单底物酶促反应课件.ppt
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1、第一节 动力学方程推导,酶反应的基本动力学关系,是指酶反应速度与酶和底物间的动力学关系。因为酶和底物是构成酶反应系统最基本的因素,它们决定酶反应的基本性质、酶反应的速度规律,而其他各种因素也正是通过它们产生影响的;而且,这种动力学关系是整个酶反应动力学的基础。描写这种基本动力学关系的是米氏方程(Michaelis-Menten equation)。,v=vmaxS/(Km+S),酶促反应速度的测定与酶的活力单位,1、测定酶促反应的速度必需测初速度2、酶活力,3、酶活力的表示方法4、酶活力测定方法:终点法 动力学法,检测酶含量及存在,很难直接用酶的“量”(质量、体积、浓度)来表示,而常用酶催化某
2、一特定反应的能力来表示酶量,即用酶的活力表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活力,酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。,酶活力测定方法,终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应,再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。动力学法:连续测定反应过程中产物底物或辅酶的变化量,直接测定出酶反应的初速度。,酶活力的表示方法,活力单位(active unit)习惯单位(U):底物(或产物)变化量/单位时间 国际单位(IU):1moL变化量/分钟 Katal(Kat):1moL变化量/秒,转换系数(Kcat)底物(moL)/秒每个酶分子,比活力(specific activity),各种
3、因素对酶反应速度的影响,2、底物浓度3、pH(最适 pH的概念)4、温度(最适温度的概念)5、激活剂6、抑制剂,1、酶浓度,当S足够过量,其它条件固定且无不利因素时,v=kE,底物浓度对酶反应速度的影响,酶反应速度与底物浓度的关系曲线(MichaelisMenten曲线)米氏方程的提出及推导米氏常数的意义米氏常数的测定,单分子酶促反应的米氏方程及Km,推导原则:从酶被底物饱和的现象出发,按照“稳态平 衡”假说的设想进行推导。,米氏方程:,米氏常数:,酶反应速度与底物浓度的关系曲线,米氏方程的推导,令:,将(4)代入(3),则:,ES生成速度:,,ES分解速度:,即:,则:,由于酶促反应速度由E
4、S决定,即,将(2)代入(1)得:,(3),当酶反应体系处于恒态时:,当Et=ES时,,第二节 米氏方程的讨论,一、米氏方程的特性二、米氏方程中v和S的关系 当vVmax时,v与S无关,只和E0成正比,这时表明酶的活性部分已全部被底物占据。当v0.5Vmax时,表示活性部位有一半被占据。当一个酶的Km已知,则任何底物浓度下酶活性部位被占据的分数:,称为该酶促反应的相对速度。,米氏方程所作曲线的曲度,不随Km和Vmax的变化而变化。所以任何酶只要服从米氏方程。则到达任何两个Vmax分数的对应底物浓度之比为一常数。例如:,S0.9=9 Km,同理S0.1=1/9 Km,所以:S0.9/S0.1 9
5、 Km/1/9 Km 81,即达90 Vmax与达10 Vmax所需底物浓度之比总是81。同样也可得到达70 Vmax与达10 Vmax所需底物浓度之比总是21。在酶促反应初速度区即在一级速度区,由于SKm,v=Vmax S/Km=k S。从这个方程可知,一级速度常数k=Vmax/Km。,k的物理意义:底物在单位时间转变成产物的量。例如k=0.02min-1,就意味着底物在一分钟内会有2转变成产物;若k2.3min-10.0383sec-1,那就意味着每秒钟有3.83的底物变成产物。要测定任一时间范围内底物的消耗量或产物的生成量,可用一级速度方程积分。得:,lgS=-kt/2.3+lgSt,第
6、三节 实验数据的处理分析酶促反应速度的作图法,一、Lineweaver-Burk法(双倒数作图法),将实验所得的一些初速度数据v和S取倒数,得各种1/v和1/S,将1/v对1/S作图,得一直线。该直线纵截距1/Vmax,斜率Km/Vmax,横截距-1/Km。应用双倒数作图法处理实验数据求Km和Vmax等动力学常数比较方便,也是最广泛应用的一种方法,但欲要获得较准确的结果,实验时必须注意底物浓度范围,一般所选底物浓度需在Km附近。,1.下图是根据S在0.332.0Km范围时的实验结果而作的双倒数图,从此图可准确地测量出-1/Km和1/Vmax等。,S在0.332.0 Km的范围的实验结果而作出的
7、双倒数图。,2.如果所选底物浓度比Km大得多,则所得双倒数图的直线基本上是水平的。这种情况虽可测得1/Vmax,但由于直线斜率近乎零,-1/Km则难以测得。,S在3.320 Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。,3.如果S比Km小得多,则所作双倒数图的直线与两轴的交点都接近原点,使-1/Km 和1/Vmax,都难以测准。,S在0.033 0.2Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。,二、其它线性作图法1.Hanes-Woolf作图法即把米氏方程重排成线性方程,2.Woolf-Augustinsson-Hofstee作图法将米氏方程重排为线性方程:,3.Eadie-Scatchard作图法将米
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