第13章免疫组织化学技术课件.ppt
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1、13第13章免疫组织化学技术,第二节免疫荧光组织化学技术 一、组织处理 二、荧光抗体的标记及染色第三节 酶免疫组织化学技术 一、组织处理二、酶标记抗体免疫组化染色三、非标记抗体免疫酶组化染色四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物第四节 亲合组织化学染色一、生物素-亲合素法二、葡萄球菌A蛋白法三、凝集素法四、链霉亲合素-生物素法,二、抗 原 的 保 存 与 修 复,抗原修复:免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白交联而使其组织的某些抗原决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化学的信号减弱或消失等不良效应。所以,使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法,即抗原修复。常用的方法有:酶消化法 盐酸水解暴露抗原法 微
2、波炉恢复抗原法 高压锅恢复抗原法 煮沸恢复抗原法,无花果蛋白酶轻度消化酶胰蛋白酶中度消化酶胃蛋白酶强消化酶,掌握盐酸浓度、水解温度、时间、以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原,借助微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白,已暴露掩盖的抗原决定簇。,经济简单,适用于大批切片,也是利用热效应恢复抗原性,三、抗 体 的 处 理 与 保 存,抗体的选择,注意选择具有高特异性、稳定的优质抗体多克隆抗体:敏感性较高、特异性相对较低单克隆抗体:特异性较高、敏感性相对较低,抗体的稀释,抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度,抗体的保存,分装密封保存,避免对抗体的
3、污染并注明标记(批号、名称、效价、量)根据厂家提供的保存条件保存避免反复冻融而使抗体效价降低,四、结 果 判 断,必须设立对照,对照实验:阳性对照 阴性对照确证实验:空白实验 替代试验 吸收或阻断试验,设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性,主要针对第一抗体。,采用已知抗原阳性标本与待检标本同时进行,以排除假阳性,用缓冲液代替第一抗体,以排除组织细胞内所含的生物素或内源性酶。直接法常采用。,用与待测抗原同一种动物免疫前血清或非免疫血清代替第一抗体已确认阳性反应不是异嗜性抗原所致非特异性反应。直接法和间接法均可采用,先用已知过量抗原与第一抗体反应,离心后再进行组化染色,此时的阳性标本应呈阴
4、性,其目的在于确认阳性反应是与天然抗原相同的抗原抗体反应,间接法常采用。,阳性细胞显色分布类型 细胞质 细胞核 细胞膜表面,阳性细胞显色:抗原分布于细胞核,阳性显色深浅反映抗原存在的数量,可以作为 定性的依据 定位的依据 定量的依据,阳性细胞呈散在分布,阳性细胞分布分为 散在分布 灶性分布 弥散分布,阳性细胞呈灶性分布,阴性结果和抗原不表达,阴性结果:不能简单认为具有否定意义,阳性表达有强弱、多少之分,只有少数细胞阳性(只要是在抗原所在部位)也要视为阳性表达,不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。,特异性染色与非特异性染色,免疫组化结果与HE染色结果,当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时,应
5、再结合临床资料,如性别、年龄、部位、X线等影像学及实验室结果综合分析,不能简单地推翻HE切片诊断。(HE,苏木精-伊红染色),五、质 量 控 制,抗体特异性、敏感性测试 抗体最佳稀释度的选择 稀释剂 抗体孵育温度、时间,试剂的质量控制,包括第一抗体和第二抗体,预试验,质量,操作过程质量控制,操作:步骤是否正确规范;每日之间、操作 人员之间的变异;试剂复溶、状态是否良好标本:阴性、阳性或自身组织对照三种类型 质控品,可用于监控标本制备、操作过程、染色步骤、试剂质量等问题引起的误差,仪器的质量控制,相关技术设备、仪器和器具定期校对、对试管、吸管、移液器等消毒。,第二节 免疫荧光组织化学技术,定义:
6、采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针,检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体),形成的抗原抗体复合物上带有荧光素,在荧光显微镜下,分辨出抗原(或抗体)的所在位置及其性质,并可利用荧光定量技术计算其含量。以达到对抗原(或抗体)物质定位、定性和定量测定的目的。,一、组 织 的 处 理,标本的类型:涂片和印片 组织切片 铺片 培养的粘附细胞 悬浮细胞 活细胞标本的保存:标本固定干燥后,最好立即检测 保持干燥、置4甚至-20 以下保存,二、荧光抗体的标记及染色,常用的荧光素:FITC黄绿色;RB200、TRITC橙红色;PE红色;AMC蓝色;Cy3橙红色;Cy5红色;德克萨斯红橙红色 标记方法
7、:搅拌法、透析法标记抗体的纯化:游离荧光素、未标记或过度标记 蛋白的去除标记抗体的质量鉴定:抗体特异性、效价、荧光素 与蛋白质结合比率F/P,荧光免疫组化染色,直接法:优点:操作简便、特异性高 缺点:敏感度偏低、抗体制备麻烦,间接法:优点:较直接法灵敏,标记一种抗 体可以鉴定多种抗原 缺点:非特异荧光、操作时间较长,补体法:优点:敏感度较高、标记一种抗体可以鉴定多种 抗原、适用于任何动物的抗原抗体系统 缺点:非特异荧光、需新鲜补体、操作麻烦,双标记荧光免疫染色法:用两种荧光素分别标记不同抗体,对同一标本中的相应两种抗原同时显示,非特异性荧光产生,某些组织细胞、衰老细胞有自发荧光抗体不纯所出现的
8、交叉反应标记抗体质量差,游离荧光素干扰 标记抗体浓度过高免疫荧光染色时间过长洗涤时间不够,非特异性荧光消除,用非免疫血清或10%牛血清白蛋白温育切片封闭非特异抗原位点动物肝粉吸收荧光抗体中非特异性成分层析或透析去除游离荧光素,纯化荧光抗体将抗体的浓度调整到高稀释度选择适合的切片方法封固剂、镜油必须无自发荧光用高渗盐浸洗,降低非特异性染色背景伊文氏蓝衬染法,第三节 酶免疫组织化学技术,定义:是在一定条件下,应用酶标抗体(抗原)与组织或细胞标本中的抗原(抗体)发生反应,催化底物产生显色反应,通过显微镜识别标本中抗原(抗体)的分布位置和性质,也可通过图像分析技术达到定量的目的。,一、组织处理,常用的
9、标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等,其固定及标本制作方法见第一、二节。与荧光免疫技术相比,酶免疫组织化学技术具有染色标本可长期保存,可用普通光镜观察结果,可观察组织细胞的细微结构等优点。,二、酶标记抗体免疫组化染色,定义:借助交联剂的共价键将酶直接连接在抗体上,酶标抗体与靶抗原反应后,再通过对底物的特异性催化作用,生成不溶性有色产物,达到对抗原定性、定量、定位检测的目的。常用的方法:直接法 间接法,三、非标记抗体酶免疫组化染色,特点:用酶免疫动物,制备效价高、特异性强的抗酶抗体酶通过免疫学反应与抗酶抗体及组织抗原上的第一抗体结合,最后经酶分子催化底物的显色反应,达到对抗原的检测避免了酶标记抗
10、体对抗体的损伤,提高了方法的敏感性,技术类型,酶桥法:抗酶抗体作为第三抗体,通过第二抗体作桥抗体,将结合在组织抗原上的第一抗体与第三抗体连接起来,最后形成酶联的抗原-抗体复合物,底物显色,优点:敏感性较酶标法有所提高 缺点:操作分四步,较复杂 如果抗酶抗体与酶结合弱,在操作中酶常被冲洗掉 如果酶标记在非特异性抗体上会存在背景着色问题 如果抗酶抗体的非特异性成分与桥抗结合,结果就与抗酶 抗体竞争桥抗的结合位点,也会影响方法的 敏感性,PAP法:是酶桥法的改良法。PAP法将酶桥法的第三抗体(抗酶抗体)与酶形成一种稳定可溶性(PAP复合物),+,+,+,Ag,Ag,特点:操作只需三步 PAP复合物稳
11、定,酶不易洗脱,避免了酶桥法的弊端 桥连抗体存在的非特异性抗体,不能与抗酶抗体结合 抗酶抗体中存在的非抗酶抗体不能与酶结合,不会有酶活性,因而大大减弱背景着色,双桥PAP法基本原理:是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP而建立起来的,通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上。这种放大方式由于重复使用桥抗体,使桥抗与PAP复合物中的抗酶抗体未充分饱和的Fc段结合,或桥抗体与特异性一抗尚未饱和的Fc段结合。对抗原有明显放大作用,对于组织细胞微量抗原的检测更有实用价值。,APAAP法:有些组织细胞富含内源性过氧化物酶,染色时就不宜使用HRP体系。用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(AP)-
12、抗碱性磷酶(AAP)法,简称APAAP法,四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物,常用种类:辣根过氧化物酶/HRP 底物显色棕色或灰蓝色 最常用 碱性磷酸酶/AP 底物显色玫瑰红色或深蓝色 最敏感 葡萄糖氧化酶/GO 底物显色蓝色 敏感性较低,显色底物不易保存-半乳糖酶等酶的选择:HRP染色结果比AP染色结果保存时间长 含有内源性HRP的组织切片:首选标记酶为AP AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记,对比清晰,第四节 亲合组织化学染色,亲和组织化学(Affinity histochemistry)是利用两种物质之间的高度亲合力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝
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