聚合酶链反应(PCR)技术的基本原理及检测技术课件.pptx

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1、聚合酶链反应（PCR）技术的基本原理及检测技术,内容概要,概念和历史原理与体系分类特点注意事项,聚合酶链式反应的概念（PCR：Polymerase Chain Reaction),是一个在体外（？）特异地复制一段已知/未知序列的DNA片段的过程，这项技术使人们快速从试管中获得大量拷贝的特异核酸片段,快速特异扩增得到大量核酸,叩响生命之门,发现DNA双螺旋后67年大事纪,沃森和克里克在自然杂志发表文章提出DNA双螺旋结构，开启了分子生物学的辉煌时代,科学家们先后确认了人体共有23对染色体，并发现了首个因为染色体缺陷导致的疾病-唐氏综合症。随后DNA的复制以及其传递信息的方式被发现,1970年，限

2、制性内切酶的发现使得基因重组技术得以发展，从此打开了基因工程的大门。应用克隆转化的技术，成功生产出单克隆抗体，并应用于胰岛素的制备,基因技术快速发展的阶段，先后出现基因指纹技术、基因复制技术、DNA重组技术、基因组图谱等,1990年，人类基因组计划正式启动1997年，诞生了世界上第一只克隆动物-多莉羊2000年，人类基因组图谱绘制,2001年，人类蛋白组图谱启动2002年，疟原虫及蚊的基因图谱，水稻和小鼠的基因图谱 蛋白质图谱的绘制等也陆续展开，基因芯片，二代测序和高通量测序技术、全基因组扫描等不 断完善，蛋白和转录组学等2015年，奥巴马提出精准医疗2020年，SARS-COV2病毒大流行核

3、酸确定为诊断金标准,中心法则,DNA,Protein,Genome,Proteome,mRNA,Transcriptome,遗传信息载体,功能执行体,逆转录,转录,翻译,Gene一 mRNA Protein Metabolite,系统生物学,“Jolies mother,actress and producer,died of ovarian cancer in 2007 at the age of 56.She underwent further operation on her ovary and ovarian ducts very recently.BRAC1,Angelina Jol

4、ie(安吉丽娜朱莉)Undergoes double mastectomy 05/15/2013 CNN.com,个性化医疗/精准医疗的标志性事件,Genetic risk 87%risk-breast cancer50%risk-ovarian cancer,Kary B.Mullis（1944.12-2019.08.07）,Michael SmithPrize share:1/2,Awards and Honors,发现PCR的历程,DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明,发现PCR的历程（1）Khorana错失机遇,Mullis(1944-2019)，1983年春夏之交的一个晚

5、上，在Cetus公司工作期间，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法突发奇想成大事,很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一,发现PCR的历程（2）,1983年，Mullis跟女友开车到乡下度假途中瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链自己的车和对面开来的车：DNA聚合酶面对面地合成着DNA，,Mullis的第一个PCR实验,1983年9月，Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37一直保温。结果电泳上没有何条带。于是他用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带,P

6、CR技术的创建（3）,发现PCR的历程（4）,1983年,Kary B.Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得以实现1988年Saiki等，引入Taq酶技术 1989年，Science杂志列PCR 为十项重大科学发明之首,1989年为PCR爆炸年1993年，Mullis获1诺贝尔化学奖2019年8月7日，Mullis仙逝，享年75岁,内容概要,概念历史原理体系分类特点注意事项,二、PCR技术的原理及反应体系,1.PCR技术的基本原理,最早称之为：无细胞分子克隆法在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板DNA，四种dNTP，DNA多聚酶，一对引物（物质基础）通过高温变性、低温

7、退火和中温延伸三个阶段，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍（反应过程）一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍；扩增了特异区段的DNA带（结果）,2.PCR的反应过程,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR

8、的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,3.PCR技术的特点,高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,皮克(pg=10-12)甚至单个拷贝扩增到微克(g=10-6)水平,高特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键引物设计的最重要原则：最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增,PCR技术的特点,应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列引物长度以15

9、-40 bp为宜碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%引物内部避免形成二级结构两引物间避免有互补序列引物3端为关键碱基；5端无严格限制,引物设计原则,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记,操作简便易行,PCR扩增法，只需数小时，就可用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列传统的DNA 扩增法是分子克隆法，首先要构建含有目的基因的载体，然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选；这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程，操作复杂，一般需要数天到数周时间,PCR技术的特点,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA

10、，如新冠病毒RNA的检测，有些试剂盒可以无须抽提直接检测,对标本的纯度要求低,PCR技术的特点,4.PCR的反应体系和注意事项,PCR经（1）高温变性、（2）低温退火和（3）中温延 伸三步，Tap多聚酶以dNTP为原料，以引物为复制的起 点，合成新链如此重复循环,经每次拷贝数放大一倍的 2030次循环，待测基因片段放大了数百万倍 扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯下肉眼 能见到扩增特异区段的DNA带/或者其它检测技术进行 后续分析和研究,PCR的反应体系,PCR技术的基本过程(1),模板DNA dNTP 引物Buffer,预变性,模板DNA dNTP 引物Buffer,TaqDNA聚合

11、酶,94oC5min,基本过程,PCR技术的基本过程(2),Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer,循环仪,9455 72,Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer,72 57 min,PCR技术的基本过程(3),测序酶切克隆DNA/RNA/蛋白杂交小分子探针.,PCR反应体系中的成分,单、双链DNA均可不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类一般1-100ng DNA模板/100L 模板浓度过高会导致非特异性增加过低，无扩增，假阴性,模板,提取的核酸即可作为模板用于PCR反应临床检测标本，也可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质

12、使靶基因游离，直接用于PCR扩增RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA,引物浓度,通常10-100pmol/L过高，易导致模板与引物错配，特异性下降产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计合适的引物，用 PCR就在体外大量扩增注意引物聚合体的影响,0.5-2.5 U/50 l两种Taq DNA 聚合酶天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个 PCR反应约需酶量 2.5U/100 l过高，非特异性扩增；过低，产物量减少,Taq DNA聚合酶,dNTP,所需浓度取决于需要扩增片段的长度 一般用

13、等浓度的四种dNTP混合 过高，易产生错误碱基的掺入过低，降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性,dNTP的质量与浓度与 PCR扩增效率有密切关系dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，缓冲液调pH到7.0-7.5，小量分装，-20冻存，避免多次冻融扩增体系中dNTP应为50-200mol/L，等摩尔配制，如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），易引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低,Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂0.5mmol/

14、L-2.5mmol/L反应体系Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度,（1）变性双链DNA解链为单链：温度：94oC 20-30秒（2）退火：温度由引物长度和GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性（3）延伸时间由扩增片段长度决定 温度：70-75,一般为72（4）循环次数：主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加,循环参数,循环参数非一成不变，科学和灵活的应用,经典循环参数（

15、500bp以内）,94 30s 55 45s72 1min,94 5min,30次,72 7min,42 forever,5）PCR反应条件的选择,PCR反应条件包括:温度时间循环次数,温度与时间的设置,设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应：三温度点法：9095模版变性40 60引物退火并结合到靶序列上，7075 模板延伸二温度点法：对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸,变性温度与时间：,变性温度低，解链不完全是导致失败的最主要原因一般9394 l min足以使模板DNA变性若低于93则需延长时间但温度不能过高，因为

16、高温对酶的活性有影响此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，可能会导致PCR失败或者效率降低,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至4060，引物和模板结合退火温度与时间，取决于引物长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想,退火(复性)温度与时间：,Tm值（解链温度）指把DNA的双螺旋结构解链一半时的温度，亦即变性时，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度。当核酸达到Tm值 时，其260nm吸收量可增加百分之四十长度低于25mer的引物：Tm=4oC（G+C）2oC（A+T）更长的引物：Tm

17、=81.5+16.6 x Log10Na+0.41(%GC)600/size Tm值内，较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间：一般30-60秒，足以使引物与模板之间完全结合,可通过以下公式帮助选择,引物的退火温度,延伸温度与时间,Taq DNA聚合酶的生物学活性：70-80 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/S/酶分子 高于90时，DNA合成几乎不能进行,延伸温度与时间,延伸温度：一般在7075，常用温度为72，过高不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1

18、min（足够）34kb的靶序列需34min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,循环次数,循环次数 决定PCR扩增程度循环次数 主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在3040次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,内容概要,概念历史原理体系分类特点注意事项,三、常见的PCR技术,基于扩增基础的分子诊断技术及其应用,1983年后的37年里，扩增DNA的技术成为分子诊断应用最广的技术之一，发展变化了数十种核酸扩增检测技术根据DNA被扩增的过程中是变温还是恒温方式，可以将核酸扩增技术分为两类，温度循环式的扩增技术，常规PCR和实时

19、定量PCR（RTQ-PCR）等温方式的扩增技术，以核酸序列扩增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、转录介导的扩增（Transcription-mediated amplification，TMA），环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等技术为主。,一、温度循环式的扩增技术,常规PCR：反应结束后对产物进行电泳、杂交、测序等方式分析，常与其他技术的结合衍生出多种分析方法，如：结合限制性长度多态性（PCR-RFLP）、结合特异性寡合苷酸探针 斑点杂交（PCR-ASO

20、）、结合变性梯度凝胶（PCR-DGGE）、结合单链构象多态性（PCR-SSCP）等分析技术RT-PCR：病原体的多重PCR（Multiplex PCR），提高敏感性和 特异性的巢式PCR（nested PCR），研究基因表达的原位 PCR（in situ PCR），分析RNA的逆转录PCR（RT-PCR）以及锚定PCR、不对称PCR、膜结合PCR等等,荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,I.普通荧光定量PCR,常用的荧光标记方法可简单分为两大类：非特异检测双链DNA内插式荧光染料 代表是

21、SYBR Green 荧光染料 扩增序列专一检测主要指荧光探针 TaqMan探针和分子信标Molecular Beacon,荧光染料：成本低廉，实验设计简便探针杂交：原理上严格，数据特异性高、更为精确,Real time PCR的特点,在定性PCR技术上发展起来的核酸定量技术实现了对DNA模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强能实现多重反应让自动化程度成为可能避污染性、具实时性和准确性等特点,Real time PCR,利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析,69,Real-time PCR与普通PCR的区别,

22、可定量结果采用闭管检测，不需PCR后处理，扩增和检测一次同时完成不需开盖，不产生污染探针与被检DNA序列特异杂交，增强了特异性光谱分析仪直读结果，自动分析，增强了灵敏性和客观性,Real time PCR原理,荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 荧光信号指数扩增阶段：PCR 产物量的对数值与起始 模板量之间存在线性关系平台期：关系复杂为了定量和比较的方便，在RT-PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值,荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标 准(即PCR扩增产物量的标准)Ct值中的C代表循环数(Cycle),t代表阈(threshold)Ct值的

23、含义：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所 经历的循环数,荧光信号阈（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值真正的信号:荧光信号超过阈值,为什么用Ct值定量而不用终点相对荧光强度定量,相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图,Ct值的重现性,软件自动利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度,荧光强度-循环数曲线,初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线,.,未知,104,103,106,105,102,10,Real time PCR如何定

24、量？,初始 DNA量越多,荧光达到域值时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量,确定初始模板的浓度,Real time PCR荧光探针,非特异性标记 SYBR Green I,特异性的荧光探针 Molecular Beacon,TaqMan,非特异性标记：SYBR Green I,扩增产物的荧光标记原理,延伸结束，形成双链DNA，此时sybr green结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发是，会发射出荧光检测时机在延伸结束时,SYBRGreen,SYBR Green I 熔解曲线分析,融解曲线的作用,判断PCR产物的特异性；排

25、除非特异性扩增产物的干扰,特异性荧光探针：Molecular Beacons,茎由互补配对的序列组成,环与目标序列完全配对,荧光基团,淬灭基团,分子信标（molecular beacon）是一类能形成发夹结构(或者叫茎环结构)的探针，序列两末端序列互补（5-8bp左右），中间环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补。探针一端标记报告荧光基团，另一端结合淬灭基团,当探针游离呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，荧光基团激发的荧光能量被淬灭基团吸收而使检测探头无法检测到当互补序列出现时，探针与DNA杂交，探针转变成一个开放的线性结构，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产从而产生

26、可被检测到的荧光,延伸:没有荧光,Molecular Beacons,Molecular Beacons SNP,T,A,C,C,G,G,G,G,G,T,T,A,C,G,A,A,C,G,G,T,A,A,T,T,T,T,T,G,C,C,C,C,C,A,A,A,A,Q,荧光素,目标序列,茎,淬灭剂,TaqMan探针法,指扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针：该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q）,与目标序列互补,当探针完整的时候，5端报告基团经仪器光源激发的荧光正好

27、被近距离的3端荧光基团淬灭，仪器检测不到5端报告基团所激发的荧光信号,Taqman技术原理,Taq酶在链延伸时遇到与模板结合的探针，其5-3外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）就会将切割探针释放5端报告基团游离于反应体系中，远离3端荧光淬灭基团的屏蔽，5端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数,PCR扩增过程中：,Probes:Taqman(double dye),三种不同探针的比较,数字PCR是一种绝对定量的工具当前DNA定量有三种

28、，光度法：基于DNA分子的吸光度来定量；实时荧光定量：基于Ct值，也就是可以检测到荧光值对应的循 环数定量；数字PCR：最新的定量技术，基于单分子PCR方法来采用计数 的方法对DNA进行定量,II.数字PCR,主要采用当前分析化学热门研究领域-微流控的方法，将大量的稀释后的DNA溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的DNA模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个DNA模板的反应器就会亮，没有DNA模板的反应器就是暗的。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的DNA浓度,原理,数字PCR原理,目的：扩增产生特异长度的单链DNA方法：采用不等量的一对引物，若干循环后，量少

29、的一种先 消耗完，剩下另一引物参与以后的循环反应，产生大 量单链DNA。两种引物的最佳比例一般是0.01：0.5M(50-100:1)，关键是限制性引物的绝对量 用途：制备核酸序列测定的模板和杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,III.不对称PCR,不同方式的PCR技术,连接酶链反应,点突变的研究、微生物病原体的检测及定向诱变、单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断、微生物种型鉴定，癌基因的点突变研究,高浓度引物,低浓度引物,是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。用限制酶消化基因组DNA，用连接酶将各片段连接成环状。用限制酶切割已知序列

30、，根据已知序列设计3端引物和5 端引物，扩增未知序列,未知序列,未知序列,III.反向PCR(reverse PCR),已知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,IV.多重PCR,利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记，用以直观地检测目的基因特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,V.LP-PCR（Labelled primers),标记引物,PCR,观察,PCR产物,已知靶基因片段一侧的序列。,以mRNA为模板经RT合成cDNA，末端转移酶在cDNA3末端加上poly(dG

31、)尾。Poly(dC)锚定引物与poly(dG)尾互补结合引导合成未知DNA序列,VI.锚式PCR,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,PCR扩增,探针,检测探针信号,VII.PCR固相分析法,1990年，Haase等首创利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物可直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增可进行细胞内定位适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,VIII.原位PCR,原位聚合酶链式反应（In Situ PCR

32、）,操作步骤：1.细胞或组织的固定 2.PCR扩增细胞内目的片段 3.原位杂交检测扩增产物,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,逆转录酶,DNA聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,逆转录PCR是用来扩增RNA的cDNA拷贝的方法。RT-PCR非常灵敏，被用于从小量的mRNA生成大量的cDNA文库等领域；RT-PCR也能用于鉴定转录序列的突变及多态性,IX.逆转录PCR（RT-PCR）,以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等。逆转录生成cDNA方式：以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为引物以oli

33、go(dT)为引物，mRNA3末端polyA与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物,热启动主要是通过抑制PCR反应体系一种基本成分，延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。避免了起始循环较低温度下的非特异性扩增，提高了PCR反应的灵敏度及特异性,11.Hotstart PCR（热启动PCR）,通过在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm 高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1到2，直到退火温度低于Tm约 5特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势,12.Touchdown PCR（降落PCR）,判断PCR反应的

34、有效性和正确性：对PCR产物进行电泳，观察扩增条带的有无扩增及扩增片段的大小对产物进行定量分析和序列分析：检测产物中的点突变：PCR-RFLP PCR-ASO PCR-SSCP PCR-DGGE 融点曲线分析 PCR产物测序,PCR产物检测,凝胶电泳分析技术,主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。其中琼脂糖凝胶电泳因操作简单，较常用，一般采用浓度为1-2%的琼脂糖凝胶通过电泳分析技术可直接观察到有无扩增产物，及产物片段的大小，可用于扩增产物的定性分析,HCMV PCR产物电泳分析结果,594bp,600bp,2652bp,800bp,50bp,350bp,M 1 2 3,PCR-RFLP

35、法,限制性内切酶,Ras基因,突变,限制性内切酶,Ras基因,正常,突变,电泳,ASO探针法,A,C,T,G,ASO探针,正常,病人,PCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交,探针杂交技术,探针（probe)是通过一定手段标记的已知核酸序列。探针杂交技术的原理：在一定条件下扩增产物与其特异性同源探针可按碱基互补原则形成杂交链，通过对其中探针信号的检测来获得产物的信息,膜上杂交技术通常采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。将待测核酸片段通过凝胶电泳分离后转印到膜上或直接点样于膜上再与探针进行杂交，经漂洗，显色得到结果。（South

36、ern 印迹、Northern印迹、斑点杂交）可对产物进行定性分析，但对操作要求较高，曾经主要用于科研，衍生技术已经逐渐广泛用于临床,膜上杂交技术检测结果,探针杂交,NC膜,探针,正常人,突变纯合子,突变杂合子,类似于ELISA技术中的双抗体夹心法。首先通过微孔板孔壁上包被的捕获探针来捕获PCR产物。然后再用带有标记的检测探针与产物另一区域杂交，经过漂洗显色即可判断结果可用酶标仪判读，用于半定量测定。但整个操作过程不是全封闭的，易造成扩增产物污染,微孔板杂交技术,是近些年发展起来的一项新技术，通常的RT-PCR技术多采用的该技术，其反应体系中除常规引物外，还引入了荧光基团标记的特异性探针，可与

37、模板一对一结合。有荧光共振数量转移法；荧光动态定量系统优点：在全封闭条件下进行PCR定量，有效防止了扩增产物的污染。实时监测，荧光定量，结果直观，定量准确。结合了PCR技术与探针杂交技术的优点，特异性强，灵敏度高,荧光探针杂交技术,等/恒温方式的扩增技术,核酸序列扩增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）转录介导的扩增（Transcription-mediated amplification，TMA）环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）链置换扩增法（strand d

38、isplacement amplification，SDA）滚环扩增法（Rolling Crile Amplification，RCA）复制酶扩增QB等,恒温扩增技术主要包括,等温方式的扩增技术（1）,核酸序列扩增法/NASAB 通过AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、RnaseH三种酶的协同 作用为核酸扩增提供动力，逆转录酶将RNA转录成cDNA，生成的RNA-DNA，产物被RnaseH分解为单链DNA，引物2 结合DNA，再在逆转录酶作用下合成双链DNA，双链DNA 上引物携带的T7RNA聚合酶的启动子序列将DNA转录成 RNA，RNA又可以生成DNA，使反应循环发生转录介导的扩增/TMA

39、使用逆转录酶和T7RNA聚合酶，在反应中同时利用逆转 录酶酶的逆转录活性和Rnase活性，反应动力的维系与 NASBA类似,等温方式的扩增技术（2）,LAMP：技术是利用BstDNA聚合酶的链置换活性提供反 应动力SDA：是应用DNA聚合酶的53核酸外切酶活性从双链 DNA上的缺口处开始合成新链，剥离旧链，当缺 口重复产生时，切割延伸链置换的过程循环 进行，目的片段被扩增RCA：利用环状DNA与强链置换活性的29DNA聚合酶 为DNA延伸提供动力,NSAB,操作简便不需特殊仪器不需温度循环循环次数少忠实性高特异性好扩增效率高于标准qPCR,TMA,基于测序基础的分子诊断技术,费用：曾经有巨大的

40、经费问题,传统的Sanger测序法很难大幅度降低测序费用;，新技术费用降低明显断片段数据库：人类以及其它主要模式生物参考序列数据库的建立使得短片段作图成为可能,这极大地促进了短片段测序技术的发展需求：组学研究越来越多需要，极大地促进了新型测序技术的发展相关学科技术进展：其它学科、各项相关技术的发展,例如显微镜技术、表面化学技术、核苷生化技术、聚合酶工程技术、计算机技术、数据储存及分析技术等,为DNA测序技术提供了极大的支持,测序技术发展的动力,就PCR技术本身而言，已趋成熟和多样化，但在实际操作中，由于各种条件的限制，常会遇到一些问题（假阴性或者假阳性）需要分析，并调整反应条件,易发生的问题及

41、解决方法,是否加入了TaqDNA酶，及酶活性如何DNA解链是否充分。要注意是否达到了解链温度（解链不完全往往是失败的重要原因）样品中可能有酶抑制剂，95加热10分钟将其失活使用多组合引物，作双PCR,没有得到所希望的PCR产物（假阴性）,设立阴性对照和空白对照；样品收集、处理时避免操作污染；避免阳性对照样品对检测样品的污染,减少聚合酶浓度；增加退火温度；减少循环周期,所有样品均为阳性（假阳性）,基因组DNA作为模板时，由于其数量的庞大及结构复杂，除特异扩增外，往往很容易产生非特异扩增产物，增加退火温度，减少退火时间及延伸时间降低引物及TaqDNA酶浓度改变Mg2+的浓度,PCR产物呈片状,出现

42、非特异性扩增,PCR的概念和流程PCR体系的组成QPCR的概念及原理为何用Ct值而不用终点荧光信号强度？,思考题,三篇早期重要论文,The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction(Scientific American,1990,262(4):56-61,64-5.Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase(Science,1988,239(4839):487-91)Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction(Methods in Enzymology,1987,155:335-50),谢 谢,