皮肤的基础与美容课件.ppt

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1、第二章 离心技术与离心机,离心现象是指物体在离心力场中表现的沉降运动现象。应用离心沉降进行物质的分析和分离的技术称为离心技术（centrifugal technique）。实现离心技术的仪器是离心机（centrifuge）。,离心技术主要用于各种生物样品的分离、纯化和制备，在细胞生物学和分子生物学的每一进程中，总可见到离心技术的运用。离心机是生命科学研究的基本设备，在生命科学，特别是生物化学和分子生物学研究领域，随着分子生物学研究对分离设备日益增多的需要而有了很大的发展。,在引入了微处理器控制系统后，各种转速级别的离心机已经可以分离纯化目前已知的各种生物体组份（细胞、亚细胞器、病毒、激素、生物

2、大分子等等）。而对离心方法的深入研究又可以利用这些离心设备更快、更纯、更多地分离纯化样品。诸如分离出化学反应后的沉淀物、天然的生物大分子、无机物、有机物，在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。,一、离心机工作原理,离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯生物样品的一种方法。悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而使溶液得以分离、浓缩和提纯，颗粒的沉降速度取决于离心机的转速、颗粒的质量、大小和密度。,第一节 离心技术的基础理论,当悬浮液静置不动时，由于重力

3、场的作用可使得其中悬浮的颗粒逐渐下沉，下沉的速度与微粒的大小、形态、密度、重力场的强度及液体的黏度有关。如红细胞颗粒，直径为数微米，可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。此外，物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。,扩散是由于微粒的热运动而产生的质量迁移现象,主要是由于密度差引起的。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的，因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。,扩散现象,扩散现象是不利于样品分离的，如果加大重力，就可能克服扩散现象的不利影响,实现生物大分子的分离。离心机就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，迫使液体

4、中微粒克服扩散加快沉降速度，把样品中具有不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。,1.离心力（centrifugal force，Fc）当物体所受外力小于运动所需要的向心力时，物体将向远离圆心的方向运动。物体远离圆心运动的现象称为离心现象。也叫离心运动。离心运动是由于向心力消失或不足而造成的。,二、离心力与相对离心力,离心作用是根据在一定角速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度2 r与颗粒质量m的乘积，即：式中是旋转角速度，是每分钟转头旋转次数，r 为离心半径，m是质量。,2.相对离心力(relative centrifugal force，RC

5、F)相对离心力是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”。由于各种离心机转子的半径或离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力也不同,因此在文献中常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力,例如25000g,表示相对离心力为25000。只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。一般情况下,低速离心时相对离心力常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g”表示。,若想把生物样品中的微粒从液体中分离出来，最简单的方法是将液体静置一段时间，液体中的微粒受重力的作用，较重的微粒下沉与液体分开，这个现象称为重力沉降。微粒在液体介质中的沉降将受到介质的浮力

6、、介质阻力及扩散现象的影响。,三、液体中的微粒在重力场中的分离,沉降速度(sedimentation velocity)指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。即：式中，为介质的密度，为微粒的密度，g为重力加速度，f为阻力系数。由上式可知，微粒的沉降速度与 成正比，与阻力系数f成反比。,沉降时间(sedimentation time，Ts)在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来需用多大转速与多长时间可达到目的的问题。如果转速已知，则需确定分离某粒子所需的时间即沉降时间。,K系数(k factor)描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率，也就是溶液

7、恢复成澄清程度的一个指数，所以也称之为“cleaning factor”。原则上，K系数愈小，愈容易也愈快地将粒子沉降。K系数与离心转速及粒子沉降的路径有关，所以K系数是一个变数。,沉降系数（sedimentation coefficient）颗粒在单位离心力场作用下的沉降速度，其单位为秒。沉降系数与样品颗粒的分子量、分子密度、组成、形状等都有关，样品颗粒的质量或密度越大，它表现出的沉降系数也越大。各种生物样品的沉降系数差别很大，因此可以应用离心技术来进行其定性和定量的分析及分离制备。,四、液体中的微粒在离心力场中的沉降,在离心机中，离心管（centrifuge tube）放于离心转头里，当离

8、心机开动时，离心管绕离心转头的轴旋转，作圆周运动，在离心管内的样品颗粒将同样运动。,假如颗粒处于真空中，颗粒会沿切线方向飞去,也就是当离心管由图中的0位转到1位时，颗粒到达离心管底部A位。对于离心管而言，样品颗粒由顶位移到了A位，也就是由离心管顶部移到了底部，这与重力场中的由高处落到低处相似。这种颗粒在圆周运动时的切线运动称为离心沉降.,实际上颗粒是在介质中运动的，颗粒作切线运动时将由于介质的摩擦阻力，使其在离心管中依图中虚线所示的曲线运动，当离心管由0位转到2位时，颗粒由顶位移到B位。介质的阻力越大，颗粒的沉降速度越小、沉降的距离也越短。旋转速度越大，颗粒的沉降越快。,离 心 沉 降 示 意

9、 图,离心管依斜角插于离心机的转头孔中，与转头旋转轴成 角，离心管中放置被离心的样品溶液，离心管顶部到旋转中心的距离和离心管底部到旋转中心的距离不一样，因此其顶部和底部所承受的离心力场也不一样。,通常称离心管顶部到旋转中心的距离为最小离心半径rmin，该处承受的离心力场为最小离心力场；称离心管底部到旋转中心的距离为最大离心半径rmax，该处承受的离心力场称为最大离心力场。,在离心力场中加速度达到数万甚至数十万倍重力加速度时，颗粒的沉降也加快了同样的倍数。这就使得许多在重力场中不能沉降的细小颗粒及密度较低的物体组份能用离心技术进行分离纯化。,一、差速离心法,差速离心法(differential

10、velocity centrifugation method)是利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀的离心方法。主要用于一般及特殊样品的分离，例如分离细胞器和病毒。,第二节 常用的离心方法,操作过程一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此反复加高转速，逐级分离出所需要的物质（如左图所示）。,差速离心法原理示意图,差速离心法,优点,缺 点,1.操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开;2.可使用容量较大的角式转子；分离时间短、重复性高；3.样

11、品处理量大。,1.分辨率有限、分离效果差，不能一次得到纯颗粒；2.壁效应严重，容易使颗粒变形、聚集而失活。,对分离纯度要求较高的样品应用此法，容易造成被分离物的大量丢失，变性以及造成污染，尤其对于一些沉降系数相差不太大的组份要获得完全的分离提纯比较困难，所以该离心方法常用于要求不严格样本的初步分离和大批量标本的处理，例如分离已破碎的细胞各组份等。,密度梯度离心法(isodensity centrifugation method)又称为区带离心法。样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力作用下把颗粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。,二、密度梯度离心法,密

12、度梯度离心法,优点,缺 点,1.分辨率高，分离效果好，可一次获得较纯颗粒；2.适用范围广，既能分离沉淀系数差的颗粒，又能分离有 一定浮力密度的颗粒；3.颗粒不会积压变形，能保持其活性，并可防止已形成的区带由于对流而引起混合。,1.离心时间较长；需要制备成梯度液；2.操作严格，不宜掌握。,离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液中，离心后被分离组份以区带层分布于梯度液中。,密度梯度离心机,密度梯度离心法,不同的离心分离的原理,1.速率区带离心法,2.等密度区带离心法,速率区带离心法是根据被分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，离心后分别处于不同的密度梯度层内形成几条分开的样品区带，达到

13、彼此分离的目的。梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合，常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。,（一）速率区带离心法,此离心法须严格控制离心时间，使得既能使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要把时间控制在任一粒子达到沉淀前。若离心时间过长，所有的样品全部都到达离心管底部；若离心时间不足，则样品还没有分离。此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，因此一般是在物质大小相异而密度相同的情况下应用。,临床实验室常用Percoll作分离溶液，用于静脉血中单个核细胞的分离。先把梯度液加入离心管中，溶液的密度从离心管

14、顶部至底部逐渐增加（正梯度）。将所需分离的样品小心的加至密度梯度溶液的顶部，样品在梯度溶液表面形成一负梯度（如右图所示）。,速率区带离心示意图,当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场中，颗粒一直沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）形成区带，故称为等密度区带离心法。颗粒的有效分离取决于其浮力密度差,与颗粒的大小和形状无关，但后两者决定着达到平衡的速率、时间和区带的宽度。颗粒的浮力密度与其原来的密度、水化程度及梯度溶质的通透性或溶质与颗粒的结合等因素有关。因此，要求介质梯度应有一定的陡度，要有足够的离心时间形成梯度颗粒的再分配，进一步离心也不会有影响。,（二）等密度区带离心法,第二节

15、 常用的离心方法,操作中，一般是将被分离样品均匀分布于梯度液中，离心后，粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带，收集好所需区带即为纯化的组份。由于其梯度形成需要梯度液的沉降与扩散相平衡，需经长时间离心后方可形成稳定的梯度，所以等密度离心法主要用于科研及实验室特殊方面的样品组份的分离和纯化。,三、分析型超速离心法,分析性超速离心法主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监测物质在一个离心场中的沉降过程。这相应的离心机称为分析型超速离心机，,分析型超速离心机,（一）分析性超速离心法的工作原理,分析型超速离心机主要由一个椭圆形

16、的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。该转子通过一个柔性的轴联接成一个高速的驱动装置，此轴可使转子在旋转时形成自己的轴。,转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其容纳了两个小室：分析室和配衡室。配衡室是一个经过精密加工的金属块，作为分析室的平衡用。,分析室的容量一般为1ml，呈扇形排列在转子中，其工作原理与一个普遍水平转子相同。分析室有上下两个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收（如对蛋白质和DNA）或折射率的不同对沉降物进行监测。,当光线通过一个具有不同密度区的透明液时，在这些区带的界面上产生光的折射。分析室中物质沉降时重粒

17、子和轻粒子之间形成的界面就像一个 折射的透镜，在检测系统 的照相底板上产出一个“峰”。由于沉降不断进行，界面 向前推进，“峰”也在移动，从峰移动的速度可以得到 物质沉降速度的指标。,分析型超速离心系统的示意图,（二）分析性超速离心法的应用范围,1.测定生物大分子的相对分子重量测定相对分子重量中应用最广的是沉降速度法。超速离心的高速使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动，在清除了粒子的溶剂和尚含有沉降物的溶剂之间形成一个明显的界面，该界面随 时间的推移而移动，这就是 粒子沉降速度的一个指标。用照相记录，即可求出粒子 的沉降系数。,2.生物大分子的纯度估计分析型超速离心机已广泛地应用

18、于研究DNA制剂、病毒和蛋白质的纯度。用沉降速度的技术来分析沉降界面是测定制剂均质性的最常用方法之一，出现单一清晰的界面一般认为是均质的，如有杂质则在主峰的一侧或两侧出现小峰。,3.分析生物大分子中的构象变化分析型超速离心机已成功地用于检测大分子构象的变化，例如DNA可能以单股或双股出现，其中每一股在本质上可能是线性的，也可能是环状的。如果遇到某种因素（温度或有机溶剂），DNA分子可能发生一些构象上的变化，这些变化也许可逆、也许不可逆，这些构象上的变化可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实。,第三节 离心机的分类与结构,一、离心机的分类,（一）低速离心机,是临床实验室常规使用的一类离心机。其

19、最大转速在10000r/min以内，相对离心力在15000 g 以内，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离。主要用作血浆、血清的分离及脑脊液、胸腹水、尿液等有形成份的分离。,（二）高速离心机,最大转速为20000rpm25000rpm（r/min）,最大相对离心力为89000g，最大容量可达3升,分离形式是固液沉降分离。主要用于临床实验室分子生物学中的DNA、RNA的分离和基础实验室对各种生物细胞、无机物溶液、悬浮液及胶体溶液的分离、浓缩、提纯样品等。,高速离心机,可进行微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)

20、或单个分子。为了防止高速离心过程中温度升高而使酶等生物分子变性失活,还装设了冷冻装置,因此又称高速冷冻离心机。,离心机的冷冻装置,（三）超速离心机,转速可达50000rpm80000rpm，相对离心力最大可达510000g，离心容量由几十毫升至2升。分离形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。为了防止样品液溅出，附有离心管帽；为了防止温度升高，装有冷冻装置。,超速离心机,超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。,按用途可分为,制备型,分析型,分析制备两用型

21、,超速离心机,制备型超速离心机主要用于生物大分子、细胞器和病毒等的分离纯化，能使亚细胞器分级分离，并可用于测定蛋白质及核酸的分子量。,制备型超速离心机,分析型超速离心机装有光学系统，可拍照、测量、数字输出、打印自动显示系统等，可以通过光学系统对测试样品的沉降过程及纯度进行观察。,分析型超速离心机,分析型超速离心机的主要特点：1.能在短时间内，用少量样品得到一些重要信息2.能确定生物大分子是否存在及大致的含量3.计算生物大分子的沉降系数4.结合界面扩散，估计分子的大小5.检测分子的不均一性及混合物中各组份的比例6.测定生物大分子的分子量7.可以检测生物大分子的构象变化等,随着科学技术的不断发展，

22、离心机技术日益创新。离心技术与临床实验室相接轨，由以往广泛型逐渐走向专业性很强的单一型专用离心机，对所分离的不同物质规定了一定的转速，相对离心力及时间，使离心操作向规范化、标准化、科学化及专业化方向发展。相应产生的离心机有免疫血液离心机、微量毛细管离心机、尿沉渣分离离心机、细胞涂片离心机等。,（四）专用离心机,1.免疫血液离心机 是为临床输血所设计的一种带有标准化操作程序的专用离心机。可用于白细胞抗原检测的淋巴细胞分离、洗涤及细胞染色体制作的细胞分离；用于血小板的分离、凝血酶的处理离心；用于抗人球蛋白试验；用于洗涤红细胞及血浆的分离等。,免疫血液离心机,2.微量毛细管离心机 是一种实验室专用离

23、心机，操作程序为自动化控制。最大容量一次可放24根毛细管，最高转速可达12000r/min，相对离心力最大可达14800g。在临床实验室用于血溶比试验，微量血细胞比积值的测定及同位素微量标记物的测定等。,微量毛细管离心机,3.尿沉渣分离离心机与尿液工作站相配套,在低速离心机的基础上，设定了特定专用水平转子。最高转速4000rmin，相对离心力可达2810g,实际工作中取尿样10ml于专用离心管中，离心转速设置在1500rmin，相对离心力为400g，离心时间为5分钟，一次可处理尿液标本为3210ml,广泛应用在临床实验室及基础教学实验室。,尿沉渣分离离心机,4.细胞涂片离心机采用水平杯式转子，

24、当样品经梯度离心分离出杂质，使用离心力将细胞从液体悬浮物中分离出来，甩到载玻片上。染液由自动喷雾器的转盘喷到每一张涂片上，用离心的方法除去过剩的染液。细胞、细菌分布均匀，无重叠，染色效果好。主要用于临床和基础实验室中分泌物、脑脊液、胸腹水等标本的脱落细胞及细菌的检查。,细胞涂片离心机,（一）低速离心机 其结构较为简单。由电动机、离心转盘、调速器、定时器、离心套管、与底座等主要部件构成.,二、离心机的结构,低速离心机的结构,（二）高速(冷冻)离心机 通常有转动装置、速度控制系统、温度控制系统、真空系统、离心室、离心转头及安全保护装置等。由于转速高，带有低温控制装置，离心室的温度可以调节和维持在0

25、40。转速、温度和时间也都可以严格准确控制，并有指针或数字显示。,高速冷冻离心机,(三)超速(冷冻)离心机,超速冷冻离心机,超速冷冻离心机,（组 成）,驱动和速度控制,温度控制,真空系统,转 头,转头（rotor）是离心机分离样品的核心部件，它的转速与转头的材料及强度有关。低速离心机一般采用强度好，重量轻的超硬铝合金；超速离心机采用钛合金。一般来说，对同一类型离心机重量轻、容量小的转头转速要高；反之转速要低。,三、离心机转头的分类应用及功能,1.固定角转头(fixed-angle rotor）：主要用于分离沉降速度有明显差异的颗粒样品。但具有“壁效应”，在离心管内将会引起强烈的对流，影响分离纯

26、度。,固定角转头,2.甩平式转头(swing out rotor,swing backed rotor):用于样品作低密度梯度离心，有敞开式和封闭式两种。,敞开式转头用于制备容量大、转速小于10000rpm、离心力场在16000 xg以内时，主要用于样品的初分离。,敞开式转头,封闭式转头,封闭式转头制备容量较敞开式小，转速大。主要用于线粒体、细胞核等的分离和密度梯度离心。,3.连续流动转头(consecutive flow rotor）主要用于悬浮介质中高速分离较小的颗粒物质，这种转头是利用离心淘析技术在无菌和低温条件下，被分离的组份，能保持活性，回收率高等优点。被广泛应用于科研和实验室工作。

27、,连续流动转头,当转子在运行速度旋转时，样品不断地通过密封组件中心管道泵入转子内，沿着轴心流底部，井在离心力的作用下使样品颗粒和其它溶液移动到密度梯度表面层。该技术对大规模分离提取和富集组织培养液、植物病毒、动物病毒和虫病 毒是非常有用 的技术，另外也可 以用来收获细菌，纯化组织匀浆中的亚细胞结构和水污染研究中分离粘土颗粒,4.区带转头(zonal rotor)主要用于大容量的密度梯度离心，转头由四块叶片的转头体和密封系统构成四个扇形小室，叶片上有径向导管，梯度液通过密封管道泵入转子内，然后通过密封组件中心输液管加入样品。由于试样及溶剂直接接触转头，所以对转头的耐腐蚀性要求高，区带转头避免了用

28、离心管所引起的壁效应和干扰，提高了分辨率。,区带转头,扇形小室,叶片,径向导管,5.垂直转头（vertical rotor）使用垂直转头对离心管密封要求严格，需要加离心管帽或用可热封的塑料离心管。垂直转头是一种固定角转头，离心管垂直放置。垂直转头分离的粒子位移距离等于离心管直径，主要用于样品在短时间作密度梯度离心。,垂直转头,四、离心机的主要技术参数及性能指标,(一)、离心机的主要技术参数,1.最大转速:离心转头可达到的最大转速，单位是rpm 2.最大离心力:离心机可产生的最大相对离心力场RCF，单位是g 3.最大容量:离心机一次可分离样品的最大体积，通常表示为m X n。m为一次可容纳的最多

29、离心管数，n为一个离心管可容纳分离样品的最大体积，单位是ml；4.调速范围（转速设置范围）:离心机转头转速可调整的范围 5.温度控制范围:离心机工作时可控制的样品温度范围 6.工作电压:一般指离心机电极工作所需的电压 7.电源功率:通常指离心机电机的额定功率,（二）离心机转头常用标记及参数,Ti 钛或钛合金 制成的转头,通常，对颗粒的质量和密度与溶液相差较大的分离样品，只要选择合适的离心转速和离心时间，就能达到较好的分离效果。对存在两种以上质量和密度不同的样品颗粒，则可采用差速离心法。差速离心方法常针对不同的离心速度和离心时间要求，使沉降速度不同的样品颗粒按批次分离。,一、离心方法的选择,对于

30、有密度梯度差异的样品介质，可采用密度梯度离心法，使沉降系数比较接近的物质得以分离。当不同样品颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，可采用等密度梯度离心。,分离的效果除了与离心机种类、离心方法、离心介质及密度梯度等因素有关以外，离心机转速和离心时间的确定、离心介质的pH值和温度等条件也至关重要。,二、离心机的转速、离心时间、温度和pH值的确定,离心机转速 即离心机旋转轴在单位时间内旋转的周数（转分钟），单位一般为rpm（rounds per minute）。相对离心力与离心机转速平方成正比。,温度和pH值 离心温度一般控制在4左右，对于某些热稳定性较好的酶等，也可以在室温下进行。但在超速或

31、高速离心时，转子高速旋转会引起温度升高，必须采用冷冻系统，使温度保持在一定范围内。离心介质溶液的pH值应处于酶稳定的pH范围内，必要时可采用缓冲液。另外，过酸或过碱还可能引起转子和离心机的其它部件的腐蚀，应尽量避免。,三、离心机的应用和维护,离心机因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用时必须严格遵守操作规程。,1.必须事先平衡离心管和其内容物，要对称放置，转头中绝对不能装载单数的管子，以便使负载均匀地分布在转头的周围。,2.开口离心机不能装载过多溶液，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀。制备型超速离心机的离心管，则要求必须将液体装满，

32、以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。,3.离心过程中应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常应立即停机检查，及时排除故障。未找出原因前不得继续运转。,4.每次使用前要严格检查转头孔内是否有异物和污垢，以保持平衡。每次使用后，都必须仔细检查，并用50 60的温水及中性洗涤剂浸泡清洗或定期用消毒液消毒（每周消毒一次），最后用蒸馏水冲洗，软布擦干后用电吹风吹干、上蜡、干燥保存。每一转头都应有使用档案，若超过了该转头的最高使用时限，则须按规定降速使用。,5.控制塑料离心管的使用次数并注意规格配套。离心过程中不得开启离心室盖，不得用手或异物碰撞正在旋转中的转头

33、及离心管。,6.低温离心样品时，应先将空的转头在2x10 rpm预冷一定时间，预冷时温度控制在0左右，也可将转头放在冰箱中，预冷数小时备用，离心杯可直接存放在冰箱中预冷。,3,7.每隔三个月应对离心机主机校正一次水平度，每使用5亿转处理真空泵油一次，每使用1500小时左右，应清洗驱动部位轴承并加上高速润滑油脂，转轴与转头接合部应经常涂酯防锈，长期不用时应涂防锈油加油纸包扎。离心机平时不用时，应每月低速开机1次 2次，每次0.5小时。,五、离心技术的应用实例,（一）密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,（二）快速氯化铯密度梯度离心法提取分离大质粒DNA,（一）密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,原

34、理：红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。,方法：在中号试管内加入适量淋巴细胞分离液；取肝素抗凝静脉血与等量Hanks液充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。2000rpm水平离心20分钟；离心后管内分为三层：上层为血浆和Hanks液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。,第四节 离心机的应用和维护,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带。用毛细管插到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一

35、中号试管内，加入倍以上体积的Hanks液，1500rpm离心10分钟，洗涤细胞两次；末次离心后,弃上清液，加入含有10小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2台盼蓝染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。,第四节 离心机的应用和维护,单个核细胞浓度:细胞活力检测：死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率：用本法分离外周血单个核细胞，纯度在90以上，收获率可达80%90，活细胞百分率在95以上。,=,活细胞百分率,4,（二）快速氯化铯密度梯度离心法提取分离大质粒DNA,原理：用氯化铯密度梯度离心分离核酸时(大于15kb)，

36、在高浓度氯化铯溶液中和溴化乙锭（EB）过量的情况下，EB-DNA络合物的浮力密度发生改变，改变的大小与EB结合量成反比。因此，用氯化铯密度梯度超速离心法，可分离双链RNA和单链RNA。也可分离共价闭合环状DNA与线形或带缺口的环状DNA。,同时，EB-DNA络合物在紫外光下能产生荧光，可见到离心后形成的区带，便于收集DNA，所得的EB-DNA络合物用异戊醇抽提去EB，即可回收所需的DNA。此法得到的DNA纯度很高。,步骤：将洗过的菌体重悬于10ml预冷的50mmol/L Tris、1mmol/L EDTA、25蔗糖（pH8.0）缓冲液中转移至30ml带螺口盖的离心管中加2毫升新配制的溶菌酶溶液

37、混匀，在冰浴中放置15分钟补加4ml 250mmol/L EDTA pH8.0，混匀后再置于冰浴中15分钟；缓缓加入 20ml Triton X-100溶液，（使均匀分散到整个细菌悬液当中,但要尽可能防止已释放出来的DNA受剪切），混匀后，置冰浴中放30分钟在4下，20000rpm离心60分钟，收集上清液于灭菌的量筒中，准确测量其体积；同时取上清液作琼脂糖凝胶电泳，观察质粒的含量。,采用Beckman Ti80头超速离心。按60（W/V）配制，即4ml上清液加入6g氯化铯，装入适合的离心管，将溶液加温至30，使其溶解，再加0.2ml 溴化乙锭（10mg/ml），管上层加入8ml 42氯化铯（W

38、/V）溶液（事先将氯化铯溶于TE缓冲液中），如管口不满可用轻石蜡油添满，平衡各离心管，并盖紧管盖，装入Ti80头中，在4下，65000rpm离心5小时；离心后，在普通光照下应能见到两条DNA带，上面区带含有线形DNA和有缺口的环状质粒DNA，下面的区带有闭合环状质粒DNA。管底为溴化乙锭RNA复合物；在长波长紫外灯下检测。,小心插入定量毛细管于下面一层质粒DNA带上，用电子微量泵将它吸出，放入磨口刻度离心管中。从DNA中除去溴化乙锭，用等体积异戊醇抽提3次4次，每次轻微翻转数次，离心后取下层无色的水相，直至无红色出现为止；将抽提后的无色溶液装入0.5cm直径的透析袋中，对TE缓冲液透析24小时48小时，并换液数次以除去氯化铯，或者用3倍体积水进行稀释并于0用2倍体积乙醇（即终体积相当于原未稀释体积的6倍）沉淀DNA20分钟，于4下，12000rpm离心30分钟，收集沉淀，沉淀用70冷乙醇洗一次，同上条件离心，去除上清液，沉淀于真空下抽干，溶于少量TE缓冲液中，置低温冰箱保存备用。,