结核病的实验室诊断分析课件.ppt

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1、结核病的实验室诊断,主要内容,结核病的流行情况,1,结核病的病原学,3,2,结核病的实验室诊断,3,结核病的分子药敏,3,4,1.,结核病的流行概况,?,全球范围内结核病疫情急剧恶化,?,人口大规模流动,?,结核菌耐药现象益发严重,?,结核病合并艾滋病感染,?,我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国,?,结核菌感染率,44.5%,?,新发活动性结核患者,130,万,/,年,?,死亡,13,万,/,年,2011 WHO tuberculosis control report,我国是全球,27,个耐药结核病高负担国家之一,2013,年世界卫生组织宣布,全球耐多药结核病,紧急状态,全球的结核病患者,

2、在接受治疗,之前已经传染给了别人！,早期快速诊断与治疗成为制,约结核病控制的关键：,有细,菌学诊断依据的病人不超过,50%,当前结核研究的热点,?,新型抗结核药物,(50%),?,新型快速诊断技术,(40%),?,新型结核疫苗,(10%),7/45,近期结核病诊断方法的相关研究,JID 2012:205(Suppl 2),S147.,2.,结核病的病原学,?,结核分枝杆菌,(M.tuberculosis),是引,起人类结核病的主要病原体。,?,1882,年由德国医生,Koch,发现。,?,结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌,纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝,杆菌属。,?,分枝杆菌复合群共包括人型、牛

3、型、,非洲型和田鼠型，而人型结核分枝,杆菌是人类主要的致病菌。,2018/6/17,GDTB,8,结核分枝杆菌,(M.tuberculosis),生物学主要特点：,1.,细胞壁中含有大量,脂质,2.,引起的疾病都呈慢性，,并伴肉芽肿,3.,抗酸染色阳性,生长特点：,生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内,约需要,15,20,小时，在静脉感染未经,免疫小鼠肺中约需要,15,小时，在巨噬,细胞内约需要,15,20,小时，在家兔角,膜中约需要,20,22,小时。,实验室检查方法的历史,1880s,Tubercle bacilli,的发现,Ziehl-Neelsen,染色方法,1900s,Mantoux t

4、est(TST with tuberculin),1920s,Petragnani,medium,Purified Protein Derivative,（,PPD,）,1930s,Lewenstein-Jensen,培养基,1940s,Dubos agar,Ogawa,培养基,1950s,Middlebrook 7H9,1990s,NAAT,2000s,ELISPOT,QuantiFERON,2010s,LPA,GeneXpert,2020s?,3.,结核病的实验室诊断,细菌学,涂片：,敏感性低,传统固体培养：,所需时间长，,23,月,分子生物学,TB-DNA,TB-mRNA,血清,/,免疫

5、学,IGRA,：,有望替代,TST,，但,不能区分,活动性,TB,与潜伏感,染,血清学：,存在抗原,纯度和特,异性差等,方面的问,题,液体培养及药,敏试验：平均,时间,20,天,.,细菌学诊断,萋尼氏染色,荧光染色,罗氏培养,/,药敏试验,我国目前最常用的结核病实验室诊断技术,快培,/,药,敏试验,涂片,?,干燥,?,固定,初染,脱色,复染,显微镜检查,登记,/,报告,显微镜检查,碱性复红,盐酸酒精,亚甲兰,石炭酸金胺,O,盐酸酒精,高锰酸钾,光学显微镜检查,荧光显微镜检查,萋尼氏染色镜下形态,荧光染色镜下形态,LED Fluorescence microscopy,LED,荧光显微镜,LED

6、,荧光显微镜,?,成本低廉的超亮发光二极管,?,可承受的价格，价格接近于现有的光学显微镜,?,寿命长（,15-20,000,小时）,?,省电,?,可用电池供能,?,可靠性更强,?,不需要空调设施,?,不需要暗室,?,诊断性能优于标准荧光显微镜,?,操作人员工作负荷减轻,普通荧,光,显,微,镜和发,光二极管,荧,光,显,微,镜性能比较,（不同实验室的结果进行汇总与平均）,显微镜,方法,灵敏度,(%),特异度,(%),普通荧光显微,镜,直接涂片,67.4,96.1,普通荧光显微,镜,浓集涂片,66.6,99.2,发光二极管,荧,光显微镜,直接涂片,71.6,(p=0.1025),96.4,发光二极

7、管,荧,光显微镜,浓集涂片,72.4,(p=0.0073),98.8,Bactec,?,MGIT 960/320,Bact/Alert 3D,VERSA TREK,生产厂家,美国,BD,公司,法国生物,梅里埃公司,美国,Trek,诊断公司,仪器定位,专业分枝杆菌检测系统,业内金标准,普通细菌血培养系统,需加装分枝杆菌培养特殊组件,普通细菌血培养系统,需加装分枝杆菌培养特殊组件,单机容量,960,个检测位,每年可至少检测,8000,个样本,240,个瓶位,每年可检测,2000,个样本,528,个瓶位,日均标本处理量,2530,个,67,个,9,个,检测原理,荧光增强法,：采用敏感性较,强的荧光信

8、号探测氧气的变,化情况，只需单一反应，所,以速度快，准确性高,PH,值比色法：,当培养瓶内,有微生物生长，其释放出的,CO,2,，经水饱和后，产生,H,+,，,使,PH,值产生变化，感应器的,颜色也随之变化。需双重反,应，因此速度较慢，假阳性,率较高，此技术已趋向淘汰,压力检测：,检测细菌生长中各,种气体产生和消耗而引起的瓶,内压力的变化。灵敏度差。此,技术已趋向淘汰,检测技术,瓶外检测技术,瓶外检测技术,瓶内检测技术,易导致污染及生物安全问题,平均阳性报告时,间,8,11,天,15,21,天,不详,药敏试剂,5,种一线抗,TB,药物，全部具,有,FDA,及,SFDA,认证,无药敏试剂提供,只

9、有,3,种一线药物,培养,/,药敏试验,阴性培养,阳性培养,无或微弱荧光,F,F,FO,2,FO,2,FO,2,FO,2,FO,2,F,FO,2,FO,2,CO,2,O,2,O,2,O,2,O,2,O,2,O,2,O,2,O,2,CO,2,CO,2,O,2,F,F,F,F,FO,2,FO,2,F,F,F,F,CO,2,O,2,O,2,O,2,O,2,O,2,强荧光,传感器,对氧气高度敏感的钌复合物,肉汤,改良,Middlebrook 7H9,肉汤,上部空间,已预先充填,10%CO,2,BACTEC,?,MGIT,?,960/320,指示器系统,MGIT/3D,制造的液体培养基,优点,?,比固体

10、培养快,(,平均,10-12,天,vs.20-24,天,),?,比固体培养基更敏感,?,可以自动判读，或使用标准指示管和操作手册进行判读,?,也加快了药敏试验的速度,局限,?,需要,NALC-NaOH,进行痰处理和离心,?,普通菌群的,污染,很常见,?,比固体培养更经常地检出非结核分枝杆菌（常常不致病）,?,确定诊断前必须对所有的阳性培养物进行结核分枝杆菌的,鉴定,?,比固体培养基昂贵,血清学诊断,血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。,?,无需活细胞培养和特殊仪器设备,?,操作简便,?,结果显示快速,目前用于血清学诊断的主要方法,:,?,酶联免疫吸附试验,(ELlSA),?

11、,斑点金免疫渗滤法,(DIGFA),?,免疫印迹法,(Western Blotting),等等,WHO,对来自不同国家的,19,种试剂盒产品进行评估，结果表明：,与痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为,1%60%,，特异度为,5399%,1,。,原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不,同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。,WHO,认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一,步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用。,1,WHO World Health Organization.Diagnosis evaluation series No.2:labo

12、ratory-based,evalution of 19 commercially available rapid diagnostic tests for tuberculosis.2008.,WHO,对结核抗体评估,2011,年,WHO,正式公告：,由于目前的商业血清学试剂在结核检,测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，,因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验,1,。,1,WHO Commercial Serodiagnostic Tests for Diagnosis of Tuberculosis.,http:/whqlibdoc.who.int/publica

13、tions/2011/9789241502054_eng.pdf,不能早期诊断！容易漏诊、误诊！,血清学检测的评价,?,结核感染者体内存在特异的效应,T,淋巴细胞，效应,T,淋巴细胞再次,受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（,IFN-,）。因此，检,测效应,T,淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。,?,由于效应,T,细胞,存活时间很短,，而且,具有特异性,，因此可以作为,机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。,?,基于,IGRA,原理的产品目前已被,美国、加拿大、英国、德国、意,大利、瑞士、法国、荷兰、日本,等二十余个国家写入本国的结核,诊疗指南中。,?,目前应用的进口,I

14、GRA,主要有两种商品化的试剂：,1,）澳大利亚,Cellestis,公司的,Quanti FERON-TB GOLD In Tube,（,QFT-GIT,）,2,）英国,Oxford Immunotec,公司的,T-SPOT.TB,蛋白水平分子诊断,:,-,干扰素释放实验（,IGRA),-,干扰素释放实验（,IGRA,）,干扰素,检测阴性,干扰素,检测阳性,TB,抗原多肽,T,细胞,活化,T,细胞,干扰素,T-SPOT,?,.,TB,原理,T-SPOT,?,.,TB,是以拥有专利的特异抗原（,ESAT-6/CFP-10,），,通过酶联免疫斑点技术（,ELISPOT,）检测受试者体内是否存,在

15、结核效应,T,淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核,杆菌（现症感染）的新方法。,结核杆菌特异抗原：,?,早期分泌抗原靶,6,（,Early Secreted Antigenic Rarget 6,，,ESAT-6,）,?,培养滤液蛋白,10,（,Culture Filtrate Protein 10,，,CFP 10,）,结核杆菌特异抗原,?,由结核杆菌基因组,RD1,区相同的操纵子编码的,蛋白,?,所有的卡介苗（,BCG,）,均丢失该基因序列,?,绝大多数的环境分枝杆,菌也不存在,RD1,区,ESAT-6,与,CFP-10,抗原,结核杆菌特异抗原,苏氏,海,堪萨斯,戈登,牛,非洲,T-

16、SPOT,?,.,TB,临床性能指标,?,特异性,只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆,菌和卡介苗（,BCG,）无交叉反应,美国,FDA,数据：特异性,97.1%(297/306),国内临床数据：特异性,94.1%(478/508),?,灵敏度,基本不受免疫力低下,/,受抑制影响，在肺外结核患者中有很,高的检出率,美国,FDA,数据：灵敏度,95.6%(175/183),国内临床数据：灵敏度,95.3%(624/655),灵,敏,度,Reference,Sensitivity,Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53,100.0%(12/12)

17、,Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*,83.3%(20/24),Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*,96.6%(84/87),Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*,91.3%(21/23),Meier et al EJCMID 2005 24;529-536,95.9%(70/73),Kang et al Chest.2007 Sep;132(3):959-65*,92.2%(59/64),Janssens et al ERJ 2007 30(

18、4):722-8,98.3%(57/58),Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44.,90.0%(27/30),Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8*,92.9%(26/28),Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-703,92.9%(26/28),Soysal et al IJTLD 2008 12(1):50-56*,80.8%(80/99),Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71*,85.7

19、%(36/42),Chee et al J Clin Microbiol.2008 Apr 9*,94.1%(254/270),Vincenti et al Clin Exp Immunol.2007 Oct;150(1):91-8*,84.6%(11/13),Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-8,87.2%(34/39),Losi et al Eur Respir J.2007 Dec;30(6):1173-9,100.0%(10/10),Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259,100.0%

20、(22/22),Connell et al PLoS ONE 2008.3;7:e2624*,100.0%(9/9),Kobashi et al.Scand J Infect Dis 2008.40;8:629-34*,87.5%(42/48),Kobashi et al.J Infect.2008 Epub ahead of print.*,90.0%(36/40),Dom,nguez et al.Diagn Microbiol Infect Dis.2008.*Epub ahead of print,84.2%(32/38),Goletti et al.PLoS ONE.2008.3;10

21、:e3417.*,89.9%(62/69),Bosshard et al.Respir Med.2008.Epub ahead of print,98.4%(62/63),Higuchi Med Microbiol Immunol.2008.Epub ahead of print*,95.9%(47/49),TOTAL,92.0%(1139/1238),特,异,性,All Studies of Specificity in Subjects in Low Endemicity Settings,n,Specificity(100-A)%,n,Specificity(100-A)%,Lalvan

22、i et al,Am J Respir Crit Care Med 2001;163:824-28,?,26,100.0%,Lalvani et al,J Infect Dis 2001 183;3:469-7,?,40,100.0%,Pathan et al,J Immunol 2001;167:5217-5225,?,32,100.0%,Chapman et al,AIDS 2002 16;2285-93,?,40,100.0%,Adams et al,Scand J Infect Dis.2008;40(3):196-203.,18,100.0%,Bocchino et al,Eur J

23、 Clin Mircro Infect Dis(2008),May 10*,49,89.8%,50,84.0%,Detjen et al,Clin Infect Dis 2007 Aug 1;45(3):322-8*,40,97.5%,40,57.5%,Barsegian et al,J Hosp Inf(2008),epub ahead of print,95,98.9%,95,66.3%,Clark et al,Clin 150(2):238-44,47,100.0%,Dheda et al AIDS 2005 19;2038-41,18,100.0%,Meier et al EJCMID

24、 2005 24;529-536,11,100.0%,11,100.0%,Total:T-SPOT,.TB,vs.TST head:head studies only,195,96.4%,196,70.9%,p,value 0.0001,Total:T-SPOT.,TB,only,416,98.3%,T-SPOT.,TB,TST,T-SPOT,?,.TB,的实验步骤,用,BD CPT,管或,Ficoll,提取液收集外周,血单个核细胞,结核特异抗原（,ESAT-6/CFP 10,）刺激,结核特异的效应,T,淋巴细胞使其分泌,-,干扰素,效应,T,淋巴细胞分泌的,-,干扰素,与膜板预包被的抗,-,

25、干扰素抗体,结合并固定在细胞周围,1,个斑点,=1,个效应,T,细胞,加入显色液，观察结果,过夜孵育，洗板，加入酶标二抗,阴性结果,阳性结果,空白对照,抗原,A,ESAT-6,抗原,B,CFP10,阳性对照,（,PHA,）,实,验,效,果,图,方法学的优点,?,检测特异性的提高,帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“,假阳性”，避免了临床的无效用药,?,检测灵敏度的提高,有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的,传播与扩散,?,快速,48,小时出结果,方法学的局限,?,不能区分活动性,TB,与潜伏感染,?,不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临,床的判断,?,目前还不能够根

26、据斑点数量的多少来判断患者,是活动性结核病或是潜伏感染者,?,检测收费高（,800,元,/,次）,实验结果的解释,?,阴性结果,提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应,T,细胞。假阴性结,果：,感染阶段不同；少数免疫系统功能不全,/,疾病；实验非正,常操作。,?,阳性结果,提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应,T,细胞，患者存在结,核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测,指标综合判断。假阳性结果：,4,种环境分枝杆菌感染时：,M.kansasii,（堪萨斯）、,M.szulgai,（苏氏）、,M.marinum,（海）、,M.gordonae,（戈登）,各国对潜伏感染风险人

27、群的筛查指南,风险人群,美国指南,加拿大指南,英国指南,免疫力抑制人群（例如，,HIV,感染者，使用强的松,或,TNF-,抑制剂治疗）,TST,或,IGRA,；如果是阴性,或高度怀疑的，,TST,和,IGRA,都要检查,TST,，如果,TST,阴性要用,IGRA,确认,TST,或,IGRA,BCG,接种者（如果也属于,其它风险人群）,推荐用,IGRA,没有特定的推荐,TST,或,IGRA,与传染性肺结核患者密切,接触,TST,或,IGRA,TST,，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性,TST,，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性,医务工作者,TST,或,IGRA,推荐用,TST,TST

28、,或,IGRA,，视情况而定,无法再来确认,TST,结果的,人群（例如，流浪汉，注,射吸毒者或交通不方便）,推荐用,IGRA,没有特定的推荐,推荐用,IGRA,国外出生的人群,只筛查过去,5,年内移民的,人群；,TST,或者,IGRA,只筛查过去,2,年内小于,15,岁的移民；,TST,，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性,只筛查新移民；,TST,筛查,5,至,15,岁移民，用,IGRA,进,一步确认,TST,阳性；,IGRA,筛查,16,至,35,岁移民,其它风险人群,TST,或,IGRA,TST,，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性,TST,，用,IGRA,进一步确认,TST,阳性

29、,样本量为,26 680,调查者的,15,个多中心研究显示,在,4,年的随访中,IGRA-,阳,性的个体中发病数为,448,例,/1000,人,/,每年,.,2011,年,9,月的研究结果提示，,IGRA-,阴性对于儿童（小于,5,岁）不能排除结核病,(,Pediatr.,Infect.Dis.J.,30,817,818,2011).,Childhood tuberculosis treatment remains imprecise scienceNature,MedicineVolume:17,Page:116011 October 2011.,TB-DNA,检测：,1.,能稳定检测,10

30、copy,的,TB-DNA,，灵敏度高,，特异性强。,2.,早期、快速、准确地诊断结核病。,痰液、肺及支气管灌洗液,肺结核,血液,播散性结核和各脏器的结核病,脑脊液,中枢神经系统结核病,宫颈拭子、尿道拭子,泌尿生殖道结核病,3.,荧光定量,PCR,检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。,4.TB-DNA,浓度可用于判断疗效：,痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势,，,TB-DNA,拷贝数下降。根据病原,体,DNA,浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据,。,分子生物学诊断,Real-time PCR,环介导等温扩增法,(LAMP),的技术特点是针对靶基因的,6,个,区域设计

31、,4,条特异引物，利用一种链置换,DNA,聚合酶在等温,条件,(63-65,),下保温,30,60,分钟，,即可完成核酸扩增反应。与常规,PCR,相比，不需要模,板的热变性、温,度循环、电泳及,紫外观察等过程，,具有简单、快速、,特异性强的特点。,环介导恒温扩增（,LAMP,）技术,2,小时全过程,目测法检测流程,检测方法说明,结果判断,在阴性对照反应管液体颜色呈橙色，阳性对照反应管液体颜色呈,绿色的条件下：,?,若待检样本反应管中液体颜色呈绿色，则可报告该样本检测结果为,结核分枝杆菌阳性；,?,若待检样本反应管中液体颜色呈橙色，则可报告该样本检测结果为,结核分枝杆菌阴性；,?,若阴阳性对照反

32、应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，,应重新检测。,RNA,作为临床分子诊断靶标的优点：,?,RNA,拷贝数,DNA,拷贝数,?,更具临床意义,:,生命力旺盛的病原体,RNA,转录活跃,?,RNA,远不如,DNA,稳定,?,病原体死亡，,RNA,很快降解,1.,交叉污染少,2.,较好的愈后指标,结核杆菌,RNA(TB-RNA),SAT,技术原理,操作过程,4.,结核病的分子药敏,HAIN,技术,DNA?STRIP,?,T-spot,-Xpert MTB/RIF,DNA,微阵芯片,探针熔解曲线技术,药物,药物作用机制,参与基因,编,码,酶,作,用,突变频率（,%,）,INH,氧自由基对,

33、DNA,，脂质等多效,应,Kat G,触酶,-,过氧化物酶,活化原药,4258,INH,对,NADH,竞争性,INH-NADH,加成物抑制分支菌,酸合成,代偿,katG,功能,inhA,kasA,ahpC,ndh,nat,glf,烯酰基载体蛋白还原酶,酮酰基蛋白合成酶,烷基氢过氧化物酶,NADH,脱氢酶,芳香胺乙酰转移酶,吡喃半乳糖变位酶,分支菌酸代谢靶酶,靶酶？,靶酶？,NAD+,减少,乙酰化失活,INH,靶酶？,2134,1015,耐药标记物,RFP,抑制信使,RNA,转录,rpoB,RNA,多聚酶,靶酶,96100,PZA,酸化胞浆，失活酶活性,抑制脂肪酸代谢？,替代烟酰胺掺入,NAD,

34、抑制膜转运功能,pncA,FasI,吡嗪酰胺酶,Fas I,？,活化原药,靶酶？,7297,EMB,阿拉伯半乳聚糖合成抑制,阿拉伯呋喃糖累积,脂阿拉伯甘露聚糖合成抑制,embCAB,embB,阿糖转移酶,靶酶,4765,SM,肽链翻译错误,rpsL,rrs,核糖体,30S,亚基,S12,蛋白,核糖体,16SrRNA,靶位,靶位,5259,821,AK/KM,OFx,肽链翻译错误,抑制,DNA,回旋酶,rrs,gyrA,核糖体,16SrRNA,DNA,回旋酶,A,亚基,靶位,靶酶,7594,Cs,抑制肽聚糖合成,ulrA/dadB,D-,丙氨酸合成酶,靶酶,原理：,采用线性探针技术（,LiPA,

35、），,扩增后的产物与预先固化在,膜上的特异性探针杂交，通,过显色反应判断结果。,检测标本：,?,涂阳痰标本,/TB-DNA,阳性,标本,?,固体或液体培养菌株,Hain,技术,GT-Blot 48,自动杂交仪,1,台,所需设备：,GTQ PCR,96,扩增仪,1,台,Mikro 220,离心机,1,台,恒温器,1,台,超声波振荡仪,1,台,TARGET,靶基因,菌种鉴定,16SrRNA IS6110,异烟肼,katG,、,inhA,、,ahpC,、,oxyR,、,KasA,、,ndh,利福平,rpoB,乙胺丁醇,embB,吡嗪酰胺,pncA,链霉素,rpsL,、,rrs,喹诺酮类药物,gyrA

36、,、,gyrB,MTBDRplus,方法,?,原理：,PCR,扩增检测,rpo,B,、,katG,和,inhA,基,因突变位点，诊断,RFP,和,INH,耐药。,rpoB,野生型探针,:WT1-WT8,rpoB,耐药突变探针,:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L,通过缺失的野生型信号进行突变探测,通过出现的突变信号进行突变探测,MTBDRplus,rpoB,511,513,516,518,522,526,531,533,rpoB,WT2,rpoB,WT4,rpoB,WT6,rpoB,WT8,rpoB,WT7,rpoB,M,UT1(D516V),rpoB,MUT3(S5

37、31L),rpoB,M,UT2A(H526Y),rpoB,M,UT2B(H526D),514,515,rpoB,WT1,rpoB,WT3,rpoB,WT5,509,508,505,MTBDRplus,操作流程,1),DNA,提取,用,NALC/NaOH,处理痰标本,2)PCR,扩增,3),杂交,扩增产物和固化在,膜上的特异性探针杂交,4),结果判读,MTBDRplus,反应条带,(,示范,),Bandelette MTBDR,?,(Hain Lifescience,),鉴定结核菌,利福平,rpoB,INH,katG,315,药物,GenoType MTBDRplus,结果,比例法药敏结果,耐药

38、,敏感,INH,耐药,45,0,敏感,7,16,灵敏度：,86.5%(45/52),特异度：,100%(16/16),符合率：,89.7%(61/68),菌株标本,GenoType MTBDRplus,方法与比例法药,敏试验结果比较,药物,GenoType,MTBDRplus,结果,比例法药敏结果,耐药,敏感,RFP,耐药,48,0,敏感,1,16,灵敏度：,98.0%(48/49),特异度：,100%(16/16),符合率：,98.5%(64/65),菌株标本,GenoType MTBDRplus,方法与比例法药,敏试验结果比较,痰标本（涂片阳性）,GenoType MTBDRplus,方,

39、法与比例法药敏试验结果比较,药物,GenoType MTB,DRplus,结果,比例法药敏结果,耐药,敏感,INH,耐药,63,0,敏感,1,129,灵敏度：,98.4%(63/64),特异度：,100%(129/129),符合率：,99.5%(192/193),痰标本（涂片阳性）,GenoType MTBDRplus,方法与比例法药敏试验结果比较,药物,GenoType MTBDR,plus,结果,比例法药敏结果,耐药,敏感,RFP,耐药,39,12,敏感,2,140,灵敏度：,95.1%(39/41),特异度：,92.1%(140/152),符合率：,92.7%(179/193),优点：,

40、?,Hain,技术可以快速检测,RFP,和,INH,的耐药,?,时间短、操作简单、安全高,?,特异性和灵敏度较高、重复性好,?,主观因素影响小、更为可靠,缺点,:,?,需要专门设备；,?,未发现所有的耐药突变位点，不能检测所有药,物的耐药基因型；,?,MTBDR plus,试剂盒的检测试纸条，缺少,ahpC-oxyR,间隔序列范围，否则可进一步提高,INH,耐药检测的敏感性；,?,不能取代传统细菌学检测、只能作为参考。,?,进行标本处理、实时,PCR,和利福平耐药性检测的完整平台,?,此平台由,FIND,和,Cepheid,（一个加州公司）所开发,?,痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂

41、进行混合,处理,?,GeneXpert,设备可进行标本液化、去污染、富集、,DNA,提,取、,rpoB,实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变,?,该系统非常容易使用，不需要进行分子生物学培训,?,该检测方法另外一个特点是操作完全自动化，使用起来既,容易又安全。,.Xpert MTB/RIF,?,设计五个重叠的分子信标，检测,81,碱基,rpoB,核心区域所,有可能的突变,?,用不同的荧光基团标记每个分子信标，使仅在一个反应中,完成整个检测成为可能,?,探针能检测野生型菌株（,RIF-,敏感人群）；,ropB,突变造,成特定信标的信号丢失,（,RIF-,耐受人群）,?,每个探针必须：能检测野

42、生型菌株；不能检测,Rif,耐药突,变菌株，不能检测出非,TB,分枝杆菌,.,Xpert MTB/RIF,的引物设计,Xpert MTB/RIF,Xpert MTB/RIF,与,Hain,的比较,：,?,只能做,TB-DNA,和利福平耐药基因；,?,只能通过,8,个缺失的野生型信号进行突变检测，不,能探检测出现的突变信号；,?,样本通量少,(4,个,/,次）；,?,所需样本量大（,1mL/,次）；,?,仪器断电后只能重新开始；,Hain,有记忆功能。,?,维护：刚进入中国市场，故障后只能返厂修理，,费用昂贵。,.DNA,微阵芯片,?,基本原理：与,Southern,、,Northern,是一致

43、的，都是应用,已知核酸序列,作为,探针,固,定在玻璃等基片上，然后,与待测样品的,DNA,或,RNA,互补,的靶核苷酸序列杂交，从,而获得待测样品的信息,基因芯片的检测过程,结核耐药快速检测基因芯片,73,?,结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（,DNA,微阵列芯片法）,基于,rpo,B/,kat,G/,inh,A,的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核分枝杆菌多药耐药,（利福平、异烟肼）,?,通,量：,两种一线抗结核药物,、,8,个突变位点,?,速,度：,6,小时,versus,传统,48,周,?,灵敏度：,10,3,CFU/,反应,?,特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读,利福平耐药

44、,利福平敏感,结核耐药检测基因芯片,软件判读,激光共焦扫描仪,样品制备仪,杂交仪,发表文章：,The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease.,2009,13(7):914,920.,发明专利：申请号：,200810105172.X,。授权公告号：,CN 101285062 B,。,1.,晶芯,?,分枝杆菌核酸检测试剂盒,2.,晶芯,?,十七种分枝杆菌菌种鉴定试剂盒,3.,晶芯,?,分枝杆菌耐药检测试剂盒,4.,晶芯,?,九项遗传性耳聋基因检测试剂盒,DNA,微阵芯片,.,探针熔解曲线技术,检测结果判断,Sputum,涂片,培养,孵育,8,周,（阳性）,药敏试验,观察,孵,育,4,周观察生长情况,涂片,/,TB-DNA/,TB-RNA,（阳性）,分子诊断,/,药敏技术,液体培养及药敏试验,平均时间,2-3,个月,平均时间,20,天,只需,1-2,天,小,结,感,谢,聆,听！,