细菌学检验1分枝杆菌属课件.ppt

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1、,下页,退出,分枝杆菌属,（,Mycobacterium,）,总目录,上页,下页,退出,返回,内容提要,分枝杆菌属,分枝杆菌属概述,结核分枝杆菌,麻风分枝杆菌,微生物学检查,概述,生物学性状,致病性与免疫性,防治原则,概述,生物学性状,微生物学检查,致病性,防治原则,非结核分枝杆菌,总目录,上页,下页,退出,返回,分枝杆菌属概述,?,是一类,细长微弯,的细菌，因有,分枝生长趋势,而得名,?,特点,细胞壁含有大量的脂类（分枝菌酸）,菌体不易着色，不易脱色，常采用抗酸染色，,抗酸,染色阳性,（抗酸杆菌）,营养要求高，,生长缓慢,无特殊结构，不产毒素，其致病性与菌体成分有关,引起疾病都呈慢性，并伴肉

2、芽肿,总目录,上页,下页,退出,返回,分枝杆菌属概述,?,分类,总目录,上页,下页,退出,返回,第一节,结核分枝杆菌,（,M.tuberculosis),一、概述,俗称结核杆菌,(,Tubercle bacilli,，,TB),，引起人类,结核病,有着三千年历史的古老疾病,目前，全球约有,1/3,人口受结核杆菌感染，,70%,在亚洲。每年新发病例,800,万，,300,万人死于结,核病,结核病成为亟待解决的全球性公共卫生问题，,是艾滋病高发区人群的首要死因,总目录,上页,下页,退出,返回,第一节,结核分枝杆菌,（,M.tuberculosis),一、概述,致病菌主要包括：人结核分枝杆菌、牛分枝

3、杆,菌、非洲分枝杆菌。,人型结核分枝杆菌,感染的,发病率最高,我国是世界上结核病负担最严重的,22,个国家之,一，每年,25,万死于结核，,传染病之首,世界防治结核病日,3,月,24,日,总目录,上页,下页,退出,返回,二、生物学性状,?,形态与染色,细长略弯，分枝状,荚膜对菌体有一定的保护作用,抗酸染色阳性,，,菌体呈红色，,背景呈蓝色,总目录,上页,下页,退出,返回,?,金胺,O,染色,：在荧光显微镜菌体呈橘黄色,?,L,型菌：,Much,颗粒，多见于细菌的变异,总目录,上页,下页,退出,返回,结核杆菌电镜图,总目录,上页,下页,退出,返回,?,培养特性,专性需氧，,pH,偏酸,6.5-6

4、.8,营养要求高，常用,罗琴氏培养基,（选择性固体培养基，,培养基所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长）,生长缓慢,，,18h/,代，,2-4W,可见菌落生长,菌落特征：乳白或米黄，表面,粗糙,呈颗粒结节，边缘,不整，呈“,菜花样,”菌落,液体培基：表面生长成菌膜,二、生物学性状,总目录,上页,下页,退出,返回,总目录,上页,下页,退出,返回,二、生物学性状,?,生化反应,不发酵糖类,触酶试验阳性,热触酶试验：将细菌悬液,68,30min,，再加过,氧化氢,?,对区别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌有重要意义,?,结核分枝杆菌,热触酶试验阴性,总目录,上页,下页,退出,返回,?,抵抗力,四怕：,?,

5、对酒精敏感,?,对湿热敏感,?,对紫外线敏感,?,对抗结核药物（链霉,素、异烟肼、利福平,等）敏感，但易产生,耐药性,二、生物学性状,?,抵抗力,四不怕：,?,耐干燥,?,耐酸碱,?,耐染料,?,对青霉素等抗生素,耐药,总目录,上页,下页,退出,返回,?,变异性,形态结构变异,?,在异烟肼、溶菌酶等作用下形成,L,型（多形性）,菌落变异,?,R-S,型变异，性状典型,不典型，毒力减弱,毒力变异：,?,卡介苗,BCG,：,Calmette,和,Gu,rin,将牛分枝杆菌经,13,年,230,次传代而获得的,减毒活疫苗株，,用于预防结核病,耐药性变异,?,易发生，抗结核药物的结核菌株日益增多,二、

6、生物学性状,总目录,上页,下页,退出,返回,三、致病性与免疫性,?,致病物质,菌体成分,，机体免疫病理损伤,脂质,存在细胞壁，含量与毒力平行,?,索状因子（糖脂,-,分枝菌酸,+,海藻糖）：破坏细胞，,引起,肉芽肿,?,磷脂：形成,结核结节,和,干酪样坏死,?,蜡质,D,（分枝菌酸,+,肽糖脂）：引起迟发性过敏反应,?,硫酸脑苷脂：抑制吞噬体与溶酶体结合,总目录,上页,下页,退出,返回,三、致病性与免疫性,?,致病物质,菌体成分,，机体免疫病理损伤,蛋白质,?,有抗原性、本身无毒，如,结核菌素,?,蛋白质,+,蜡质,D,迟发型变态反应。组织坏死、,全身中毒症状结核结节形成,荚膜,总目录,上页,

7、下页,退出,返回,?,感染方式,多途径感染：,呼吸道,、消化道或皮肤损伤侵入,机体,?,所致疾病,结核病,，疾病种类多样化，以,肺结核,常见,三、致病性与免疫性,总目录,上页,下页,退出,返回,?,所致疾病,肺部感染：,?,原发感染,:,多发生于儿童,原发综合征：原发灶（肺泡渗出性炎症）、淋巴,管炎和肿大的肺门淋巴结,纤维化和钙化而自愈,复发：内源性感染的来源,三、致病性与免疫性,总目录,上页,下页,退出,返回,?,所致疾病,肺部感染：,?,继发感染,:,多发生于成人，内源性感染,病灶多局限，不累及邻近淋巴结,干酪样坏死和空洞,，菌可随痰排出，,开放性肺结核,三、致病性与免疫性,空洞,干酪样坏

8、死,总目录,上页,下页,退出,返回,?,所致疾病,肺外感染：,?,免疫力低下患者,?,常见于脑、肾、骨、关节、,生殖系统。,脑结核、肾结核、,淋巴结核、皮肤结核,等,?,痰菌被咽入消化道或食入了,消毒不严格的牛奶也可引起,肠结核、结核性腹膜炎,等,?,少数形成全身粟粒性结核或,播散性结核,三、致病性与免疫性,总目录,上页,下页,退出,返回,?,免疫性,传染、免疫、超敏反应共存,人体对该菌有较强免疫力（感染率高，发病率,低）,主要是细胞免疫，,有菌免疫,细胞免疫与迟发型超敏反应同时存在,三、致病性与免疫性,总目录,上页,下页,退出,返回,?,免疫性,结核菌素试验（,Tuberculin test

9、),（,OT,试验）,?,原理：是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结,核分枝杆菌是否能引起迟发型超敏反应的一种试验，,以,判断机体对结核有无免疫力,?,试剂：旧结核菌素（,OT,）,-,主要成分是结核杆菌蛋白,纯蛋白衍生物（,PPD,）,?,方法：前臂皮内注射,OT,或,PPD5,单位，,48-72h,后观察,三、致病性与免疫性,总目录,上页,下页,退出,返回,?,免疫性,结核菌素试验（,Tuberculin test),（,OT,试验）,?,结果：,阳性：红肿硬结直径,5mm,，表明曾感染过结核杆菌,/,接种,BCG,强阳性,：直径,15mm,，表明可能有,活动性结核,阴性：直径,5mm

10、,，表明无结核感染，但应排除原发,感染的早期、老年人、严重结核患者或同时患有其它,传染病、获得性免疫功能低下等情况,三、致病性与免疫性,总目录,上页,下页,退出,返回,?,免疫性,结核菌素试验（,Tuberculin test),（,OT,试验）,?,应用：,选择卡介苗接种对象、测定卡介苗接种后的免疫效果,了解人群自然感染率,作为婴幼儿结核病的辅助诊断,测定肿瘤患者的细胞免疫功能,三、致病性与免疫性,总目录,上页,下页,退出,返回,总目录,上页,下页,退出,返回,四、微生物学检查,总目录,上页,下页,退出,返回,总目录,上页,下页,退出,返回,四、微生物学检查,?,标本采集,清晨第一口痰送检,

11、无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛,无菌试管送检,脑脊液标本静置后，表面有细薄凝块，取凝,块作涂片或接种培养,采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,总目录,上页,下页,退出,返回,四、微生物学检查,?,检验方法,直接涂片染色镜检,：,常用的简易快速检查方法,?,齐,-,尼抗酸染色,：痰涂片要厚，观察至少,100,个视野。,结核分枝杆菌,抗酸染色后呈红色,，其他细菌和细胞为,蓝色,?,金胺,O,染色,：荧光显微镜下见金黄色荧光的结核分枝,杆菌，结果快速准确,结果应报告“,找到或未找到抗酸性杆菌,”，而,不能报告“找到结核分枝杆菌”,总目录,上页,下页,退出,返回,?,齐,-,尼抗酸染色结果报

12、告方式,总目录,上页,下页,退出,返回,四、微生物学检查,?,检验方法,核酸检测,?,用,PCR,法,快速诊断结核分枝杆菌感染,?,特异性与敏感性均大于,95,抗,PPDIgG,的检测,?,ELISA,法检测患者血清中抗,PPDIgG,?,可作为活动性结核分枝杆菌感染的快速诊断方法，,阳性率为,80,90,总目录,上页,下页,退出,返回,四、微生物学检查,?,检验方法,分离培养,?,无杂菌污染的标本：脑脊液、胸腹水等可直接或离心后,取沉渣接种,?,有杂菌污染的标本在接种到培养基之前须做,4%NaOH,处,理,15min,，以消除杂菌的干扰,?,标本接种于,罗琴培养基,。,37,，,5,10,C

13、O,2,培养,8,周，,如果出现,干燥呈颗粒状、灰白色菌落，涂片染色为抗酸,阳性，多数是结核分枝杆菌,。阴性继续培养至,12,周方可,报告,总目录,上页,下页,退出,返回,?,检验方法,总目录,上页,下页,退出,返回,总目录,上页,下页,退出,返回,总目录,上页,下页,退出,返回,总目录,上页,下页,退出,返回,总目录,上页,下页,退出,返回,四、微生物学检查,?,检验方法,菌种鉴定：可为结核病和非典型分枝杆菌,病的临床鉴别和防治提供科学的依据,?,PCR,反向膜探针杂交,EHSA,法,(PCR,杂交梳,),?,DNA,探针,?,16s rRNA,基因序列测定,?,高效液相色谱,(HPLC),

14、检测,总目录,上页,下页,退出,返回,四、微生物学检查,?,检验方法,动物接种,?,可用于结核分枝杆菌的分离和毒力测定,?,此法敏感可靠，但手续较繁琐，,不能列为常规,?,常用的豚鼠,?,在接种后,3-4,周出现局部淋巴结肿大，身体消瘦，结核,菌素试验转为阳性,?,剖检时可看到淋巴结、肝、脾、肾、肺等脏器的典型,结核病变，由病变处可查到抗酸杆菌或经培养有结核,分枝杆菌生长,总目录,上页,下页,退出,返回,四、微生物学检查,?,检验方法,药物敏感性试验,?,耐药株的增多，应做药物敏感性试验，以指导临床合理,用药。,?,将纯培养物菌悬液，接种含各种浓度药物的固体培养基,（,改良罗氏培养基,）上，同

15、时做不含药物的对照组,?,常用方法：,绝对浓度法（间接法）、比率法,总目录,上页,下页,退出,返回,药物敏感性试验绝对浓度法（间接法）,我国,30,多年来一直沿用的常规药敏试验方法,。,1.,菌悬液制备,：,（,1,）临床分离分枝杆菌的,新鲜培养物,（初生长,2,周），初生,长,2,周后和贮存培养物须在改良罗氏培养基上二次传代，取,23,周的亚培养物进行试验。,（,2,）菌悬液制备：取上述培养物（需刮取斜面各个部分）,放玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动使呈乳酪样，以,0.5%,吐,温,-80,生理盐水磨菌稀释，与标准麦氏比浊管比浊配成,1mg/ml,的,菌悬液。,总目录,上页,下页,退出,返回,

16、药物敏感性试验绝对浓度法（间接法）,2.,含药培养基制备,：,改良罗氏培养基,每,100ml,加入,1ml,抗结核稀释药液，制成含不同药物尝试的培,养基斜面备用。,3.,接种,：将制备的菌悬液,10,倍稀释,至,10,-2,mg/ml,，,以灭菌吸管准确吸取菌液,0.1ml,分别接种,于含药,培养基和对照培养基斜面上，每管接种菌量为,10,-,3,mg/ml,。置,37,培养四周观察结果。,总目录,上页,下页,退出,返回,药物敏感性试验绝对浓度法（间接法）,4.,菌落生长情况,：同分离培养（以,-,、,+,、,24+,）。,5.,药敏结果判断,：低浓度含药培养基分枝杆菌未生长,者报告敏感（,S

17、,），生长（,1+,）以上者报告耐药,（,R,）。,6.,质量控制,：每批试验应以结核分枝杆菌参考菌株,（,H37Rv,敏感株）,10,-3,mg/ml,检测含药培养基质量。,要求对照培养基菌落数在,200,个以上且无融合，若,菌落数低于,50,个时，要求重新作药敏试验。,总目录,上页,下页,退出,返回,药物敏感性试验,?,比例法：是世界卫生组织（,WHO,）全球结核病,耐药监测项目统一推荐的方法。,1.,培养基制备,：同上述绝对浓度法。培养基药物中药物终浓度,为：异烟肼,0.2mg/ml,，双氢链霉素,4mg/ml,，利福平,40mg/ml,，乙,胺丁醇,2mg/ml,。,2.,菌液,：新鲜

18、菌落制成,1.0mg/ml,菌悬液，依次稀释至,10,-2,和,10,-4,mg/ml,。,3.,接种,：分别接种,10,-2,和,10,-4,mg/ml,菌液,0.01ml,至对照及含药,培养基斜面。,4.,培养,：,37,培养,4,周,总目录,上页,下页,退出,返回,药物敏感性试验,?,比例法：,5.,结果的判读、解释和报告,：计算耐药,百分比，即含药培养基上菌落数与无药培养,基上菌落数相比的百分比,。,?,耐药百分比,(,含药培养基上菌落数,)/(,对照培养基,上菌落数,),100%),。,?,1%,者报告敏感（,S,），,1%,者报告耐药（,R,）。,总目录,上页,下页,退出,返回,总

19、目录,上页,下页,退出,返回,五、防治原则,?,预防：,一般性预防：卫生宣传、提高机体抵抗力,特异性预防：,?,发现和治疗痰菌阳性者,?,新生儿和结核菌素试验阴性的儿童接种卡介苗,?,治疗：,一般治疗：合理营养，注意休息,抗结核药物链霉素、异烟肼、利福平等,?,治疗原则：早期、联合、适量、规律、分阶段治疗和,坚持全程,总目录,上页,下页,退出,返回,第二节,非典型分枝杆菌,是指,结核和麻风分枝杆菌以外,的分枝杆菌。因具,有抗酸性，故又称非典型抗酸性菌。,广泛分布于外环境和人及动物的机体中。,已发现,17,种以上能引起人类疾病，引起的肺部感,染,又难以与结核分枝杆菌感染区别,，,并对常用抗生素和

20、抗结核药物耐药，所以区分鉴,别非典型分枝杆菌具有重要的意义。,总目录,上页,下页,退出,返回,一、光产色分枝杆菌,?,特点是在暗处不产生色素，光照,1h,后能在,48h,内，菌,落转为黄色或橘黄色。,?,对人有致病性的是：,堪萨斯分枝杆菌：广泛分布于水和土壤中,能引起,肺内外结核样的病变。,海分枝杆菌：为水中的腐生菌。通过皮肤微小创,口侵入，引起所谓的“游泳池肉芽肿”。,猿分枝杆菌：先后从猿和人体分离出此菌。,总目录,上页,下页,退出,返回,二、暗产色分枝杆菌,?,有光或无光均能产生色素，呈黄色或橘黄色。,?,对人有致病性的为：,瘰痢分枝杆菌：,25,-37,均可生长，,35,最,为适宜，,4

21、5,则不能生长。可引起人淋巴结炎,或肺部感染。,苏尔加分枝杆菌：,37,时为暗产色，,25,时为,光产色。本菌引起成人肺部的慢性感染。,总目录,上页,下页,退出,返回,三、不产色分枝杆菌,?,不能产生色素。对人有致病性的是：,鸟,-,胞内复合分枝杆菌,(MAC/MAIC),：,AIDS,患者,易感染，对抗结核药物不敏感或产生耐药。,溃疡分枝杆菌：通过创伤感染，四肢伸侧形成,无痛性溃疡，缓慢愈合或出现继发感染。,蟾分枝杆菌：为蟾蜍肉芽肿的病原菌。多引起,老年男性的慢性肺部感染。,总目录,上页,下页,退出,返回,四、迅速生长分枝杆菌,?,在普通培养基上生长速度快，生长温度为,25,-,45,，对人

22、有致病性的是：,偶发分枝杆菌：可引起人局部或肺部感染，对,现有的抗结核药物均有耐药性。,龟分枝杆菌：可引起人的软组织病变及手术后,继发感染，亦可引起肺部感染。,总目录,上页,下页,退出,返回,非结核分枝杆菌检验程序,总目录,上页,下页,退出,返回,第三节,麻风分枝杆菌（,M.leprae,）,一、概述,俗称麻风杆菌，引起,麻风病,，是一种慢性传,染病,流行广泛，主要分布在亚、非和拉丁美洲,总目录,上页,下页,退出,返回,二、生物学性状,?,形态与染色,其大小、形态、染色均与结,核杆菌类似，但菌体略粗,抗酸染色阳性，,呈束状或团,状排列,典型的,胞内寄生菌,。多存在,于细胞内,麻风细胞（有大,量

23、麻风杆菌存在的感染细胞，,呈,泡沫状,）,总目录,上页,下页,退出,返回,?,培养特性,目前体外人工培养,尚未成功,动物模型：,犰狳,，对该菌高度易感，接种后引起瘤型麻,风。人对该菌抵抗力强，接触者仅少数发病,二、生物学性状,总目录,上页,下页,退出,返回,三、致病性,?,所致疾病,麻风病,，是一种,慢性传染病,，主要表现为,皮,肤、粘膜和神经末梢,的损害，晚期可侵犯深,部组织和器官，形成肉芽肿,人类为唯一宿主和唯一传染源，致病因素不,清,总目录,上页,下页,退出,返回,三、致病性,?,所致疾病,传染源,：,病人,（瘤型麻风病人通过皮肤黏膜及外,分泌液向外排菌）。,传播途径,：,皮肤、黏膜、呼

24、吸道及密切接触,潜伏期,：,2-5,年，长者数十年,特点,：潜伏期长，发病慢，病程长的慢性传染病,类型,：瘤型麻风（麻风结节，“狮面容”）,，结,核样型，界线类，未定类,总目录,上页,下页,退出,返回,三、致病性,?,所致疾病,瘤型麻风（麻风结节，“狮面容”）,?,肉芽肿，麻风结节,总目录,上页,下页,退出,返回,总目录,上页,下页,退出,返回,三、致病性,?,所致疾病,结核样型麻风,?,皮肤,边缘清楚的红色斑疹,?,感觉功能障碍,总目录,上页,下页,退出,返回,总目录,上页,下页,退出,返回,麻风杆菌侵犯神经系统,总目录,上页,下页,退出,返回,四、微生物学检查,?,显微镜检查,可从患者鼻粘膜或皮损处取材，用,抗酸性染色,后检查,一般瘤型和界线类患者标本中可找到细菌在细,胞内存在，有,诊断意义,?,PCR,总目录,上页,下页,退出,返回,五、防治原则,?,无特异性预防方法，隔离,?,早期发现、早治疗,?,目前多采用二三种药联合治疗,氨苯砜（,dapsone,，,DDS,）,