入样品瓶，加电压；,2.电动进样方式,进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度小的进样量大；离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去；特别适合黏度大的试样；3.扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。,Buffer:50 mM phosphate TEA(pH 2.5)with 4.0%HP-CD(w/v)and 50%methanol;Applied potential:30 kV;Sample:1 mg/L propranolol dissolved in(A)(B)water,(C)methanol;(A)Pressure injec

19、tion 0.5 psi.,5 s,(B)(C)electrokinetic injection 10 kV,5 s.,Effect of injection mode,(A)Conditioning of the capillary with a low pH buffer containing CTAB,and injection of a long water plug into the capillary by pressure;(B)Field-amplified injection of cations and stacking on the boundary of water p

20、lug and the BGS,while removing of the water plug out of the capillary;(C)Separation voltage is applied.The enantiomers complex with CD and are separated,and the rest of water plug is removed.,Schematic diagrams the FAEP,分离模式,八种分离类型，介绍常用的几种；根据试样性质不同，采用不同的分离类型；每种机理的选择性不同；,一、毛细管区带电泳capillary zone elect

21、rophoresis，CZE,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；,阴离子：两种效应的运动方向相反；电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。最基本、应用广的分离模式；,二、毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis，CGE,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比

22、与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。,1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。,三、胶束电动毛细管色谱（MEKC）Micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC,在电场力的作用下，胶束在柱中移动。,2.电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；,5.色谱与电泳分离模式的结合。,3.中性分

23、子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；,1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；,四、毛细管等电聚焦 Capillary isoelectric focusing，CIEF,4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力

24、的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；,5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。,1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。,五、毛细管等速电泳 Capillary isotachophoresis，CITP,3.不

25、同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4 电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队；4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；,capillary isotachophoresis，CITP,在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以“电渗泵”取代机械泵，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程。,六、毛细管电动色谱 Capillary electrokinetic chromatography，CE

26、C,七、毛细管微乳电动色谱(Microemulsion electrokinetic chromatography,MEEKC),CE相关技术1.毛细管电泳柱技术 毛细管是CE的核心部件之一早期研究集中在毛细管直径、长度、形状和材料方面，目前集中在管壁的改性和各种柱的制备。,1)动态修饰毛细管内壁 管壁改性主要是消除吸附和控制电渗流，通常采用动态修饰和表面涂层两类方法。动态修饰采用在运行缓冲液中加入添加剂，如加入阳离子表面活性剂十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)，能在内壁形成物理吸附层，使EOF反向添加剂还有聚胺、聚乙烯亚胺(PEI)等，甲基纤维素(MC)可形成一中性亲水性覆盖层。,2)毛细管内

27、壁表面涂层 涂层方法有很多种，包括物理涂布、化学涂层。最常用的方法是采用双官能团的偶联剂，如各种有机硅烷，第一个官能团(如甲氧基)与管壁上的游离羟基进行反应，使其与管壁进行共价结合，再用第二个官能团(如乙烯基)与涂渍物(如聚丙烯酰胺)进行反应，形成一稳定的涂层此外还有将纤维素、PEI和聚醚组成多层涂层，亲水性的绒毛涂层(fuzzy)和联锁聚醚涂层。,化学键合,物理吸附,3)凝胶柱和无胶筛分 CGE的关键是毛细管凝胶柱的制备，常用聚丙烯酰胺凝胶栓来进行DNA片段分析和测序。测定蛋白质和肽的分子量常用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-LPAGE)。如将聚丙烯胺单体溶液中的交联剂甲叉双丙烯酰胺(

28、Bis)浓度降为零，得到线性非交联的亲水性聚合物用作操作溶液，仍有按分子大小分离的作用，称无胶筛分。此法简单，使用方便，分离能力比CGE差。,4)CEC的毛细管柱制备 包括开管和填充柱 开管柱：键合色谱涂层毛细管柱，例如：将核糖核酸酶、己糖激酶、腺苷脱氨酶等固定到毛细管表面，构成一开管反应器，再和CE连接，可进行核酸选择性检测、微量在线合成和分离寡核昔酸等工作。填充柱：可将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中。,2.毛细管电泳检测技术 CE对检测器灵敏度要求相当高，故检测是CE中的关键问题。迄今为止除了原子吸收光谱与红外光谱末用于CE外，其它检测手段均已用于CE。现选择重要的几类检测器介绍

29、其最新进展。,1)紫外检测器(UV)在合适位置除去涂层，将透明部分对准光路。UV检测器集中在提高灵敏度，可采用毛细管弯折、吹泡技术扩大光路。或采用平面积分检测池，这种设计可使检测光路增加到1cm。也有用光散射二极管(LEDS)作光源，其线性范围和信噪比优于汞灯。总体来说进展不大。,2)激光诱导荧光检测LIF LIF是CE最灵敏的检测器之一，极大地拓展了CE的应用，DNA测序就须用LIF，单细胞和单分子检测也离不开LIF。利用CE-LIF技术可检出染色的单个DNA分子，有望用于癌症的早期诊断及临床酶和免疫学检测等。CELIF和微透析结合可测定脑中神经肽。采用波长分辨荧光检测器可提供有关蛋白和DN

30、A序列的一些结构和动态信息。一些适用于二极管激光器的荧光标记试剂如CY5等，正在不断开发和应用。,CE/LIF向三个方向发展：在原有氦镉激光器(325nm)和氩离子激光器(488nm)之外，发展价廉、长波长的二极管激光器；发展更多的荧光标记试剂来扩展应用面；开展更多的应用研究。LIF不但提高了灵敏度，也可增加选择性，缺点在于被测物须用荧光试剂标记成染色。,3).CE/MS联用 CE/MS联用,弥补了CE定性鉴定的不足，故发展特别快。CE/MS联用主要在两方面发展：一是各种CE模式和MS联用，二是CE和各种MS联用。关键是解决接口装置。最早报道CE/MS联用是采用单级四极杆质谱，现已发展到三级四

31、极质谱、离子阱质谱等。CE/MS联用特别适合于复杂生物体系的分离鉴定。因所需样品少，目前大部分工作集中在基因工程产品和蛋白样品，CE/MS联用现在已成为CE研究中的热点。,4)电化学检测器（EC）EC可避免光学类检测器遇到的光程太短的问题，故和LIF同为CE中灵敏度最高的检测器。报道最多的是电化学伏安检测器，常用碳纤维微电极进行单细胞极微量神经递质(如多巴胺等)的测定。可用脉冲伏安法测定糖、糖肽及金属离子，也可用循环伏安法，另一类常用的EC为电导检测器，Li的检测限达10-7mol/L(10-15mol)。,5)化学发光检测器(CL)CL具有结构简单、灵敏度高的特点，近年来引起重视。用CECL

32、检测血红蛋白，其检测限比CEUV低约4个数量级。应用最多的仍是鲁米那(luminol)体系，因为该体系对多数待测物如一些金属离子、氨基酸及其衍生物的检测灵敏度很高，且反应在水相进行。电致化学发光(ECL)也已成功地用作CE检测。,6)其它检测器 采用激光作激励源的除LIF外，还有激光热透镜检测、激光光热检测和激光拉曼检测等。普通荧光检测器研究集中在开发新的荧光染料，以提高灵敏度。同位素检测器具有高选择性和高灵敏度可达10-9加mol/L，但测定时需经同位素标记步骤，故应用受到限制。,总之，检测器是CE中具有挑战性的研究工作。CE/MS联用是最有应用价值的检测器，但价格昂贵，不易推广。发展新型检测器、提高UV等检测器灵敏度，以及发展CE和其它分离方法、检测方法的联用是CE研究重点之一。,毛细管电泳间接紫外检测法测定植物中的低分子量有机酸,-,+,-,-,-,-,-,-,-,苋菜根、茎、叶样品溶液电泳图,1 甲酸2 苹果酸3 柠檬酸4 琥珀酸5 戊二酸6 未知峰7 乙酸,