转基因食品及PCR检测转基因食品-管理平台课件.ppt

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1、第四章 转基因食品及PCR检测,转基因食品（genetically modified foods,GMF)是由细胞DNA中经非生殖方法插入了特定外源基因或基因片段，并获得某种良好性状的动物、植物或微生物制成的食品。例如抗虫害、抗病毒、抗杂草的转基因玉米、黄豆、油菜、土豆、西葫芦等。,3.1 转基因产品的种植情况,转基因作物自1996年进行商业化种植以来，全球转基因作物种植面积持续增长。截至2004年，在八年间增加了将近40倍左右。已批准商品化转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、亚麻、烟草、西瓜等。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有近万种。,目

2、前，转基因作物主要集中种植在工业化国家。1999-2003年，美国、阿根廷、加拿大和中国这四个国家种植了全球99的转基因作物。全球种植的转基因作物主要是大豆、玉米、棉花和油菜。目前，国际上进行实验室研究和田间实验的转基因作物种类较多，但批准商业化种植的转基因作物种类却只有几十种。,目前我国正式批准投入商业种植的转基因作物只有两种：一是具有自主知识产权的抗虫棉，另一个是延迟成熟的番茄，其中抗虫棉的种植面积2003年已累计达到4000万亩，而番茄则还处于小范围种植阶段，仅10000亩。进口的转基因食品局限在大豆、玉米、油菜等领域。我国进口的大豆中，70%是转基因大豆，在我国市场上70%的含有大豆成

3、分的食物中都有转基因成分，像大豆油、色拉油、磷脂、酱油、膨化食品等等。,美国市场上的转基因食品：在美国，转基因食品已进入寻常百姓的餐桌,转基因大豆也已用于制作数百种食品，其中包括食物油、糖果和人造黄油。超过70%的食品含有转基因成分，像饮料、糖果、糕点、冰激凌等，有3/4的奶酪是转基因奶酪。近年来，美国的转基因作物品种越来越多，如转基因玉米约占美国玉米种植面积的一半。,3.2 转基因食品的种类,3.2.1 植物性转基因食品 目前全球种植的转基因作物可分为以下三类：1、抗除草剂转基因作物：2000 年全球种植抗除草剂转基因作物的面积达到3，270万公顷，占总转基因植种植面积的72%，其中主要为抗

4、除草剂大豆。举例：Roundup Ready soybean(RR大豆)，乃美国孟山都公司Roundup除草剂。,2、抗虫转基因作物：2000年全球种植抗虫转基因作物的面积达到830万公顷，占总转基因植物种植面积的19%，其中以抗虫玉米为主。举例：BT玉米，抵抗三种毒素：Cry1Ab、Cry1Ac、Cry9c。3、其他转基因作物：改善产品的品质；增强抵抗病毒病、真菌病及细菌病的能力。,3.2.2 动物性转基因食品 比如，牛体内转入了人的基因，牛长大后产生的牛乳中含有基因药物，提取后可用于人类病症的治疗。在猪的基因组中转入人的生长素基因，猪的生长速度增加了一倍，猪肉质量大大提高，现在这样的猪肉已

5、在澳大利亚被请上了餐桌。,3.2.3 转基因微生物食品 微生物是转基因最常用的转化材料，所以，转基因微生物比较容易培育，应用也最广泛。例如，生产奶酪的凝乳酶，以往只能从杀死的小牛的胃中才能取出，现在利用转基因微生物已能够使凝乳酶在体外大量产生，避免了小牛的无辜死亡，也降低了生产成本。,3.2.4 转基因特殊食品 科学家利用生物遗传工程，将普通的蔬菜、水果、粮食等农作物，变成能预防疾病的神奇的“疫苗食品”。科学家培育出了一种能预防霍乱的苜蓿植物。用这种苜蓿来喂小白鼠，能使小白鼠的抗病能力大大增强。而且这种霍乱抗原，能经受胃酸的腐蚀而不被破坏，并能激发人体对霍乱的免疫能力。于是，越来越多的抗病基因

6、正在被转入植物，使人们在品尝鲜果美味的同时，达到防病的目的。,转基因棉花,中国的转基因羊,日本研发的转基因大豆,各种各样的转基因水果,浙江省种植的转基因油菜,3.3 转基因食品的安全性问题,美国宣称转基因食品与传统食品一样，是安全的，对人体无害，迄今没有报告表明转基因农产品给人体健康造成了危害。欧盟等国家认为转基因食品应用于生产和消费的时间尚短，食品的安全性和可靠性都有待于进一步的研究和证明，转基因食品可能会导致一些遗传学或营养成分的非预期改变，可能会对人类健康产生危害。,3.3.1 转基因产品对人体健康可能产生的影响,该类食品携带的抗生素基因有可能使动物与人的肠道病原微生物产生耐药性，这是人

7、们最关心的问题。抗虫农作物体内的蛋白酶抑制剂和残留的抗虫内毒素，可能对人体健康有害。有人认为，抗虫农作物体内的蛋白酶抑制剂和抗虫内毒素，既然能使咬食其叶片的昆虫的消化系统功能收到损害，那么谁又能担保其叶片、果实、种子不会对人畜产生类似的伤害呢？,随着基因改造的抗除草剂农作物的推广，可能导致除草剂的用量增加，从而导致除草剂在食品种残留量加大。转基因作物中病毒基因有可能与浸染该植物的其他病毒进行重组，产生新病毒或超级病毒。转基因生物作为食品进入人体，可能使人出现某些毒理作用和过敏反应，国外已有儿童饮用转基因大豆豆浆产生过敏反应的报道。,3.3.2 转基因产品对环境生态可能产生的影响,转基因作物本身

8、可能转变成杂草。如果转入的抗性基因逃逸到其他作物上，也会使这些作物的野生近缘种并成杂草；如果转基因高产作物一旦通过花粉导入方式将高产基因传给周围杂草，会引发超级杂草出现，对天然森林造成基因污染和对这些地区的其他作物带来不可预见的后果。,如果转基因不育品种的不育基因在种植地大肆传播，会导致当地农业崩溃。抗虫、抗病和抗除草剂类转基因植物，除对害虫产生毒害而使其死亡外，对环境中的许多有益生物也产生直接或间接的影响，甚至使其死亡。如果用于食品的植物通过基因改良成为要用植物，那么通过异花授粉会使食用的植物产生药性，从而污染人类的食品供应。,基于转基因食品潜在安全的不确定性，世界各国政府都加强对转基因食品

9、进行管理。主要原则是：一、执行严格的安全评价制度；二、标识制度，即在转基因食品包装上加贴标识。目前我国转基因食品法规主要为农业转基因生物标识管理办法，2002年3月20日起实施，规定对转基因产品实施标识制度。第一批标识管理的转基因生物目录是：大豆种子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕、玉米种子、玉米、玉米油、玉米粉、油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕、棉花种子、番茄种子、鲜番茄、番茄酱。,3.4 DNA提取,转基因产品检测的第一步是提取样品中的DNA。植物细胞中DNA主要存在于细胞核内，细胞质中的DNA主要存在于线粒体和叶绿体中。细胞内各种DNA总称为总DNA。进行转基因检测需要提取的是总DNA。

10、,提取DNA的质量关键在于DNA分子的平均长度、化学纯度和DNA结构的完整性。DNA提取的基本原理是：从样品中释放DNA和纯化DNA。为了得到高质量的DNA，必须去除：蛋白质如用蛋白酶或有机试剂去除；多糖（如果胶、纤维素、半纤维素、淀粉和增稠剂等），以酶（果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶等）方法或有机溶剂（CTAB/氯仿等）去除；脂类，以酶法或溶剂（如正己烷）去除；RNA，用RNA酶去除；盐类（提取/裂解缓冲液或沉淀液的残留物）。,DNA的纯化采用不同方式，主要有沉淀法和固体介质吸附法。沉淀法是用试剂乙醇和异丙醇等沉淀浓缩DNA，在DNA沉淀过程中可使用DNA共沉淀剂如糖原、PEG或tRN

11、A以提高DNA的得率。固体介质吸附法是指采用阴离子交换树脂、硅石或玻璃珠、硅藻土、膜等吸附DNA。提取DNA时，可同时采取几种纯化方法。关于植物总DNA的提取方法有很多，如苯酚氯仿法、CTAB法、SDS法、二氧化硅法和胍盐等方法。,3.4.1 苯酚氯仿法,本方法是常用的DNA提取方法。苯酚能破坏细胞和核酸酶。氯仿使蛋白质变性并有助于液相和水相的分离。苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）的效果更好，异戊醇能消除抽提过程中出现的泡沫。苯酚：氯仿将蛋白质、多糖和核酸酶等从含有DNA的水相中去除，再用氯仿抽提去除苯酚，最后用乙醇沉淀浓缩DNA，去除盐类和残余氯仿。本方法的关键步骤是裂解，在细胞裂解时，

12、最好是在SDS和高EDTA浓度的溶液中热裂解。,3.4.2 SDS法,本方法侧重于细胞的裂解和DNA的释放。高浓度的SDS在较高温度（55-65）条件下裂解细胞，使染色体解析，蛋白质变性，释放出核酸。然后采用高盐浓度（如5mol/LKAc）及降低温度（置于冰上保温），使蛋白质和多糖等杂质沉淀，离心去除沉淀，上清液中的DNA反复用酚/氯仿抽提，最后用乙醇沉淀水相中的DNA。,对于富含蛋白质的材料常加蛋白酶K来除去蛋白质，对于富含多酚类物质的样品，如马铃薯、西红柿等，一般加入6的PVP（聚乙烯吡咯烷酮），PVP可与多酚类物质结合形成复合物，经离心可被除去。该法操作简单，条件温和，但所提取的DNA溶

13、液中糖类杂质较多。多糖含量高的样品不宜采用此方法。,3.4.3 CTAB法,本方法是转基因成分检测常用的方法。CTAB是一种去污剂，能溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液（0.7mol/LNaCl）中是可溶的，但当NaCl浓度降低到0.3mol/L时，会从溶液中析出。通过离心可将复合物同蛋白质、多糖类物质分开。然后将复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀。CTAB与核酸的复合物发生沉淀时，多糖、色素、多酚类物质不发生沉淀，所得到的DNA为乳白色或灰白色。此法最大的优点是通过高盐溶液的选择性沉淀能很好的去除糖类和酚类等杂质，所以提取含糖类和酚类含量较高的样品可优先采用此方

14、法。,3.4.4 二氧化硅法,本方法是一个专利方法，操作简单，适用于大多数物质的DNA提取，侧重于DNA纯化。本方法不适合于高脂物质DNA的提取。首先以裂解液裂解细胞，常用SDS和高EDTA溶液热裂解。在盐酸胍溶液中用二氧化硅树脂纯化DNA，DNA吸附在树脂上，再用异丙醇将污染物质从树脂上去除，最后用低盐缓冲液洗脱溶解DNA。,3.4.5 试剂盒法,在日常检验中一般采用DNA提取试剂盒来提取样品的DNA。DNA提取试剂盒的步骤是：首先裂解细胞，再抽提去除蛋白质等污染物质，纯化DNA，最后去除盐分溶解DNA，也是上述集中方法的结合。提取样品的DNA时，每个样品必须设置两个提取平行样和一个提取空白

15、对照（水代替样品）。,3.5 转基因食品检测,转基因食品检测主要采用普通定性PCR、多重PCR、基因芯片和ELISA方法。,3.5.1 PCR技术介绍,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是1985年由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的K.B.Mullis等发明的一种体外核酸扩增技术，又称为无细胞分子克隆系统。1993年K.B.Mullis获诺贝尔化学奖。它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。,3.5.1.1 PCR技术的原理PCR技术类似于DNA的天然复制过程。在适宜的条件下，人工合成寡核苷酸引物与模板DNA单链互补结合，在

16、DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸(dNTP)为底物，不断延伸，使被扩增的基因片断以几何倍数增长。,PCR过程包括变性退火延伸三个基本反应步骤：模板DNA的变性：加热至93-95，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA离解成为单链；模板DNA与引物的退火（复性）：温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，合成一条与模板DNA链互补的半保留复制链。重复变性退火延伸三个过程，目的基因被扩增放大几百万倍。每个循环需2-4min，整个PCR反应需要2-3h。,PCR扩增遵循酶促反应动力学原理：反应初期靶序列DN

17、A片断呈指数形式增加；随着PCR产物的逐渐积累、原料的消耗、酶活性的降低，酶的促化反应趋于饱和，扩增的DNA片断增加缓慢，进入所谓的平台期。,3.5.1.2 PCR反应的主要因素,模板、引物、酶、dNTP和Mg2+是PCR反应的五个重要因素，决定了PCR反应的成败。模板DNA：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。抽提的DNA溶液中含有氯仿、乙醇等有机溶剂、Taq酶抑制剂和杂蛋白等会影响PCR扩增，产生假阴性。,引物：PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度，引物的设计和合成对PCR结果起着决定性作用。设计引物应遵循以下原则：引物长度：15-30bp，不能过长，引物

18、过长导致延伸温度过高，不适于Taq酶促反应。退火温度：60左右。引物碱基：G+C含量以40-60为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布。避免引物内部出现二级结构。避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。,引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。引物设计多采用计算机软件，例如Permier Primer、Oligo等。在软件的基础上辅以人工分析，以达到最佳效果。PCR反应中引物浓度也影响PCR扩增

19、效果。引物浓度低，PCR扩增量低，会出现假阴性现象；浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。,Taq DNA聚合酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性聚合酶，其活力的高低决定了PCR扩增是否成功。此酶的最适温度很高（79），使引物在高温下进行退火和延伸，增加了反应的特异性和扩增效率。酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,dNTP dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。在PCR反应中，4种dNTP的浓度要相等，反应浓度为200umol/L左右，浓度过低会降低PCR产物的产量；浓度过高会导致错配。Mg2+浓度 Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所

20、必需的，直接影响着酶的活性和可靠性。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5-2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。DNA模板、引物和dNTP可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。,3.5.1.3 PCR热循环条件,PCR退火温度是影响PCR特异性的重要因素。变性后温度快速冷却至50-65，引物和模板结合。退火温度与时间的设置，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度和靶序列的长度。循环次数决定PCR扩增产量。在其他参数优化的条件下，循环次数主要取决于模板DNA

21、的初始浓度。一般的循环次数在30-40之间，循环次数过多会增加非特异性扩增产物量。,3.5.1.4 PCR扩增产物分析,对PCR扩增产物的检测和分析有许多方法，如凝胶电泳、Southern杂交和PCR-ELISA等方法，最常用的是琼脂糖凝胶电泳。通常应用1-2的琼脂糖凝胶，经溴化乙锭染色，通过凝胶成像系统，初步判断产物的特异性，PCR产物片段的大小应与预计的一致。对PCR产物的鉴定通常采用限制性内切酶酶切反应和核酸序列分析等方法。,3.5.1.5 PCR检测常见问题,在进行PCR检测时，常见的问题是假阳性和假阴性现象。假阳性 由于PCR的高灵敏性，极微量的目标DNA污染都有可能出现扩增条带。因

22、此要防止污染，尤其是DNA抽提中的样品交叉污染、PCR试剂污染和PCR产物的污染。,引物设计不合适也会出现假阳性现象。选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性，需要重新设计引物。,假阴性产生假阴性的原因主要有DNA模板、酶、试剂、引物用量低或含有抑制剂和循环参数不正确等。在PCR实验中设置阳性对照、阴性对照和空白对照。引起假阴性现象的可能原因：模板中含有杂蛋白质，Taq酶抑制剂，酚、氯仿、乙醇等有机溶剂或DNA量不足，Taq酶失活、酶活降低或量不足，引物设计不合理，变性温度低，变性时间短，退火温度不

23、适合等等。,PCR常见的问题还有非特异性扩增和涂抹带或片状带或地毯样带（Smear现象）。非特异性扩增：引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体，Mg2+浓度过高、退火温度过低或PCR循环次数过多，酶质量较差，或酶量过多等。Smear现象：酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低等。,3.5.2 实时荧光定量PCR,原理实时荧光定量PCR不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且比常规PCR相比，它具有特异性更强、自动化程度高、不使用溴化乙锭、不污染环境等特点，目前已得到广泛应用。实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个

24、PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR所使用的化学物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。,TaqMan荧光探针PCR扩增时，加入一对引物，同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记了一个报告荧光基团和一个猝灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被猝灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,SYBR荧光染料在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料

25、，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，双链越多，嵌入的SYBR染料越多；而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。用SYBR染料比较方便而且成本低，但在模板浓度较低时，引物二聚体作用影响较大。目前主要采用的还是TaqMan荧光探针。,3.5.3 基因芯片,DNA芯片，又称DNA微集阵列，因为在微集阵列的制备过程中采用了硅芯片，所以称为DNA芯片或基因芯片。DNA芯片技术起源于核酸分子杂交，于20世纪80年代提出，90年代初期迅速发展。,检测原理 DNA芯片是指应用大规模集成电路的微阵列技术，在固相支持物如硅、尼龙膜

26、表面，有规律地合成数万个代表不同基因的寡核苷酸“探针”或液相合成探针后由点阵器有规律地点样于固相支持物表面，然后将要研究的目的材料中的DNA、RNA或cDNA用同位素或荧光物质标记后，与固相支持物表面的探针进行杂交，通过放射自显影或荧光共聚焦显微镜扫描，利用计算机对每一个探针上的杂交信号作检测、分析，从而反映所用材料中大量基因的信息。,3.5.4 ELISA方法,ELISA检测蛋白质具有灵敏性高、特异性强、定量检测等优点。ELISA检测转基因成分主要是检测转入的外源结构基因表达的蛋白，如抗草甘膦Roundup Ready大豆、抗草甘膦油菜中CP4 EPSPS编码的5-莽草酸-3-磷酸合成酶等。

27、对于商业化转基因作物原料的检测，采用ELISA方法不仅能得出定性结果而且能得出定量结果。缺点：由于ELISA只能检测外源目的蛋白和一些选择标记基因表达的蛋白质，检测覆盖率低；由于检测极限问题，应用范围不如PCR方法广泛；由于蛋白质易变性，ELISA不能检测高温加工或深加工产品中的转基因成分。,3.5.5 PCR-ELISA方法,将PCR高灵敏性和高效性与ELISA的高准确性相结合，对靶基因进行PCR扩增，再用ELISA方法对PCR产物进行检测。本方法应用于转基因成分的检测，不仅能检测目的基因，也能检测筛选基因如CaMV 35S启动子、NOS终止子和NPT等基因，灵敏度达到0.1，且适用于批量检

28、测。,PCR-ELISA方法是以地高辛标记的特异性探针诱捕PCR产物，在合适条件下杂交，再用碱性磷酸酯酶标记的亲和素进行ELISA反应，既适合于定性筛选又能进行半定量分析。其特异性和敏感性比常规PCR方法结合电泳检测明显提高，且不使用强诱变剂致癌物质溴化乙锭。但检测步骤的ELISA比电泳方法繁琐且价格昂贵。,转基因检测方法小结：1.鉴定食品中有无转基因成分的方法（1）利用转入目的基因所表达的特殊性状鉴定转基因食品，如富含-胡萝卜素的转基因“金色水稻”，低糖高甜玉米等。（2）针对目前蛋白质的鉴定方法，包括ELISA、层析、双向电泳及免疫印迹方法等。（3）针对转基因食品共有DNA成分的检测方法。,

29、2.鉴定食品中转基因成分性质的方法 对于某一特定食品原料或未深加工的食品有以下方法：（1）通过一系列的ELISA，检测已知的转基因蛋白质产物，以确定其中含何种转基因成分；（2）多重PCR技术能同时检测多个已知目的基因。,3.测定食品中转基因成分含量的方法（1）ELISA方法 可对其中的转基因蛋白产物进行半定量。通过测定一系列梯度含量GMF标准品的酶反应OD值，绘制标准曲线后，即可通过测定食品样品中的转基因蛋白产物酶反应OD值进行定量。目前已有商业化的GMF ELISA检测试剂。（2）PCR技术 目前GMF的定量仍基于此法。其测定基础是食品加工过程中核酸变性程度不及蛋白质。主要步骤为：运用化学手段对DNA提取；设计并合成引物；进行PCR扩增；克隆并筛选鉴定PCR产物；DNA序列分析。（3）DNA芯片技术,